CHIN ESE J OU RNAL OF ANA TOM Y Vol.32No.22009解剖学杂志 2009年第32卷第2期凋亡相关蛋白B cl22及B ax在糖尿病大鼠下颌下腺内的表达
第1作者E2mail:wuxueping2003019@https://www.doczj.com/doc/2c16238894.html, 收稿日期:2008207214;修回日期:2008210227吴学平1 彭彦霄1 伍雪芳1 贾雪梅2
(1皖南医学院组织学与胚胎学教研室,芜湖 241000;2安徽医科大学形态学中心实验室,合肥 230032)
摘要 目的:观察糖尿病大鼠下颌下腺内凋亡相关蛋白Bcl22和Bax表达变化。方法:SD雄性大鼠用链脲佐菌素复制糖尿病动物模型,H2E染色观察下颌下腺形态学变化,免疫组织化学SABC技术检测Bcl22及Bax蛋白表达变化。结果:糖尿病组大鼠下颌下腺组织萎缩,间质纤维增生。与对照组比较,糖尿病组大鼠下颌下腺导管上皮细胞Bcl22表达下降,Bax表达显著增加。结论:Bcl22及Bax表达在糖尿病病理变化过程中出现了一定的变化规律。
关键词 糖尿病;Bcl22;Bax;下颌下腺;大鼠
Expression of apoptosis2related proteins B cl22and B ax in the
submandibular gland of diabetic rat
Wu Xueping1,Peng Yanxiao1,Wu Xuefang1,Jia Xuemei2
(11De partment of Histology and Embryolog y,W annan Medical College,W uhu 241000;
21Morpholog y Center L aboratory,A nhui Medical Universit y,Hef ei 230032,China)
Abstract Obj ective:To investigate the expression changes of apoptosis2related proteins Bcl22and Bax in the submandibular gland of diabetic rats.Met hods:A Sprague2Dawley diabetic rats model was established after injection of streptozotocin.The submandibular glands were observed using H2E staining and immunohistochemistry methods.Results:In the diabetic rats, the submandibular gland atrophied and showed the significant proliferating interstitial https://www.doczj.com/doc/2c16238894.html,pared with the control group,Bcl22immunopositive cells in the submandibular gland showed a descending tendency with the progression of the dis2 ease.Bax immunopositive cells were more significantly increased in diabetic rat.Conclusion:Bcl22and Bax expression is of a certain regulation in the pathogensis of diabetes mellitus.
K ey w ords diabetes mellitus;Bcl22;Bax;submandibular gland;rat
近年研究表明,由于各种凋亡调控机制失衡,激发胰岛β细胞凋亡,导致胰岛分泌功能丧失,且由糖尿病引起的中枢神经[1]、肾[2]等并发症亦有Bcl22凋亡基因家族的参与,因此细胞凋亡成为Ⅰ型糖尿病的发病机制之一。众所周知,糖尿病病理可导致下颌下腺组织明显萎缩退化,往往伴随严重的口渴症状。关于大鼠下颌下腺内凋亡相关因子Bcl22和Bax表达变化及其与糖尿病病理病程间有何关系,目前尚未见相关报道。故本实验拟通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制糖尿病大鼠动物模型,采用H2E染色和免疫组织化学SAB C方法,对糖尿病大鼠下颌下腺组织结构及Bcl22和Bax表达变化进行观察,以期为深入探讨Bcl22和Bax在Ⅰ型糖尿病发病机制中的作用及意义提供形态学依据。
1 材料和方法
111 复制动物模型
取体质量为(195183±18100)g雄性SD大鼠24只,将其随机分为实验组12只(4周、12周各6只)、对照组12只。实验组和治疗组按65mg/kg腹腔一次注射2%STZ(溶于p H414,011mol/L柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液)。各组动物分笼饲养,均不限制饮食饮水。112 标本制备
分别于成模4周和12周后,将SD大鼠称量体质量,腹腔注射戊巴比妥麻醉,剖开腹腔,迅速从下腔静脉抽取5ml血液送检血糖,再打开胸腔,从左心室插管至升主动脉,同时剪开右心耳。先以生理盐水快速冲洗,再用4%多聚甲醛进行灌注固定。灌注完毕后,取下颌下腺组织。
113 血糖检测方法
采用快速血糖测试仪(美国强生公司)进行血糖浓度检测。
114 H2E染色
切片经脱蜡、染色、脱水、透明和封片,进行组织学观察。
115 免疫组织化学显色
一抗为兔抗大鼠Bcl22和Bax抗血清,稀释度为1∶100,37℃孵育1h后,置4℃过夜;二抗为即用型
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生物素化羊抗兔Ig G血清,37℃孵育1h;即用型SABC复合物,37℃孵育1h。试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。标本用DAB显色后,脱水、透明和封片。
116 统计学处理
所得数据经SPSS1110软件进行处理;所得结果均用x -±s表示。组间差异采用成组t检验。
2 结果
211 体质量值和血糖值
与对照组大鼠比较,实验组大鼠体质量明显降低,血糖明显升高,差异有统计学意义(P<0101)(表1)。
表1 各组大鼠体质量、血糖检测结果的比较(n=6,x -±s)
T ab1 Comp arison of body w eight and blood glucose in each group(n=6,x -±s)
Group
Body weight(g)
4weeks12weeks
Blood glucose(mmol/L)
12weeks4weeks
Control305150±34167367133±261737123±01846149±0179 Diabetes mellit us229183±55144156150±101133323131±61813327179±912833 33P<0101vs control
212 H2E染色结果
正常大鼠下颌下腺为混合性腺泡,腺泡饱满,导管包括闰管、颗粒曲管、纹状管和小叶间导管,其中颗粒曲管为啮齿类动物所特有,其粗而长,数目多,细胞为柱状,核圆形位于基底部,顶部胞质内有鲜红色分泌颗粒。而实验组大鼠4周时腺实质轻度萎缩,颗粒曲管断面数目减少,分泌颗粒减少。12周时整个腺实质萎缩,颗粒曲管数目明显减少,间质中结缔组织成份增多。与对照组比较,糖尿病组大鼠下颌下腺导管上皮细胞胞核缩小,颜色明显加深(图1)。213 Bcl22和Bax表达变化
在大鼠下颌下腺切片中,颗粒曲管、纹状管分别呈Bcl22及Bax免疫反应阳性。免疫反应产物均匀分布于导管上皮细胞胞质内,细胞核和腺泡呈阴性。对照组导管上皮细胞Bcl22免疫反应为强阳性,而Bax呈免疫反应弱阳性,糖尿病组随病程延长而Bcl22表达减弱(图2),而Bax表达增强(图3A)。与对照组比较,4周、12周糖尿病组各级导管上皮细胞内Bcl22平均光密度值降低,Bax平均光密度值升高,差异具有统计学意义(P<0101)(表2)。
表2 3组大鼠下颌下腺导管上皮细胞B cl22和B ax表达阳性细胞平均光密度值(n=6,x -±s)
T ab2 MOD of B cl22and B ax positive cells in the subm andibular gland in three groups(n=6,x -±s) Group Side Bcl22Bax Bcl22/Bax Cont rol Granular convoluted tubule012821±010*********±010*******
Striated duct s012943±010*********±010*******
4weeks diabetes mellitus Granular convoluted tubule011824±0100563011832±010********
Striated duct s011816±0100313011911±010******** 12weeks diabetes mellit us Granular convoluted tubule011473±01001833012272±010*********
Striated duct s011415±01001233012281±010********* 3P<0105;33P<0101vs control
3 讨论
本实验糖尿病动物模型由链脲佐菌素选择性破坏胰岛β细胞后复制而成,多饮多食多尿症状表现突出,血糖明显升高,为典型的Ⅰ型糖尿病。
凋亡是一种主动的、有调控的细胞死亡形式,许多基因参与了细胞凋亡的调控。Bcl22是线粒体上的一种跨膜蛋白[3],是调节细胞程序性死亡的一个重要基因,对细胞的凋亡和坏死均有抑制作用[4]。Bax与Bcl2 2具有高度同源性,具有促进细胞凋亡的作用,是典型的凋亡促进基因[5]。本实验观察到,在正常大鼠下颌下腺颗粒曲管、纹状管上皮细胞质中有大量Bcl22表达和少量Bax表达,在糖尿病组中,随着病程延长,Bcl22蛋白表达逐渐减少,Bax蛋白表达逐渐增加。与葛志华等[6]在db/db自发性糖尿病小鼠颌下腺观察的结果基本一致。本实验糖尿病大鼠高血糖维持3个月,下颌下腺组织中Bcl22表达减弱,说明高血糖可使糖尿病大鼠下颌下腺凋亡抑制因子Bcl22蛋白表达减少。因为高血糖可促使细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生,导致氧化应激增强[7],进而使Bcl22表达减少,促使凋亡。随糖尿病病程延长,下颌下腺组织中凋亡相关因子Bcl22/Bax比值增加,说明唾液腺实质发生了凋亡病变。Bcl22/Bax比值被多数学者认为是调节细胞凋亡的杠杆,细胞凋亡增加Bcl22/Bax升高;反之降低[8]。此外,长期高血糖不仅与糖尿病患者的血管并发症密切相关[122],而且还使胰岛细胞凋亡增加[9]。
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图1 大鼠下颌下腺颗粒曲管(ρ),H2E,×400。A:对照组;B:糖尿病组.
图2 大鼠下颌下腺颗粒曲管(ρ)、纹状管(↑)上皮细胞呈Bcl22免疫反应阳性,SABC,×200。A:对照组强阳性;B:糖尿病4周中等阳性;
C:糖尿病12周弱阳性.
图3 大鼠下颌下腺颗粒曲管(ρ)、纹状管(↑)上皮细胞呈Bax免疫反应阳性,SABC,×200。A:对照组弱阳性;B:糖尿病4周中等阳性;
C:糖尿病12周强阳性.
Fig1 Granular convoluted t ubule of submandibular gland(ρ),H2E,×400.A:Control group;B:Diabetes group.
Fig2 Epit helial cells of granular convoluted tubule(ρ),striated duct s(↑)showed Bcl22positive immunoreactivity,SABC,×200.
A:Strong positive immuoreactivity in control group;B:Middle positive immuoreactivity in4weeks diabetes group;C:Weak positive immuoreactivity in12weeks diabetic group,
Fig3 Epit helial cells of granular convoluted tubule(ρ),striated duct s(↑)showed Bax positive immunoreactivity,SABC,×200.A: Weakly positive immunoreactivity;B:Moderately weakly positive immunoreactivity;C:Strong positive immunoreactivity.
由于唾液腺和胰腺在胚胎发生上是来源于同一胚层,且Ⅰ型糖尿病时唾液腺具有与胰腺相同自身免疫性抗原作用的靶细胞[10],因此长期高血糖也会使下颌下腺组织发生凋亡。
本实验结果表明,下颌下腺组织中促凋亡因子Bax 随病程延长而表达增强。从而使Bcl22/Bax比值下降,促使凋亡。Bax可转移到线粒体与Bcl22结合形成异二聚体,促进线粒体释放细胞色素C,激活含半胱氨酸的天门冬氨酸特异蛋白酶(caspase),使线粒体功能丧失诱导细胞凋亡[11]。另外Bcl22表达减弱,Bax表达的增强,可促进钙离子从内质网释放,进入胞核,激活核酸内切酶,使DNA断裂,进而诱发凋亡。本实验结果同时显示,随着糖尿病进展,大鼠下颌下腺实质进行性萎缩退变,这种病变实际是细胞凋亡的具体表现。
下颌下腺是产生生物活性物质种类最多的器官之一,70%的唾液是由下颌下腺分泌的。Bcl22基因家族可能参与了糖尿病下颌下腺细胞凋亡的调控,由于凋亡导致下颌下腺合成和分泌功能减弱,造成下颌下腺功能进一步恶化,进而导致糖尿病患者出现严重的口渴症状。此外神经生长因子、表皮生长因子表达减少,从而引起神经病变、血管病变等并发症发生相关[12]。
参考文献
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(编辑:冀凯宏)
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2型糖尿病大鼠模型研究概况 【摘要】目的：综述近年来2型糖尿病(T2DM)大鼠模型的研究进展及对其优缺点进行评价和未来同类模型的展望。方法：主要对T2DM大鼠模型的建立技术和方法进行综合性评价。结果：T2DM大鼠模型目前可以分为自发性T2DM 和实验性T2DM模型,且仍有较大发展空间。结论：经过综合评价研究，认为各种建模方法均有优缺点，目前较认可的是实验性T2DM大鼠模型，因价格低廉，造模方便而广受欢迎，但仍缺乏一定的造模标准。 【关键词】2型糖尿病；动物模型；研究概况 随着经济社会的发展，人们的饮食结构、生活方式等发生了很大改变，糖尿病发病率显著上升，尤其T2DM占了较高比例，大概占了糖尿病发病率的90%。T2DM是因人体胰岛素分泌相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低继而引发糖、蛋白质、脂肪和水电解质等代谢紊乱所导致的疾病。患者典型表现为三多一少，即多饮、多食、多尿表现，同时还伴有身体消瘦、疲乏、烦躁、口渴等临床症状。 选择一些合适的动物模型进行动物试验成了我们研究糖尿病的良好途径，我们可以从中比较一些糖尿病药物的作用效果以及其药动学的特点，在临床用药上对评价某套治疗方案的可行性及预后等具有十分重要的参考意义。 目前研究的临床T2DM动物模型主要集中在大鼠上，这可能是由于大鼠作为T2DM动物模型相对较稳定且与人T2DM表现相似的优点。因此我们在下面综述近几年来国内外有关临床T2DM大鼠模型研究的情况。 总体上来说，目前临床T2DM研究的大鼠模型主要分为两类，一类是自发性T2DM大鼠模型，另一类则是实验性T2DM大鼠模型，考虑到成本及方便程度，目前以后者居多。 1 实验性T2DM大鼠模型 1.1 单纯高脂高糖引发的T2DM 在试验中，通过较长时间给予大鼠过量的高糖高脂饮食，发现能够诱导出较满意的T2DM大鼠模型，从而能为进一步研究奠定良好的基础。目前认为其机理可能是高糖高脂饲料会导致胰岛B细胞超负荷，进而使胰岛细胞发生损伤、萎缩甚至死亡，胰岛的功能因此下降，继而建立起伴胰岛素抵抗的T2DM模型。鲁瑾[1]等采用61%的高脂饮食，饲养大鼠7周后，大鼠就出现了高胰岛素血症，且形成了明显的胰岛素抵抗，是一个十分可靠的胰岛素抵抗模型。张丽锋[2]等给予W istar大鼠脂肪热比为59%的饲料, 喂养4周，均出现胰岛素抵抗，多项研究试验表明高脂饮食可以诱发产生可靠的糖尿病大鼠模型。 1.2 应用STZ药物诱导产生的大鼠模型由于高糖高脂饲料相对用时较长，且饲料成本相应较高，因此合理使用链脲菌素(STZ)是目前许多研究者所推崇的
糖化血红蛋白的临床意义 HbA1c的临床意义1 1．糖尿病长期血糖的监测；观察饮食和药物治疗的效果，特别是怀疑口服药物失效而不得不用胰岛素治疗时HbA1c有较高价值。 2．有助于对糖尿病慢性并发症的发现和预防；临床研究显示：糖尿病慢性并发症、糖尿病肾病和视网膜病变的发生与HbA1c水平密切相关，并发现HbA1c＜7％时，糖尿病发生慢性并发症的危险性很小，而一旦HbA1c﹥7％时，则发生慢性并发症的危险性显着增高。 HbA1c的临床意义2 3．用于糖尿病的辅助诊断： 大多数血糖高于正常的糖尿病患者其HbA1c增高；对空腹血糖正常而糖耐量下降的病人HbA1c也可增高。有报导HbA1c对糖尿病的诊断敏感性为85％，特异性为91％。最近Peters 回顾性研究报告HbA1c的测定与WHO的糖尿病诊断标准密切相关，且检测方便。并认为HbA1c＞7％时，一般建议采用饮食和运动治疗处理。HbA1c的临床意义3 4．用于应激性高血糖的鉴别诊断 各种应激如心肌梗塞和脑血管意外可使血糖升高，但这种高血糖、HbA1c不一定升高，若为糖尿病、HbA1c则升高。两者的鉴别对指导治疗和判断预后有一定价值。 5．? 怀孕期间HbA1c是反映糖尿病控制的一个特别有用的指标。 怀孕期间血糖控制对母婴健康极为重要。糖尿病患者怀孕期间母亲的高血糖与
胎儿的发病率、死亡率上升都有关。保持严格的血糖控制，尤其是在胚胎发生的头3个月，母亲HbA1c结果对健康胎儿的孕育极大促进作用。 总之，HbA1c数据客观，稳定性好，能反映糖尿病患者2－3月左右的糖代谢情况，同时对糖尿病并发症，尤其是早期肾病和视网膜等微血管病变有很好的临床参考价值。
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
糖化血红蛋白 糖化血红蛋白（HemoglobinA1c；HbA1c）是人体血液中葡萄糖与血红蛋白β 链 N 末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定的化合物, 全称为: 血红蛋白β 链 (血液)-N-(1- 脱氧果糖 -1- 基) 血红蛋白β 链。反映检测前 2～3 个月的平均血糖水平。 HbA1c 诊断糖尿病 HbA1c 是葡萄糖与血红蛋白结合的稳定产物，其具有以下优点： 离体样本稳定，常温可稳定 24 h； 生物学变异小，在 2.0% 以内； 无需空腹，可任意时间采血； 相对来讲不受短期生活方式改变的影响； 有国际公认的参考体系，可以监测其结果的准确性； 与糖尿病血管并发症的相关性好于血浆 (清) 葡萄糖。 所以，HbA1c 的测定能满足糖尿病防治工作的需求。 HbA1c 检测的标准化 HbA1c 的实验室测量结果准确可比，实现检测的标准化，是HbA1c 临床应用的重要前提和保障。室间质量评价 (external quality assessment，EQA) 是保证和改进实验室检验质量的重要手段。 我国 HbA1c EQA 计划于 2000 年正式开展，与国外相比，我国HbA1c 检测的标准化起步相对较晚，但进展迅速。目前已建立并运
行比较完整的 HbA1c 参考系统。我国 HbA1c 检测的整体质量已有明显提升。 但我国 HbA1c 检测的质量控制和标准化仍面临复杂的局面和挑战；临床实验室特别是基层医疗单位 HbA1c 检测的人员操作、室内质控等方面的管理亟待加强。 一些检测系统的自身性能仍存在不少问题，如大多数即时检测(point—of-care testing，POCT) 方法检测 HbA1c 的精密性、准确性无法满足临床需求，不能用于糖尿病诊断，但可以用作监测方法。此外，多种因素可直接影响 HbA1c 的检测结果。 影响 HbA 1c 检测结果的因素 糖化血红蛋白是红细胞中血红蛋白与葡萄糖的结合产物, 因此, 任何引起血红蛋白数量与质量变化的因素都会干扰 HbA1c 测定, 对结果产生影响。 干扰因素包括: 血红蛋白病、衍生血红蛋白、红细胞生存周期的异常及药物等。有些干扰因素及干扰程度取决于所采用的测定方法 (方法学特异), 而有些干扰无论采用何种方法都无法克服 (非方法学特异)。 实验室应知晓 HbA1c 测定存在的干扰因素, 某些患者人群可能需要用某种特异的 HbA1c 测定方法或不适宜采用 HbA1c 来反映体内平均血糖水平。
实验流程 1、末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12h，与麻醉前进行称重，行腹腔注射3%戊巴 比妥钠，0.3ml/100g 2、腹主动脉取血，留取全血标本。 3、取肝、脾、肾、胃、心脏及脑。 4、称肝、脾、肾、胃、心脏及脑组织，并分装各个组织，放入-80℃冻存。其中 肝组织剪取1g肝脏，送至肝均浆；肝10%甲醛固定做HE染色，每组5只； 肝4%戊二醛固定做电镜，每组一只； 5、小肠10%甲醛固定做HE染色，每组5只；小肠4%戊二醛固定做粪便电镜，每 组1只；其余肠组织-80℃冻存。 6、肝；制成肝均浆，1g肝脏加入9ml冰生理盐水，制成肝均浆液，离心后，取 上清液，于-80℃冻存。 7、全血标本静置30min后，进行离心，分离血清，血清和血浆均放入-80℃冻存。检测指标： 1、肝脏组织 1.1HE染色观察肝脏组织的病理学改变。 1.2透射电镜观察肝脏超微结构变化 1.3电感耦合等离子体质谱（ICP-MS） 1.4试剂盒测肝均浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶 （GSH-Px）、ROS活性氧水平 1.5检测肝脏组织中Western blot、NF-kB、COX-2表达情况，计算其阳性表达 率 2、血清（血浆） 2.1全自动化分析仪测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷氨转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶TG 2.2酶联免疫吸附法检测血浆中肠结合脂肪酸蛋白（FABp2）、D-乳酸（D-LA）及二胺氧化酶（DAO）水平评价大鼠大肠粘膜损伤 2.3试剂盒测血浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、4-HNE（羟基壬烯醛）、 谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）评价大鼠氧化应激水平 2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血浆中α肿瘤坏死因子（TNF α）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)浓度 3、肠道菌群
进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响 实验目的： 1.熟悉常用的糖尿病大鼠造模方法 2.掌握血糖仪的使用方法 3.掌握组织样品的制备方法 4.了解血清胰岛素水平检测方法 5.熟悉肝糖原提取、鉴定的方法与原理 6.通过本实验探讨临床糖尿病患者不同进食状态对血糖的影响 实验用品： 一、器材： 普通离心机，酶标仪，恒温水浴箱，分光光度计，0.01g电子天平、0.1g电子天平，血糖仪，棉签，干棉球，剪刀2把，镊子2把，研钵2个，白磁盘，试管架，拆条酶标板，吸水纸，5ml离心管，试管，烧杯，漏斗，玻璃棒，刻度吸量管，EP管，滤纸，1000μl微量可调取液器，50ml容量瓶3个，注射器，白瓷反应板，塑料手套，布手套，抹布，记号笔 二、试剂： 5%三氯乙酸溶液，蒸馏水，生理盐水，碘试剂，95％乙醇，标准葡萄糖溶液（50mg/L），98%浓硫酸，30%KOH溶液，0.2%蒽酮显色剂，柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH4.4），1%链脲佐菌素（STZ）溶液，10%水合氯醛溶液，大鼠胰岛素（INF）ELISA检测试剂盒 实验步骤： 一、标记： 二、造模：
A、抓取大鼠并称重。（结果见表一） B、大鼠先禁食12小时后（此部分为老师帮忙完成），进行血糖检测。然后抓取大鼠单次腹腔注射按1%STZ溶液（65mg/Kg），注射后一小时，给予自由饮食、饮水。 具体抓取大鼠方法：用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手紧抓两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果大鼠后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住。 C、以后每天安排人员进去喂养动物，记录饮食量和更换垫料。 D、待72小时后大鼠尾静脉采血再次检测血糖，以餐后血糖≥16.7mmol/L为大鼠糖尿病模型造模成功的判定标准。 血糖检测具体步骤：将血糖检测专用试纸插入血糖分析仪中，待血糖仪显示屏上显示滴血标记时，方可使用。用剪刀剪断大鼠尾尖约＜0.5cm，挤出的第一滴血用棉球擦掉不要，第二滴血滴在试纸上。待血糖仪显示屏上显示稳定的数值后记录。（血糖检测结果见表二） 三、麻醉： 大鼠称量后，通过计算每只大鼠所需麻醉量（0.3ml/100g），抓取大鼠，腹腔注射。 四、血清胰岛素水平检测： 麻醉后摘除大鼠眼球，取血约1ml于EP管中，静置一小时以上，由于实验顺序要求先进行接下来的肝糖原检测并鉴定实验，所以静置后将EP管放入冰箱内冷藏一天，第二天进行实验时，将EP管对称放入离心机中，进行2000r/min离心15分钟，分离血清100μl。采用大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒步骤进行血清胰岛素水平检测。 板37°C温育30分钟。 3．洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μl，37°C温育30分钟。 4．洗涤5次，每孔加入显色液A,B各50μl，37°C避光显色10分钟。
如对您有帮助，请购买打赏，谢谢您！ 糖化血红蛋白检测的临床意义 血糖测定只代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。 糖化血红蛋白是指血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。 当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖化血红蛋白含量也会相对较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在细胞死亡前，血液中糖化血红蛋白含量也会保持相对不变。因些糖化因红蛋白水平反映的是在检测前120天内的平均血糖水平，而与抽血时间，病人是否空腹，是否使用胰岛素等因素无关。是判定糖尿病长期控制的良好指标。 糖化血红蛋白的测定结果以百分率表示，指的是和葡萄糖结合的血红蛋白占全部血红蛋白的比例。非糖尿病患者的糖化血红蛋白的水平为4-6%；许多研究发现糖尿病患者如查能将糖化血红蛋白水平降低至8%以下，糖尿病的并发症将大大降低，如果糖化血红蛋白>9%，说明患者待续性高血糖，会发生糖尿病性肾病,动脉硬化,白内障等并发症，并有可能出现酮症酸中毒等急性合并症。因此，有关专家建议,如果糖尿病患者血糖控制已达标准，并且血糖控制状态较为了平稳，每年至少应该接受2次糖化血红蛋白检测；对于那些需要改变资料方案，或者血糖控制状态不稳定的患者，及正在进行胰岛素治疗的患者，应该每三个月进行一次糖化血红蛋白测定。 糖化血红蛋白的检测可以指导临床更好地制定糖尿病例患者的诊疗方案。如果某位患者每天仅在早餐前测定空腹血糖，发现这个值为130mg/ml,处于政党范围内;但再检测糖化血红蛋白却发现为11%，这意味着该患者在过去的3个月内平均血糖水平已接近270mg/ml，暗示其将来发生糖尿病并发症的危险性非常高,。尽管早餐前血糖结果尚满意，但是一天其它时间的血糖水平却严重超标，需要对患者饮食，运动及药物治疗作出重新评估，并作出相应调整,此外患者还需较现在更为频繁地测定血糖。 综上所述，糖化血红蛋白是糖尿病患者疾病控制程度一项良好的指标，糖尿病患者应定期检测糖化血红蛋白，并据此制定，修正相关治疗方案。 对于糖尿病患者来说，糖化血红蛋白（hba1c）是一个非常重要的检测指标。通过检测糖化血红蛋白可以了解糖尿病患者过去2～3个月内血糖控制的平均水平，它不受患者偶尔一次的血糖升高或降低的影响。英国糖尿病前瞻性研究证实，糖化血红蛋白每下降1%，糖尿病患者发生死亡的几率就会降低21%，发生心肌梗死的几率就会下降14%，发生中风的几率就会下降12%，发生微血管病变的几率就会下降37%，需要做白内障摘除手术的几率就会下降19%，因周围血管疾病而导致截肢或死亡的几率就会下降43%，发生心力衰竭的几率就会下降16%。 1、作为糖尿病患者长期血糖控制的评价指标；糖化血红蛋白（HbA1c）的测定目的在于消除波动的血糖对病情的控制观察的影响，因而对血糖波动较大的Ⅰ型糖尿病患者，测定糖化血红蛋白（HbA1c）是一个有价值的血糖控制指标。对于2型糖尿病患者，血糖和尿糖测定较简单和经济，且能较可靠地反映病情的控制，故测定糖化血红蛋白（HbA1c）的意义低于1型患者，但可作为辅助检查，用于判定口服药是否失效而须用胰岛素治疗。 2、有助于对糖尿病慢性并发症的认识；血糖测定只代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。 3、用于糖尿病的诊断；健康人HbA1c为4.0%-7.7%(6.5±1.5%), 未控制的DM病人HbA1c 可高达10%-20%；随机检测HbA1c，若＜8%，多不考虑糖尿病。HbA1c＞9%，预报糖尿病的标准度约为78%，灵敏度为68%，特异性94%；HbA1c＞10%，则有80%以上为糖尿病，灵敏度43%，特异性99%，有效率86%。所以，目前并不主张单独用HbA1c来诊断糖尿病，原因是精确度不高，有时造成临床解释困难。
糖化血红蛋白临床意义 血中葡萄糖与红细胞的血红蛋白相结合的产物，即红血球的血红蛋白中糖基化部分，称为糖化血红蛋白。正常人血红蛋白中的糖化血红蛋白约在7% 以下。糖化血红蛋白亲和色谱测定手段已获公认，正 常参考值为 5.89 ±).9% ( 4.99% ?6.79% )。 糖化血红蛋白的多少与血中葡萄糖的含量高低成正比关系，可以间接反映血糖浓度的改变，同时也反映了机体糖代谢的状态。糖化血红蛋白的临床意义主要体现在以下几点： (1) 长期以来，评价糖尿病长期控制水平一直是一个困难问题，对病情波动较大及注射胰岛素的患者尤其如此。一次血糖、尿糖的测定，只能反映抽血当时的血糖水平，并且血糖随进食和糖代谢的变化而有所改变，不能说明前一段较长时间病情的全貌。而糖化血红蛋白随血糖变化而变化，可以反映出病人在抽血化验前4?8 周之内一段时间的血糖平均水平。 (2) 糖化血红蛋白不仅可作为糖尿病的病情监测指标，亦可作为轻症、H型、隐性”糖尿病的早期诊断指标。但不是诊断糖尿病的敏感指标，不能取代现行的糖耐量试验，可列为糖尿病的普查和健康检查的项目。 (3) 正常人的糖化血红蛋白V 6.79%。如果〉11.5%时，说明患者存在着持续性高血糖，可以岀现糖尿病肾病、动脉硬化、白内障等并发症。因此，临床经常以糖化血红蛋白作为监测指标来了解患者近阶段的血糖情况，以及估价糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。 (4) 对预防糖尿病孕妇的巨大胎儿、畸形胎、死胎，以及急、慢性并发症发生发展的监督具有重要意义。 (5) 对于病因尚未明确的昏迷或正在输注葡萄糖(测血糖当然增高)抢救者，急查糖化血红蛋白具有鉴别诊断的价值。 (6) 对于糖化血红蛋白特别增高的糖尿病患者，应警惕如酮症酸中毒等急性合并症的发生。 总之，糖化血红蛋白是一项说服力较强、数据较客观、稳定性较好的生化检查，能反应糖尿病患者2个月以内的糖代谢状况，同时与糖尿病并发症尤其是微血管病变关系密切，在糖尿病学上很有临床参考价值。 评价糖尿病长期控制水平一直是一个困难问题，对病情波动较大及注射胰岛素的患者尤其如此。国外目前已将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方法的“金指标”。研究表明[5]，糖化血红蛋白的测定与WHO 的糖尿病的诊断标准密切相关，可以不必考虑口服葡萄糖耐量试验 ( OGTT )的结果，仅根据检测结果即可作岀治疗决定。HbAlc 大于7% 时，不管OGTT 的诊断是 糖耐量减退还是糖尿病，均需要药物治疗；HbAlc 小于7% 时，一般可采用饮食和运动疗法。糖尿病患者如果能将糖化血红蛋白水平降低至8% 以下，糖尿病的并发症将大大降低。血糖严格控制的患者( HbAlc < 8% )可使视网膜病变下降76% ，肾脏病变下降56% ，神经系统病变下降6)%，心血管病变下降41%，HbAlc 每下降1% 可使微血管并发症下降35%。如果糖化血红蛋白> 9%，说明患者持续性高血糖，可发生
糖化血红蛋白与糖尿病及其并发症的关系【摘要】目的了解糖化血红蛋白（HbAlc）与糖尿病及其并发症的关系，及时控制糖尿病及其并发症的发生和发展。方法选择60例糖尿病及糖尿病伴有并发症患者与30例正常人的糖化血红蛋白（HbAlc）、空腹血糖（FBG）进行测定，并做联合分析。结果正常对照组的HbAlc为（5.65±0.43）%，FBG为（4.87±0.63）mmol/L；糖尿病组的HbAlc为（9.82±2.41）%，FBG为（9.31±4.86） mmol/L；糖尿病伴有并发症的HbAlc为（11.08±2.16）%，FBG为（10.31+5.86）mmol/L；糖尿病无并发症的HbAlc为（7.64±0.41）%，FBG为（7.78±1.67） mmol/L，糖尿病患者的HbAlc与FBG呈显著正相关（P＜0.01）。糖尿病伴有并发症患者的糖化血红蛋白（HbAlc）明显高于无并发症者（P＜0.01），提示糖尿病患者并发症的发生与HbAlc有关，并且发现糖尿病患者病程的长短以及急、慢性并发症之间的HbAlc相比，均无显著差异（P＞0.05）。结论糖化血红蛋白的控制，对预防糖尿病及其并发症的发生、发展极为重要。 【关键词】糖化血红蛋白；空腹血糖；糖尿病 糖尿病是一组由于胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用低下而引起的代谢性疾病，目前发病率仅次于心脑血管疾病和肿瘤。在我国糖尿病发病率为2%～3%，并以千分之一的速度增长［1］。目前临床已广泛开展检测患者血糖工作。但血糖测定只代表即刻的血糖水平，提示
患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。在糖尿病所致肾病、视网膜、神经病变等并发症的诸多因素中，血糖控制不良是最主要因素。而糖化血红蛋白（HbAlc）是血糖控制好坏的重要指标，它所反映的是过去6～8周的平均血糖水平。糖化血红蛋白的测定结果以百分率表示，指的是和葡萄糖结合的血红蛋白占全部血红蛋白的比例。非糖尿病患者的糖化血红蛋白的水平为4%～6%，许多研究发现糖尿病患者如果能将糖化血红蛋白水平降低至8%以下，糖尿病的并发症将大大降低，如果糖化血红蛋白＞9%，说明患者持续性高血糖，会发生糖尿病肾病、视网膜、动脉硬化等病变，并有可能出现酮症酸中毒等急性并发症［2］。所以，有关专家建议，如果糖尿病患者血糖控制已达标准，并且血糖控制较为平稳，每年至少应该接受2次糖化血红蛋白检测；对于那些需要改变治疗方案，或血糖控制不稳定的患者，及正在进行胰岛素治疗的患者，应该每3个月进行一次糖化血红蛋白检测。为了解糖化血红蛋白与糖尿病及其并发症的关系，有效防治糖尿病并发症的发生，笔者对60例糖尿病患者和30例正常人的糖化血红蛋白（HbAlc）和空腹血糖（FBG）进行了测定，以评估他们之间及其并发症的关系。 1 对象与方法 1.1 研究对象正常对照组：均为排除了糖尿病和糖耐量减退的正常人，共30例，男11例，女19例，年龄21～84岁，平均49.1
2型糖尿病大鼠模型的建立及其验证论著 燕娟1 郭巍伟1 梁执群1 李志国1 郭永昌2 (山西医科大学1人文社会科学学院;2实验动物中心 山西 太原 030001) 【摘要】 目的 制备一种发病过程类似人类2型糖尿病的动物模型。方法 雄性S D成年大鼠高糖高脂饲料喂养 1个月,诱发出胰岛素抵抗,给予小剂量链脲佐菌素(STZ)25mg/kg,腹腔注射,建立2型糖尿病大鼠模型。结果 试验 组大鼠血糖升高,对胰岛素敏感性下降,从生化指标和形态学方面证实造模成功。结论 本实验2型糖尿病大鼠模型 造模成功,它具有中度高血糖、胰岛素抵抗、成功率高等特点,是人类2型糖尿病及其药物研究的理想动物模型。 【关键词】 糖尿病 动物模型 大鼠 Type2d i a betes ra t m odel and its ver i f i ca ti on.YAN Juan,G UO W ei-w ei,L I ANG Zhi-qun,et al.ShanxiM edical U niversity,College O f Hu2 m anities A nd Social Science,Taiyuan Shanxi030001,China. 【Abstract】 O bjecti ve Preparati on of a disease si m ilar t o human type2diabetes ani m al model.M ethods Male S D adult rats fed high- fat high-sugar a month,induced insulin resistance,given l ow-dose strep t ozot ocin(STZ,25mg/kg,intraperit oneal injecti on),set up in type2 diabetic rat model.Results Test gr oup of rats increased bl ood glucose,insulin sensitivity decreased,fr om the bi oche m ical indices and mor phol ogy confir med the successful model.Conclusi on The experi m ental rat model of type2diabetes model successfully,it has moderately high bl ood sug2 ar,insulin resistance,the success rate is high,are of human type2diabetes and its drug research ideal ani m al model. 【Key words】 D iabetes;Ani m al model;Rat 糖尿病与心脑血管疾病、肿瘤是当前威胁人类健康的三大非传染性疾病,已成为全球性的卫生问题。随着我国人民生活水平的提高、人口老化、生活方式的改变以及诊断技术的进步,糖尿病的发病率呈现迅速上升趋势,2型糖尿病是糖尿病人群的主体,占糖尿病发病率的90%以上。因此,研制2型糖尿病动物模型具有重要的医学研究意义。在国外2型糖尿病的研究中,采用的动物模型多为遗传相关模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠及肥胖型Zucker大鼠等,其特点是遗传因素在发病过程中占主导作用,不完全与临床相符,且十分昂贵,不利于国内研究的开展[1]。本研究结合前人经验,应用高糖高脂饲料结合小剂量链脲佐菌素(STZ)建立了2型糖尿病大鼠模型,较符合人类普通型2型糖尿病发病机制,有利于进行2型糖尿病及其并发症的相关研究[2,3]。1 材料和方法 1.1 动物和材料 清洁级雄性S D大鼠40只,体质量(180±20)g,由山西医科大学实验动物中心提供,每笼4～5只,饲以普通饲料,自由摄食摄水,除实验应激外无其他不良刺激。STZ由美国Sig m a公司生产。胰岛素、胰高血糖素放射免疫分析药盒为解放军总医院科技开发中心放免所产品,购自北京普尔伟业生物科技有限公司。 1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 在大鼠适应期后,随机取10只作为正常对照组,其余30只给予高糖高脂饲料(在标准全价混合饲料的基础上添加蔗糖、炼猪油和蛋黄,热能含量21.6kJ/kg)。高糖高脂饲料组喂养4周后,腹腔注射STZ(临用前溶解在pH=4.0的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液内,25mg/kg,1次/d,连续2d),正常对照组普通饲料喂养4周,再注射等量柠檬酸缓冲液,1次/d,连续2d。注射药物两天后间隔1d血糖测试仪测查大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)即注射后血糖,以血糖含量16.7mmol/L为2型糖尿病大鼠模型判定标准,随机选取10只糖尿病大鼠为模型组。继续普通饲料喂养4周。 1.3 指标测定 1.3.1 一般状况观察 包括大鼠的精神状态、体质量、饮水量、食量、大小便。 1.3.2 血糖测定 腹腔注射STZ或柠檬酸缓冲液2 d后及实验结束时分别进行空腹状态下剪尾取血,测其血糖值,为注射后血糖。4周后处死大鼠测其血糖为终血糖。 1.3.3 血清胰岛素、胰高血糖素水平测定 实验结束时禁食12h,20%的乌拉坦腹腔麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清后放射免疫分析法测定。 1.3.4 胰岛素敏感指数(I SI)的计算 参照李光伟等[4,5]的方法,I SI=ln[1/F BG×F I N S],F BG为空腹血糖,F I N S为空腹胰岛素。 1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理,数据以均数±标准差( x±s)的形式表示,用t检验分析。 2 结果 2.1 两组大鼠一般状况 对照组大鼠生长良好,体质量持续增加,无其他症状。模型组大鼠在注射STZ后体质量呈缓慢增长、逐步较前下降、消瘦走势,观察发现有 ? 5 ? 临床和实验医学杂志 2009年4月 第8卷 第4期
对糖化血红蛋白作为糖尿病诊断标准的探讨 【摘要】目的：探讨糖化血红蛋白作为糖尿病诊断标准的价值。方法：研究近2年到我院进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和HbA1c检查的患者286人。结果经OGTT确诊对糖尿病诊断敏感性为70%，特异性为82.55%，阳性预测值为90.32%。结论：连接几点的曲线进行诊断意义更大。 【Abstract】Objective To investigate the glycated hemoglobin value as diagnostic criteria for diabetes. Study the past 2 years to our hospital oral glucose tolerance test (OGTT) and 286 patients with HbA1c checks. Results The sensitivity of OGTT confirmed diagnosis of diabetes was 70%, specificity of 82.55%, positive predictive value of 90.32%. Conclusion The diagnosis of the curve connecting points more meaningful 【Key words】glycosylated hemoglobindiabetes 1对象 为了更进一步的理解糖化血红蛋白作为糖尿病诊断标准诊断意义，我们收集了就HbA1c作为糖尿病诊断的价值进行探讨。研究2008年1月－2009年12月到我院为确诊糖尿病而进行OGTT及HbA1c检查的就医者286人。其中男性160例，女性126例。年龄56±11.78岁，32岁－82岁。 诊断标准：血糖标准按照1997年ADA诊断标准：空腹血糖≥7mmol/L和（或）餐后2小时血糖≥11.1mmol/L. 2方法 受检者于晨空腹进行OGTT。先收集空腹静脉血浆标本，随后口服葡萄糖75克，2小时后再次收集静脉血浆标本，分别测定空腹葡萄糖（FPG）及餐后2小时血糖（2hPG）和HbA1c值。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，HbA1c采用胶乳增强免疫比浊法。 3统计学处理 根据1997年ADA诊断标准发现病例数，再以HbA1c≥6.5%及≥6%两切点，利用公式进行计算其诊断的敏感性、特异性及阳性预测值。 4结果 286例受检者进行OGTT，其中单项FPG≥7mmol/L者15例；单项2hPG≥11.1mmol/L者19例；FPG及2hPG均达到诊断标准者166例。未达到诊断标准者86例。
7 摘要：目的探讨链脲佐菌素（STZ ）建成可靠、稳定的1型大鼠糖尿病模型情况。方法选取 SDF 级雄性Wistar 大鼠70只，分成3个实验组，各20只和对照组10只，实验组大鼠一次性腹腔注射STZ 30、65、100mg /kg ，对照组10只大鼠腹腔注射枸橼酸缓冲液，用拜安易血糖仪检测血糖，7d 后血糖＞16．65mmol /L 判定为1型糖尿病动物模型。观察大鼠的血糖、体质量、饮水量、胰岛素和C 肽等指标。结果大鼠注射STZ 65mg /kg 7d 后，大部分血糖值达到成模标准，并出现糖尿病表现，持续观察7周，有18只大鼠成模，未见糖尿病转复，糖尿病症状明显。结论腹腔一次性注射STZ 65mg /kg 剂量可成功制备1型糖尿病大鼠模型。 关键词：链尿佐菌素；1型糖尿病模型；大鼠 Establishment and Observation of Type I Diabetic Rat Models ZHANG Ju-biao 1， SU Xiu-lan 2，OUY-ANG Xiao-hui 1 ．（1．Department of Tumor Surger ， Inner Mongolia Autonomous Region People's Hospital ，Hohhot 010010，China ；2．Central Lab of Inner Mongolia Medical University ，Hohhot 010010，China ） Abstract ：Objective To establish type I diabetic rat models by intraperitoneal injection of streptozoto-cin and observe the stability of diabetic changes in rats．Methods 70male Wistar rats were divided into 3experiment groups of 20rats each and 1control group of 10rats．The experiment groups were intraperitoneally injected by 30mg /kg ，65mg /kg ，and 100mg /kg STZ respectively ，while the control group was injected cit-rate buffer．Bayer blood glucose meter was adopted to test the blood glucose ，setting ＞16．65mmol /L after 7d as the type 1diabetic animal model．The fasting blood glucose level ，body weight ，water intake ，insulin and C-peptide of the rats at different time points were observed /measured．Results In the group of injection by 65mg /kg STZ ，after 7days most rats reached the model blood glucose standard and had diabetic manifes-tation ，after continuous observation of 7weeks ，18rats were qualified as the model with obvious symptoms and without conversion．Conclusion With the dose of 65mg /kg of STZ through one intraperitoneal injection ，type 1diabetic rat models can successfully established． Key words ：Streptozotocin ；Type 1diabetic models ；Rat 糖尿病已成为严重威胁人类身体健康和生命的 疾病。它是一种以持续性高血糖为特征的内分泌障碍疾病，可导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经和心血管等器官的慢性进行性病变，最终引起功能损伤及衰竭。1型糖尿病及其并发症的病因、发病机制尚未完全阐明，预防和治疗仍不完善，干细胞（stem cells ）是体内存在的一类特殊细胞，有自我更新和不断增生的能力，又具有多向分化的潜能，只要掌握了胰腺干细胞的特异标志、转化调控机制、培养及分离技术，就可以体外操纵干细胞，进行大量扩增和定向诱导分化，最后将得到能分泌胰岛素的胰岛 样细胞［1-2］，用于治疗1型糖尿病。因此，建立较理 想的动物模型研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前，国内外普遍使用STZ 制备糖尿病大鼠 动物模型。该项实验根据吴清洪报道的方法［3］ ，采用简单的腹腔一次注射的方法制备稳定并且可靠的动物模型。1材料与方法 1．1实验动物的选择和喂养SDF 级成熟Wistar 雄性大鼠70只（体质量220 280g ），购自内蒙古大学实验动物中心，饲养室内氨浓 度＜20g /L ， 相对湿度40% 70%，室温18 25℃，保证良好的通风，避免增加造模后大鼠的感染概率，普通饲料喂养，饮水自由。 1．2主要仪器和试剂拜安易血糖检测仪及试纸（美国Bayer 公司）；STZ （美国Sigma 公司）；胰岛素、C 肽放射免疫分析药盒（均购自内蒙古泽生耗材）。 1．3主要实验试剂的配制STZ 液称取STZ 粉剂0．2g ，溶于pH 4．5，浓度为0．1mmol/L 的枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液20mL 中，制成1%溶 液，经0．22μm 滤器过滤除菌，要求5min 内配制完成，配好后，10min 内用完，STZ 和枸橼酸缓冲溶液低温保存，新鲜配制。 1．4实验分组和大鼠糖尿病模型的制备采取国内外普遍使用的STZ 制备糖尿病大鼠模型，根据徐 华等［4］ 报道， 雄性大鼠易于成模，且成模后血糖稳定性好，故选取成熟雄性大鼠用于实验。将所有大鼠（70只）使用代谢笼单只喂养，适应性喂养1周， 1周内注意观察大鼠的饮食情况、体质量等健康状况， 1周后，选取空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠为实验对象。将空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠随机分为4组，实验组（60只）分别接受STZ 液一次性腹腔注射，剂量为30、65、100mg /kg ，对照组（10只）注射枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液。实验前 大鼠禁食、水12h 。分别于注射后3、 7、14、28d 采用剪尾法采集血样，用拜安易血糖仪检测空腹血糖，7d 后空腹血糖＞16．65mmol /L ，出现多饮、多食、多尿 · 533·医学综述2013年1月第19卷第2期Medical Recapitulate ， Jan．2013，Vol．19，No．2
糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义(一) 【摘要】目的：建立糖尿病大鼠模型，探讨糖尿病大鼠尿中nephrin的检测、动态变化及意义。方法：SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液，动态检测各组大鼠24h尿微量白蛋白及肾功能，以Western-Blot方法动态检测尿中nephrin。结果：正常大鼠尿中无nephrin排泄，而糖尿病大鼠尿中可检测出nephrin，诱模早期（2周）即可出现，随着病程的延长，nephrin逐渐增多，8周达高峰后，nephrin的排泄又逐渐减少。结论：糖尿病肾病早期nephrin即可从尿中排泄，尿nephrin可作为糖尿病肾病的早期诊断指标之一，还将有助于监测、判断糖尿病肾病的病程进展。 【关键词】糖尿病肾病；大鼠；微量白蛋白;尿nephrin 〔Abstract〕Objective:Diabeticratswereinducedtoexplorethedetectionofurinarynephrinindiabeticrats,itsdyna micchangesandclinicalsignificance.Methods：SDratsweredividedinto2groups.Diabeticratsmodelwereinducedbysingleintraperitonealinjectionof streptozocin(STZ),whilethoseofnormalcontrolgroupwereinjectedwithequaldosageofcitricacidbuffe rsolution.Twentyfourhoursurinarymicroalbuminandrenalfunctionwereambulatorilymonitored,and UrinaryNephrinwasmeasuredwithWestern-Blot.Results：Thetestshowedthatnourinarynephrinwerefoundinnormalcontrolgroup,butitwasdectetedoutindia beticratsgroup,anddiscoveredattheearlystage(2weeksafterSTZinjection).Withtheextensionofcours e,urinarynephringraduallyincreased,andthengraduallydecreasedafterreachingitspeakbyweek8.Co nclusion：Thenephrincouldbeexcretedoutfromurineattheearlystageofdiabeticnephropathy.Urinarynephrinc ouldnotonlyberegardedasaspecificindexfortheearlydiagnosisofdiabeticnephropathy,butalsobeben ificialtoclinicalmonitoringandevaluatingthedegreesoftheDN. 〔Keywords〕diabeticnephropathy;rats;microalbumin;urinarynephrin 糖尿病肾病(diabetesnephropathy，DN)是糖尿病微血管病变之一，是终末期肾衰的重要原因，早期诊断和治疗可延缓其发展。DN起病隐匿，早期诊断困难，目前公认的诊断早期DN的指标是尿微量白蛋白，但也仅使DN诊断提早到依据Mogensen建议的Ⅲ期。部分糖尿病患者当发现微量白蛋白尿时，肾脏的结构损害已很明显〔1〕。因此不能单以尿微量白蛋白的出现来判断早期DN。 蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关，nephrin是新近发现由足细胞表达、特异定位于肾小球足细胞裂孔隔膜的蛋白分子，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能〔2〕。研究表明，实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有nephrin表达的改变，且nephrin可从尿中排泄〔3〕。而尿中nephrin排泄量增加是否可敏感反映糖尿病早期肾脏损害，目前国内尚未有报道。本文对糖尿病大鼠尿蛋白排泄率(AER)及尿液nephrin进行动态观察，旨在探讨尿nephrin在DN中的变化规律及其对早期DN的诊断意义。 1对象与方法 1.1实验动物及分组 雄性SD大鼠76只，体质量230～280g，购自江苏大学医学院实验动物中心，血糖正常。试验期间，室温控制在18～20℃，湿度48%，12小时交替照明，大鼠自由饮水进食，保持垫料干燥。实验共分对照组（n=36），糖尿病组（n=40）。对照组0周处死6只，再与糖尿病组随机分为2，4，6，8和12周5个亚组，分别于DM诱模后2，4，6，8和12周处死。 1.2糖尿病模型的建立 所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只，禁食12h后，空腹状态下，链脲佐菌素（STZ）按55mg/kg一次性腹腔注射制备糖尿病模型，STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mmol/L,pH4.2)