DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams
分子标记 遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。 一、分子标记的概念 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。 二、分子标记的特点 理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。 目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。 三、分子标记的分类 分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。基于PCR技术的分子标记技术又可分为基于随机引物的PCR分子标记技术（或叫非特异PCR分子标记技术）和基于特异引物的PCR分子标记技术（或叫特异PCR分子标记技术）。随着分子标记技术的不断发展，许多新兴分子标记技术的出现，人们又根据分子标记的基因组来源将分子标记技术分为随机DNA分子标记（Random DNA Markers，RDM）、目的基因分子标记（Gene Targeted Markers，GTM）和功能性分子标记(Functional Markers，FM)。 1、限制性片段长度多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由Grodzicker等人于1974年基于DNA被限制性内切酶酶切后形成特定大小的片段。其优点在于：1、广泛存在；2、共显性，可区分纯合与杂合；3、结果稳定可靠，重复性好。正是有了这些优点，RFLP作为最早出现的分子标记方式，曾被广泛应用。但由于其在使用时需要用放射性同位素标记、酶切时对DNA质量要求高、标记的多态性变异程度偏低等原因，使得RFLP很快就被新的分子标记所替代。 2、随机扩增多态性DNA标记 随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以基因组DNA 为模板，以人工合成的随机引物，通过PCR 扩增反映扩增片段的DNA片段导入、缺失以及引物结合位点上的碱基突变。RAPD只需合成一套引物，就可可用于不同生物基因组的分析；RAPD技术简便易行，省力省时，并且检测灵敏方便；RAPD分析所需样品DNA量极
第八章分子标记及其应用 1)分子标记的种类与特点 1. 遗传标记的种类与特点 遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。Minisatellites：小卫星序列 遗传标记的种类与特点 1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。 2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。 3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。 4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。 2. DNA分子标记 DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。 2.1 分子标记的优点 1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限； 2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制; 3）多态性高，自然存在，无须专门创造； 4）表现为“中性”，即不影响性状的表达； 5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。 2.2 分子标记的类型 分三大类: 1)基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性 2)基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、
SCAR、STS等 3)基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等 第三节分子标记的应用 1. RFLP标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。 基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA 对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。关键因素： 限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。 探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。 RFLP标记的优缺点 优点： 1）共显性； 2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座； 缺点： 1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针； 2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。 2. RAPD 标记 RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。 基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitary primer （8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。
第八章分子标记及其应用 1) 分子标记的种类与特点 1. 遗传标记的种类与特点 遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。Minisatellites：小卫星序列 遗传标记的种类与特点 1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。 2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。 3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。 4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。 2. DNA分子标记 DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。 2.1 分子标记的优点 1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限； 2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制; 3）多态性高，自然存在，无须专门创造； 4）表现为“中性”，即不影响性状的表达； 5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。 2.2 分子标记的类型 分三大类: 1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性
2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、 SSR、ISSR、 SCAR、STS等 3) 基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等 第三节分子标记的应用 1. RFLP标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。 基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。 关键因素： 限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。 RFLP标记的优缺点 优点： 1）共显性； 2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座； 缺点： 1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针； 2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。 2. RAPD 标记 RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。 基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitary