UL timate3000高效液相色谱仪确认方案
编号：VP-AI-2017001
*生物科技股份有限公司
确认方案审批表
验证项目名称：UL timate3000液相色谱仪确认方案
编号：V P-A I-2017001
起草人：日期：年月日审核部门/职务审核人日期备注审核
Q C/主管
Q A/主管
批准人：日期：年月日执行日期：年月日
确认小组人员名单：
小组职务姓名所在部门职务组长质管部经理
组员化验室主管
组员QA 主管
组员化验室QC
目录
1.概述 (4)
2.确认目的 (4)
3.确认范围 (4)
4.确认小组人员及职责 (4)
5.验证相关文件依据 (5)
6.验证项目和时间安排 (5)
7. 安装确认 (5)
8 运行确认 (7)
9.性能确认 (13)
10. 确认过程中的偏差及处理措施 (14)
11．再确认周期 (14)
12.确认结果评定与结论 (14)
13.附件 (14)
1.概述
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
2.确认目的：
按照GMP的要求，对该仪器进行安装确认、运行确认、性能确认，以确定仪器是否有具有良好的检测性能，能否满足日常分析测试工作的需要。
3.确认范围：
本确认方案适用于本公司的UL timate3000高效液相色谱仪的确认。
4.确认小组人员及职责
4.1 确认小组
验证分工所在部门职务
组长质量部经理
组员质量部QC主管
组员质量部 QC
组员质量部QA主管
4.2 验证小组职责
组长：负责验证管理的日常工作和验证的协调，验证方案和报告的批准。
组员：QC，化验室。起草验证方案和验证报告，并参与实施验证。
组员：QC主管，化验室。审核验证方案和报告，协调与本次验证相关的化验室工作。
组员：QA主管，质量保证部。负责审核验证方案和验证报告，如果验证中出现偏差，应对偏差进行调查。
5.验证相关文件依据
参考文献药品生产质量管理规范（2010年版）
药品生产验证指南（2003年版）
药品生产质量管理规范实施指南
液相色谱仪国标GBT26792-2011
液相色谱仪JJG 705-2002
6.验证项目和时间安排
计划于年月日 - 月日对UL timate3000高效液相色谱仪进行确认，内容严格按照本确认方案，检查UL timate3000高效液相色谱仪其安装确认、运行确认、性能确认达到规定的标准要求。确认开始前所有参与人员应经过本方案的培训，培训记录见附件1。
7.安装确认
7.1.概述
UL timate3000液相色谱仪由赛默飞公司提供，安装于质量控制室的仪器室，用于成品，原料，中间样品的含量和有关物质检测。
安装确认目的：证实所供应的设备规格符合要求,设备所应备有的技术资料齐全。开箱验收应合格，并确认安装条件（或场所）及整个安装过程符合设计要求。
7.2.安装确认内容
7.2.1.基本资料检查：检查是否有各种必需的书面资料，如表1。
表1 资料检查
确认项目有无备注
采购定单
使用说明书
设备的合格证书
装箱单
保修卡
7.2.2.设备所需外部环境确认
目的：确认设备的安装是否符合原设计的条件，如表2。
表2 外部环境确认
确认项目合格要求是否符合要求备注温度5-40℃□是□否
相对湿度≤85%□是□否
地面平滑、不易起尘□是□否
环境无腐蚀性气体□是□否
7.2.3.设备型号确认
目的：确认设备各部件的型号，保证其与订单和装箱单所描述的一致，如表3。
表3 设备型号确认
部件设备型号序列号是否一致
输液泵□是□否自动进样器□是□否柱温箱□是□否紫外检测器□是□否7.2.4.设备外观确认
目的：确认设备外观符合标准要求，如表4。
表4 设备外观确认
确认项目合格要求是否符合要求
设备外表面仪器外表应光洁平整、字迹清晰，表面涂覆
色泽均匀，不应有明显划伤、露底、裂纹、
气泡等现象
□是□否
各按键、旋钮、开关各调节旋钮、按键、开关等工作正常，无松
动；指示、显示清晰完整
□是□否
7.2.5.公用设施确认
目的：确认公用设施，使其满足设计要求，如表4。
表5 公用设施确认
项目设计要求确认结果备注
电压220V□是□否
电源适配三孔插座□是□否
7.2.6.软件版本确认
目的：确认安装的软件与采购软件版本是相同的。
软件版本与采购版本□相同□不相同
7.2.7.硬件环境与安装确认
目的：根据生产商硬件和系统设计规格标准，确认仪器和控制器工作区域符合要求，如表6。
表6 硬件环境与安装确认
序号描述是否符合要求1仪器放在水平的工作台上，计算机在仪器旁边。□是□否2仪器各部件之间正确连接。□是□否3温度在10-30℃，湿度在20-85%之间。□是□否4室内无强电磁干扰源及有害有毒气体。□是□否5排风口和进风口对仪器和计算机无污染。□是□否7.2.8.部件清单
目的：确认仪器日常维护和操作所需要的消耗品和备用品，如表6。
表7 部件清单
部件名称数量存放地点备注
7.2.9.仪器、仪表、衡器的确认
目的：确认仪器、仪表、衡器经过校验，并在校验期内。如表8。
表8 仪器、仪表、衡器确认记录
仪器仪表衡器名
称仪器仪表衡器编
号
校验周期校验证书编号有效期至
7.2.10.维修服务确认
目的：确认仪器出现故障后能及时的处理，不影响操作。
每本操作手册上都有简单的维护方法，经过仪器培训的操作人员可以根据说明书进行简单的维修和零部件的更换。
如果有其它比较大的问题，用户不能解决的，可以电话通知厂家的维修工程师。
维修电话：
7.3.安装确认结论及批准
结论：
检查人：日期：批准人：日期：8.运行确认：
8.1.测试项目和认可标准
8.2.运行确认所需的材料
8.2.1.玻璃仪器设备计量玻璃仪器需彻底清洗并经检定，一般玻璃仪器要保
证洁净。
8.2.2.试剂、标准溶液
a) 萘（AR）
b) 甲醇（色谱纯）
c) 丙酮（AR）
d) 去离子水:电导率不大于0.1μs/cm
e) 紫外波长标准物质
8.1.2.3 其它辅助设备
a) 玻璃仪器：经检定、其它玻璃器皿
b) C18色谱柱
c) 铂电阻温度计（Pt100）准确度≤0.3℃
d) 秒表分度值不大于0.1秒
e) 进样器20μl
f) 分析天平
g) 游标卡尺 15cm/0.02mm
8.3.运行确认的实施
8.3.1.输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定
将仪器的输液系统，进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL/min，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表7设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算 SS和 SR。
表7
流量设定值（mL/min）0.5 1.0 2.0测量次数333
流动相收集时间（min）1055
SS5%3%2%接受标准
SR3%2%2%
SS＝(Fm－FS)/FS×100% (1)
SR＝(Fmax－Fmin)/F×100% (2)
式中：SS——流量设定值误差(％)；
SR——流量稳定性误差(％)；
Fm＝(W2－W1)/ （ρ·t），流量实测值(mL/min)；
W2——容量瓶＋流动相的重量(g)；
W1——容量瓶的重量(g)；
FS——流量设定值(mL/min)；
ρ——实验温度下流动相的密度(g/cm3)；
t——收集流动相的时间(min)；
Fmax——同一组测量中流量最大值(mL/min)；
Fmin——同一组测量中流量最小值(mL/min)；
F——同一组测量值的算术平均值(mL/min)。
输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定记录。见附件2。
8.3.2.梯度误差的检定
由梯度控制装置设置阶梯式的梯度洗脱程序，A溶剂为纯水，C溶剂为含0.1%丙
酮的水溶液，C经由5个阶梯从0变到100%。将输液泵和检测器连接（不接色谱柱），开机以后以A溶剂冲洗系统，基线平稳后开始执行梯度程序，画出梯度变化曲线。求出A，C溶剂不同比例时的输出信号值（或记录仪读数），重复测量2次，计算平均值。从C溶剂的含量及对应的输出信号值（或记录仪读数），按式
（3）计算梯度误差Gci，取Gci 最大者作为仪器梯度误差，应不超过±3%。波
长为254nm，检定记录见附件3。
梯度洗脱表
时间A通道：超纯水C通道：0.1%丙酮水溶液
0.00min100%0%
3.00min100%0%
3.0180%20%
13.00min80%20%
13.01min60%40%
23.00min60%40%
23.01min40%60%
33.00min40%60%
33.01min 20%80%
43.00min 20%80%43.01min 0%100%53.00min 0%100%53.01min 100%0%58min 100%0%
Gci =（ –）/ ×100%—
Li
— Lm —
Lm 式中：Gci —— 第i 段梯度误差 ( % ) ； —— 第i 段输出信号值（或记录仪读数）增量平均值；— Li —— 各段输出信号（或记录仪读数）增量平均值的平均值。
—
Lm 8.3.3.前后进样带入量的确认
方法：选用4.6mm×250mm 的C18或C8柱，流动相：甲醇：水=75：25，检测器254nm ，流速1.0ml/min,进样量5ul ，使用下列商业标准品进样。
标准溶液(a):咖啡因溶液100ug/ml 标准溶液(b):咖啡因溶液1ug/ml 空白溶液:水
备注：标准溶液的分析证书必须作为附件以证明标准溶液是适用的。
进以下序列样：
——咖啡因溶液100ug/ml，1针
——水，1针
——咖啡因溶液1ug/ml，1针
记录色谱并对咖啡因峰进行积分。
可接受标准
空白溶液中相应的峰面积百分比不超过标准溶液(a)中咖啡因峰面积的0.1%；标准溶液(b)中咖啡因的峰面积是标准溶液(a)中咖啡因峰面积的0.9%-1.1%。
记录见附件4.
8.3.4.柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定
将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择20℃和50℃进行检定。按仪器说明书
操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后每隔
10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。平均值与设定值之差为
ΔTS，7次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性TC。
柱温箱柱箱温度设定值误差ΔTS和控温稳定性TC的检定原始记录见附件5。
8.3.5.检测器的检定
a.检测器基线噪声和基线漂移的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设
定为254nm,开机预热，待仪器稳定后（约60min）记录基线60min，从30min
内基线上读出噪音值；从60min基线上读出基线漂移值。
接受标准：基线噪音应不超过5×10-4AU；基线漂移应不超过5×10-
3AU/h。
记录见附件6。
b.检测器最小检测浓度的测定
取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,开机预热，待仪器稳定后取1×10-7g/ml的萘/甲醇溶液进样20μl，记
录色谱图，由色谱峰峰高和基线噪声峰峰高计算最小检测浓度CL。公式如下：CL=(2×Nd×C)/H
式中 CL——最小检测浓度，g/ml；
Nd——基线噪声峰峰高，mm；
C ——标准溶液浓度，g/ml；
H ——标准溶液峰峰高，mm。
接受标准：应不超过1×10-7g/ml
检测器的最小检测浓度原始记录。见附件7。
8.4.运行确认结论及批准
结论：
检查人：日期：批准人：日期：9.性能确认
9.1.取C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm,柱温设定为40℃。开机预热待仪器稳定后取0.1mg/ml的萘/甲醇溶液进样20μl，连续进样6次，记录其峰面积和保留时间，以保留时间计算其
定性测量重复性误差，以峰面积计算其定量测定重复性误差，以保留时间计算其定性重复性误差。接受标准：定量重复性RSD≤1.0%，定性重复性≤0.5%。
性能确认记录见附件8
9.2.性能确认结论及批准
结论：
检查人：日期：批准人：日期：10.确认过程中的偏差及处理措施：见附件9。
11.再确认周期：
11.1.正常情况下每年做一次确认。
11.2.发生了影响仪器性能的部件改变或维修后，应进行再验证。
12.确认结果评定与结论：见附件10.
13.附件
附件1：人员培训、参与情况确认记录
附件2：输液泵确认记录
附件3：梯度误差检定记录
附件4：前后进样带入量确认记录
附件5：柱温箱确认记录
附件6：基线噪声、基线漂移测定记录
附件7：最小检测浓度测定记录
附件8：性能确认结果记录
附件9：偏差处理审批表
附件10：验证结果综合评价表
附件1
人员培训、参与情况确认记录日期年月日课时 1
授课方式面授授课地点会议室授课人
部门岗位培训人
质量部QC主管
质量部QA人员
质量部QC人员
确认标准确认结果
确认所有参与执行本确认的人员已经得到
培训，并在培训记录中签字。
确认结论：
备注或附件：
检查人/日期
复核人/日期
附件2
输液泵确认记录
流量（ml/min
）收集时间
min
次
数
W1W2W2-W1
接受标准
S S S R 1
2
0.510
3SS≤5% SR≤3%
1
2 1.05
3SS≤3% SR≤2%
1
2 2.05
3SS≤2% SR≤2%
结果评定：
检定人日 期复核人
日 期
附件3
梯度误差确认记录
次数第一阶段读数
第二阶段读数
第三阶段读数
第四阶段读数
第五阶段读数
—
Lm 12Li — Li -— Li — Lm Gci
可接受标准：Gci ≤±3%结果评定：
检定人日期
复核人日期
附件4
前后进样带入量确认记录
附件5
柱温箱设定值误差记录
设定温度实测温度平均值ΔT S T C结果1
2
3
4
20℃
5
6
7
1
2
3
4
50℃
5
6
7
接受标准：ΔT S≤±3℃，T C≤±1℃
结果评定：
复核人日期
附件6
基线噪声、基线漂移值记录
30min基线噪声值接受标准60min基线漂移值接受标准
≤ 20uv≤ 200uv/h 结果评定：
检定人日期
复核人日期
附件7
最小检测浓度测定
萘的称样
量稀释倍数
萘的色谱
峰高
平均峰高噪声
最小检测
浓度
结果评定：
高效液相色谱习题 一:选择题 1、在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径就是(D ) A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 2、在液相色谱中,为了改变柱子的选择性,可以进下列那种操作(C ) A、改变固定液的种类 B、改变栽气与固定液的种类 C、改变色谱柱温 D、改变固定液的种类与色谱柱温 3、在液相色谱中,范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略( B ) A、涡流扩散项 B、分子扩散项 C、流动区域的流动相传质阻力 D、停滞区域的流动相传质阻力 4、在高固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用 (A ) A、适当提高柱温 B、增加固定液含量 C、增大载体颗粒直径 D、增加柱长 5、在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置就是 ( B ) A、高压泵 B、梯度淋洗 C、贮液器 D、加温 7、在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？( C ) A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相与固定相 D、组分与组分 8、在液相色谱中, 通用型检测器就是 (A ) A、示差折光检测器 B、极谱检测器 C、荧光检测器 D、电化学检测器 9、在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱就是 (A ) A、直形填充柱 B、毛细管柱 C、Ｕ形柱 D、螺旋形柱 10、纸色谱的分离原理, 与下列哪种方法相似？ ( B) A、毛细管扩散作用 B、萃取分离 C、液-液离子交换 D、液-固吸附 二:简答题 1、在液相色谱中,色谱柱能在室温下工作,不需恒温的原因就是什么？ 答:由于组分在液-液两相的分配系数随温度的变化较小,因此液相色谱柱不需恒温
高效液相色谱习题 一、填空题 1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。 2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。 3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。 4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、 液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。 5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用 化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。 6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。反之称为 反相色谱。 7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。 8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、 荧光检测器等等。 9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。 二、判断题
√、√、?、?、√、√、?、√、?、√、?、√、√、?、√、?、?、√、?、√、√、?、?、?、?、?、?、?、√、? 1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。 （√） 2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。（√） 8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。（×）10．反相分配色谱适于非极性化合物的分离。（√）11．高效液相色谱法采用梯度洗脱，是为了改变被测组分的保留值，提高分离度（×）12．液相色谱柱一般采用不锈钢柱、玻璃填充柱。（×） 13．液相色谱固定相通常为粒度5～10μm。（×） 14．示差折光检测器是属于通用型检测器，适于梯度淋洗色谱。（×） 15．离子交换色谱主要选用有机物作流动相。（×） 16．体积排阻色谱所用的溶剂应与凝胶相似，主要是防止溶剂吸附。（×） 17．在液一液色谱中，为改善分离效果，可采用梯度洗脱。（√）
高效液相色谱--仪器分析实验教案仪器分析实验课程教案 实验名称:高效液相色谱混合物的定量和定性测定 验证性实验类型教学时数 7 每组人数 8 一、实验目的及要求: 1(掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法; 2(了解高效液相色谱的构造、原理; 3(学习高效液相色谱仪的操作。 教学重点: 1、溶液配制的条件 2、色谱工作站参数的设定。 3、定量定性分析方法 教学难点: (1)、学习高效液相色谱的使用方法、了解该仪器的结构; (2)、定量定性分析方法 二、实验原理 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。 三、主要仪器和试剂
主要仪器:安捷伦1260液相色谱仪，配有紫外检测器，Phenomenex ODS 柱]; 1 自动进样器。 试剂:色谱纯甲苯、苯、丙酮、甲醇、超纯水; 未知样品1、2、3、4。 教学内容及过程 (一)检查实验预习报告 (二)上次实验存在的问题 (三)高效液相色谱操作 (四)实验内容及步骤 A、溶液配制 1 配制标准系列溶液 三组分混标液:每mL溶液分别含5 uL苯、甲苯和丙酮。 分别准确移取0、2.50、5.00、10.00和20.00 uL甲苯容易溶于1.00mL甲醇中。 2 流动相的配制、过滤和除气。 标准苯测试液。 未知样品1号、2号、3号和4号。 B、上机测定 1 更换流动相。 2 按操作规定开动仪器，排气后让色谱柱平衡(流动性为80%甲醇，速度1.0 mL/min)。 3 设置色谱工作站参数。 Agilent HPLC仪 色谱柱: 流动相:甲醇:水=8:2
仪器分析高效液相色谱 试题及答案 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
高效液相色谱习题 一：选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2.在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进下列那种操作（C ） A. 改变固定液的种类 B.改变栽气和固定液的种类 C. 改变色谱柱温 D.改变固定液的种类和色谱柱温 3.在液相色谱中，范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略（ B ） A.涡流扩散项 B.分子扩散项 C.流动区域的流动相传质阻力 D.停滞区域的流动相传质阻力 4. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用 (A ) A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 5. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是 ( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 7. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？（ C ） A. 组分与流动相 B. 组分与固定相 C. 组分与流动相和固定相 D. 组分与组分 8. 在液相色谱中, 通用型检测器是 (A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器
9. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是 (A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 10. 纸色谱的分离原理, 与下列哪种方法相似？ ( B) A.毛细管扩散作用 B.萃取分离 C.液-液离子交换 D.液-固吸附 二：简答题 1. 在液相色谱中，色谱柱能在室温下工作，不需恒温的原因是什么？ 答：由于组分在液-液两相的分配系数随温度的变化较小，因此液相色谱柱不需恒温 三：计算题 1. 一液体混合物中，含有苯、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯。用气相色谱法，以热导池为检测器进行定量，苯的峰面积为 cm2。甲苯为 cm2，邻二甲苯为 cm2，对二甲苯为 cm2。求各组分的百分含量？（重量校正因子：苯，甲苯，邻二甲苯．对二甲苯）。 1. A苯= A甲苯= A邻= A对= 归一化法：f苯= f甲苯= f邻= f对= Y= f苯A苯 + f甲苯A甲苯 + f邻A邻 + f对A对 =× + × + × + × = + + + = W苯=×100%=% W甲苯=×100%=% W邻=×100%=% W对=×100%=%