蛋白电泳（制胶、SDS -PAGE 电泳）
实验材料：
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker 、SDS-PAGE Loading Buffer （还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材：
蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml 离心管、5ml 移液器、微量移液器、1.5ml 离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液：
● 配制10%APS 溶液：-20度保存
0.5g APS + 5ml 蒸馏水、2.5g APS + 25ml 蒸馏水
● 配制200 ml 电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS （ph8.3,10×）
20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ● 配制1 ml loading buffer ：
200 ul 5×loading buffer +800 ul 蒸馏水 实验步骤： 一．制胶：
1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。
3. 配制
10%分离胶：
将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS 和TEMED ，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟至
1小时。
5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。
6.配制5%浓缩胶：
7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
注意：灌胶速度要快，防止凝胶。
8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。
9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。
二．SDS-PAGE电泳:
1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。
2. 制备样品：
1）蛋白样品：
根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。
蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。
制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
4. 电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。
一、考马斯亮蓝染色
注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行western blot检测。
1. 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为
宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；
2. 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；
3. 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。
4. 观察拍照。
Western Blot
溶液配制：
●配制500 ml 1×TBST溶液：
50 ml TBST（ph8.3,10×）+ 450 ml 蒸馏水
●配制100 ml 5%牛奶封闭液：4度保存
5克脱脂奶粉+ 100 ml 1×TBST
●配制100 ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044 Tris-Glycine（ph8.3,10×）
10 ml Tris-Glycine + 20 ml 甲醇+ 70 ml 蒸馏水（4度保存）
一．转膜及染色
实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂、水平摇床
实验仪器、耗材：转膜仪
实验步骤：
1. 电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。
2. 用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。
3. 转膜：（半干转）
1）将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底部。滴加转膜液润湿。
2）将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。
3）将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。
4）再将3层滤纸平铺于膜上，赶平。
5）盖好转膜槽上盖，压紧。插上电极，50mA/膜，转膜1小时。
转膜：（湿转）
150mA/膜，转膜1.5小时
4. 丽春红染色
1）将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。
2）蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。
3）再次用蒸馏水漂洗，去除染料。
二．封闭
实验材料：5%脱脂奶封闭液
实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时
三．抗体检测：检测β-actin，分子量43KDa
实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST 实验步骤：
1. 在6 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl抗β-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。
2. 将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4℃ 孵育过夜。
3. TBST漂洗7次，每次5分钟。
4. 在10 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:5000）。
5. 将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。
6. TBST漂洗7次，每次5分钟。
四．显影
实验材料：DAB显色液
实验步骤：
1. 将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。
2. 将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。
3. 将膜放入蒸馏水中，终止反应。