提高外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达策略
本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养的特点，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。影响大肠杆菌中蛋白表达量的因素有载体启动子结构、质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素。在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行总结，以期有助于研究。
1.有效表达载体的构型
构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。其主要构件包括启动子、终止子、抗终止子、弱化子、绝缘子和增强子等。
1．1启动子
理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[1]。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[2]。Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3’端相互作用[3]。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[4]。在RBS的5’和3’端均为A丰富区。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期。但目前发现在转录过程中部分启动子在转录为RNA后可引起导致转录后基因沉默，从而减少目的蛋白量（a）。某些启动子还识别特异性的RNA聚合酶（ rnap ），特异性的RNA聚合酶（ rnap ）可以分辨出不同的启动子结构，优先启动推动者与目的序列。（c）还有研究表明有关基因表达的假设增强子与启动子之间相互作用发生分子间的结构独立功能联合的复合体增强启动子功能，该结构具有特异性。并不是所有增强子与启动子都能发生功能联合的复合体（b）。
目前在E.coli中发挥作用的启动子很多。通常常被使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
1．2 终止子
在一个基因的3末端或是一个操纵子的3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离，它是一种环状hexameric蛋白质和ATP解旋酶的活动。nusg ，nusa和nusb是以附加因素的形式参与终止进程。 rho依赖性终止作用是当rho与游离核糖体中富含C 的位点相结合后产生的， rho的ATP酶激活rho - mRNA的终止子作用，并为其提供能量，使rho能够在mRNA上向前移行;移行过程中是mRNA上的讯息进入六聚体的中心孔，当移行到转录底物释放rho的解旋酶时聚合酶停止工作转录终止（d，e）。
另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区[5]。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵[6]。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录[7]。同时对于大肠杆菌来说，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，对于UAAN 和UAGN系列终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小依序为U＞G＞A、C。UAG 极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为U＞G＞A＞C。
1．3抗终止子
细菌中许多参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5’端含有转录衰减子。衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调节。这样关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切之后引导初始转录本中二级结构的形成。如果没有关联的带电荷tRNA，则会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止[8]。其中hutp是一种RNA结合蛋白表达的调节有关氨基酸利用率的操纵子，具有约束力的顺式调控序列。（g）它要求组氨酸和镁离子结合才能进行mRNA的表达。在研究中，已证明了几个二价阳离子可调解hutp RNA的相互作用。最好的二价阳离子被锰，锌和镉，其次是镁，钴和镍离子，而铜离子， yb2 +和Hg2 +无效。在hutp RNA的互动中表明金属离子能调解蛋白质核酸相互作用，增强mRNA的转录(f)。在rho依赖性终止中抗终止元件能使RNA 多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依赖性终止子即boxA[9],从而达到抗终止子的作用。
1．4弱化子
弱化子(attenuator)是在研究大肠杆菌的色氨酸操纵子表达弱化现象中发现的。在trp mRNA 5’端trp正基因的起始密码前有一个长162 bp的DNA序列称为前导区，其中第123～150位核苷酸能影响色氨酸的表达，如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。这个区域被称为弱化子。弱化作用在原核生物中是相当普遍的，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中已陆续发现不少操纵子都有弱化现象。例如在AmpC酶的表达过程中，其基因上的弱化子为一段不稳定的发卡结构（h）,但这段发卡结构较易突变，若其上16~43基因缺失将改变这一结构使其弱化作用消失（i）。
1．5绝缘子
绝缘子(insultor)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用，其作用机制可能是取消核酸的碱基的配对作用，和阻断增强子机制(j).
1．6增强子
增强子（enhancer）指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。增强子的特点是：①在转录起始点5’或3’侧均能起作用；②相对于启动子的任一指向均能起作用；③大部分增强子发挥作用与受控基因的远近距离相对无关，但也有小部分增强子其作用与受控基因的远近有关（K）；④对异源性启动子也能发挥作用；⑤通常具有一些短的重复顺序。如今已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列。Olins等从T7噬菌体基因10前导序列（ g10-L）中鉴定了一9bp的序
列，该序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10-L能使多种基因的表达水平提高40-340倍[10]。另外的研究小组在mRNA的5’非翻译区（UTR）鉴定了一U富含序列，该序列同样具有翻译增强子活性。McCarthy等[11]在 E.coli atpE基因中紧接于SD位点下游鉴定一类似区域。同时增强子的作用强弱与细胞培养的理化条件有一定的关系，例如，当在缺氧的条件下(EPO)3‘增强子野生片段或其突变片段其作用将不是增强目的基因的表达，而是相反起到抑制作用（L）。而且部分增强子的作用强弱与其所转入细胞也有关系。（m）
2.培养条件
E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培养系统可以分成三类：分批培养、补料分批培养和连续培养。这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度，从而获得廉价的重组蛋白。培养基的组成需要仔细地计算和监控，因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量[12]。已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解[13]。同样，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌，可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍[14]。同时，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生．外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖．以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。外源蛋白的构象也是影响可溶性表达量的重要条件，可通过影响外源蛋白的化学键的形成来影响结构的改变。例如，外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量．某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性[15]．另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有助于获得高产量的活性蛋白。
同时，高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。这些缺陷包括在高细胞密度情况下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累，近来这一问题通过将来自B. subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决[16]。
3.诱导条件
目前对于蛋白质在大肠杆菌中表达的诱导剂主要有β–半乳糖苷酶（IPTG）、乳糖和胞外超氧化物歧化酶等。在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制．普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白．然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达．目前一般认为在菌体浓度在OD600在0.4~0.6之间效果较好，但Margret B等认为在OD600为0.5~2.0同样可获得较好的效果[17]。．诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择[18]。目前，普遍认为在低温、低诱导剂浓度的情况下可以获得可溶蛋白的高效表达。在温度为28~30℃的时候可以避免不必要的蛋白构象改变，更有利于菌体形成稳定的可溶性蛋白。但是降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，因为某些外源蛋白在42℃时完全可溶。因此不能简单的认为低温就有利于外源蛋白的可溶性表达。
蛋白质的蛋白酶解
蛋白酶解是一个选择性的、高度调节的过程，该过程参与许多代谢活动。E.coli在细胞质、细胞外周质、内膜和外膜有许多蛋白酶。这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明了，但已有一些策略和方法以减少E.coli中异源蛋白的降解。虽然使得蛋白质不稳定的精确结构特点还不清楚，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白不稳定的决定因素。蛋白酶解途径的―N-末端规则‖在E.coli中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关。在E.coli中，Ｎ－末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为２分钟，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。有研究表明，在多肽的第二位带有较小侧链的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得该蛋白不稳定。蛋白质的第二个决定因素是位于近氨基端的特异性内源赖氨酸残基。该残基是多遍在蛋白（Polyubiquitin)链的受体，多遍在蛋白链在真核细胞中有利于遍在蛋白依赖的蛋白酶对蛋白质的降解。减少E.coli中重组蛋白裂解的策略有以下几种：（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基；（2）在较低的温度下培养细菌；（3）选用蛋白酶缺陷的菌株；（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；（5）将目的基因多拷贝串联；（6）与分子伴侣共表达；（7）与T4 pin基因共表达；（8）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点；（9）改善蛋白质的亲水性；（10）优化培养条件等。
另外，mRNA的快速降解也势必影响蛋白质的产生。在E.coli中有多种不同的RNase 参与mRNA的降解，其中包括内切核酸酶（RNase E, RNase K和RNase III）和3’外切核酸酶（RNase II和多聚核苷酸磷酸化酶[PNPase]），目前尚未在原核细胞中发现5’外切核酸酶。mRNA的降解并非由非特异性的外切核酸酶随机剪切而引起，因为在mRNA的长度和半衰期之间并没有反向相关性。已经证明，在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA。一类由mRNA的5’UTRs中的序列组成，5’UTR能通过在5’末端添加发卡结构来延长在正常情况下不稳定的mRNA的半衰期；另一类由3’UTRs和多顺反子间区的发卡结构组成，由3’UTR组成的mRNA保护性元件能够形成发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3’末端对转录本的降解。
4.蛋白质靶向
确定将目的蛋白表达在特定的细胞室，即细胞质、细胞间质或是培养基中，需要权衡各自的利弊。
1．细胞质表达
包涵体的形成仍然是在细胞质中进行基因表达的一个主要障碍。包涵体虽然具有多方面的好处，但这些优越之处与后期繁琐的蛋白重新折叠工作、重叠蛋白的生物活性的未知性以及重叠和纯化后蛋白的总产量降低相比，则显得微不足道。至今尚不明了包涵体形成的精确机制。对于形成和不形成包涵体的81种蛋白质的统计学分析表明，有6个主要的理化指标与此有关。这6个指标是电荷平均数、转变形成的残基组分、半胱氨酸组分、脯氨酸组分、亲水性和残基总数。其中前两个指标与包涵体形成密切相关。
已经建立了多种策略以帮助蛋白质天然空间结构的形成。这些策略包括在较低温度下培养细菌，选择不同的E.coli菌株，替换某些氨基酸残基，与分子伴侣共表达，利用高溶解性的多肽作为共表达分子，在山梨糖醇和甘氨酸三甲内盐存在时，以低渗透压培养和诱导细，改变培养基的pH值。与分子伴侣共表达或许是一种有望提高蛋白质可溶性和折叠效率的途径。
2．细胞外周质表达
在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的
过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N-末端。此外，外周质中的蛋白质降解也少得多。蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽。许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于Ecoli中蛋白质从内膜到外周质的转运。如E.coli的PhoA信号、OmpA、OmpT、LamB和OmpF以及金黄色葡萄球菌的A蛋白，鼠RNase和人生长激素信号肽等。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运。改善蛋白质转运到外周质的策略包括提供蛋白质转运和加工所需的成分：过量表达信号肽酶I，利用prlF突变株，共表达参与膜转运的几种蛋白质，降低蛋白质的表达水平以防止转运工具的过载。
3．细胞外分泌（外泌）
将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。Pugsley对革兰氏阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：（1）利用已有的―真正‖的分泌蛋白所采用的途径；（2）利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。
5.分子伴侣
Ellis于1987年在英国（nature）杂志上正式提出“molecular chaperone”的概念，分子伴侣的概念几经修正，1997年Ellis对分子伴侣的定义是‘Do molecular chaperone have to do protein’一大类相互没有关系的蛋白，他们具有的共同功能是帮助其他含蛋白的结构在体内进行非共价组装或卸装。目前较被认同的分子伴侣的概念是能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象, 并能通过有控制的结合和释放, 促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白。分子伴侣主要是指在进化上非常保守的热休克蛋白(heat shock p rotein 或HSP) 的几个家族。
目前作为分子伴侣的热休克蛋白主要包括三个家即h sp70 家族, h sp90 家族和h sp60 (chaperonin, 伴侣蛋白) 家族。现已发现分子伴侣在蛋白质的折叠、组装及解离、错叠(malfolding) 多肽的降解过程中起到非常重要的作用。分子伴侣蛋白按分子量大小可分为H sp100, 90, 70, 60, 40, 25 等(o)。
分子伴侣作用机制是与靶蛋白形成复合物。流行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚体形式形成中心空洞的结构, 推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。由此提高靶蛋白的自然构象比例。分子伴侣再提高靶蛋白的自然构象比例的同时，也有利于蛋白的细胞外分泌，例如hsp40等其作用在于能影响细胞壁的完整性，其影响编码蛋白激酶C ，并与细胞壁生成有关，能造成细胞壁缺陷，使胞内蛋白分泌到培养基中（n）.但分子伴侣的表达同样受到外界理化条件的影响例如加热，加热可以提高分子伴侣作用，但温度过高又会增加包涵体的比例，影响目的蛋白的胞外分泌表达，所以温度的控制随着目的蛋白的不同和所用分子伴侣的不同而不同。(p)
7．小结
一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。尽管目前在E.coli中表
达外源基因方面已经有许多重大进展，但仍有许多问题亟待解决。归纳起来主要有以下几点：1．借助于细胞的分子伴侣机制来提高正确折叠的蛋白质的产量。或许可以通过共表达多种分子伴侣编码基因和通过激细胞内众多不同的分子伴侣的方法来实现。
2．在E.coli中表达真核膜蛋白和多亚基蛋白质复合物的难题上有待解决。
3．蛋白质分泌到培养基中的真正和有效机制需要明了。目前已经有多种体系能够使重组蛋白质分泌到培养基中。其中有些是利用信号肽、融合伴侣和具有穿透能力的因子，这种因子能够引起外膜的破坏和有限的渗漏。而另外的策略是利用已经存在的分泌通道，来保证更高特异性的分泌。
4．赋予原核细胞诸如真核细胞那样进行翻译后修饰的能力。例如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰氨化等。
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第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science ) Vol .45 Sup. M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项 (20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@https://www.doczj.com/doc/3214056044.html, ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 朱红梅1 ,周涵韬 1,23 ,张赛群 1,2 ,曹 宜2,刘 波 23 (1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003) 摘要:通过电击转化法,将带有 gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段. 关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1] .猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P . 来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2] .在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现 对生物的活体监测[3] ,为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段. 本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价. 1 材料与方法 1.1 材 料 肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2 LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和 阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因. 蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs . BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜. 1.2 实验方法 (1)质粒提取方法 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5 α的单菌落,于10mL 含100μg ?mL -1 Amp 的LB 液体 培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4] .提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度. (2)感受态细胞的制备 在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用. (3)电击转化 2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h, 取100μL 菌液涂布在NA +100μg ?mL -1 Amp +6mg ?mL -1 阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h . (4)转化子的荧光检测 将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察. (5)标记菌株的PCR 鉴定 细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
大肠杆菌基因组DNA得提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 2、实验试剂与仪器 1)实验材料:大肠杆菌 2)实验试剂: LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇 3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅
3、溶液配制 1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5 g/L,NaCl 10g/L,去离子水。 (搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、) 2)TE缓冲液: 1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解) 1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用) TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml 0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液 定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存) 3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用) 4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到 65℃使之溶解,然后室温保存) 4、实验方法步骤 1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。 2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液 3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠 4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。 5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。 6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
生物化学实验报告记录：Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白
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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavon ol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点，去掉终止密码并引入Bam H ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 ×His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtF LS蛋白的N-末端和C-末端6 ×His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中
高中组 11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①
大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化 ●实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。 ●实验原理： 1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC. 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如
使用牛肉膏蛋白胨培养基? 组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,～。? 具体配置步骤：? 1.称药品?按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.? 2.加热溶解?在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.? 3. 调pH?检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH 的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.?
4.过滤?液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.? 5.分装?按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.? 6.加棉塞?试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.? 7.包扎?加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期.?
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
实验六GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提 [实验原理]把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。 [仪器、试剂和材料] 1、pGLO转化的大肠杆菌 2、LB培养液 3、氨卞青霉素 4、L-阿拉伯糖 5、硫酸铵 6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0) 7、恒温摇床 8、小型高速离心机 9、超声波组织细胞破碎仪 10、玻璃试管，三角瓶 11、1.5mL和5mL 塑料离心管 12、“枪”，枪头 [实验操作] 1、大肠杆菌的诱导培养： 从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜。 2、超声破碎抽提： 将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL 的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。 4次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在紫光灯下观察离心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然为绿色，则说明破碎不够，继续按前面方法再超声处理2次，然后再离心。如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到，说明破碎完全。 小心吸出上清液，集中放到干净的5mL离心管中，体积不要超过4mL，逐步地加入少量硫酸铵干粉，使达到饱和，8000转/分离心5分钟。将离心管取出，放紫光灯下观察，沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。将上清液倾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷冻于-20℃。
pKD3 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4290 pKD3 pKD3载体基本信息 载体名称: pKD3 质粒类型: 细菌表达；基因敲除系统 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: R6K 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2804 b p 5' 测序引物及序列: R6K--‐3 3' 测序引物及序列: rrnB--‐T1--‐term--‐F 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 和 Chloramphenicol 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ pKD3载体质粒图谱和多克隆位点信息
pKD3载体序列 ORIGIN 1 AGATTGCAGC ATTACACGTC TTGAGCGATT GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA 61 TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA GGAACTTCAT TTAAATGGCG CGCCTTACGC 121 CCCGCCCTGC CACTCATCGC AGTACTGTTG TATTCATTAA GCATCTGCCG ACATGGAAGC
181 CATCACAAAC GGCATGATGA ACCTGAATCG CCAGCGGCAT CAGCACCTTG TCGCCTTGCG 241 TATAATATTT GCCCATGGTG AAAACGGGGG CGAAGAAGTT GTCCATATTG GCCACGTTTA 301 AATCAAAACT GGTGAAACTC ACCCAGGGAT TGGCTGAGAC GAAAAACATA TTCTCAATAA 361 ACCCTTTAGG GAAATAGGCC AGGTTTTCAC CGTAACACGC CACATCTTGC GAATATATGT 421 GTAGAAACTG CCGGAAATCG TCGTGGTATT CACTCCAGAG CGATGAAAAC GTTTCAGTTT 481 GCTCATGGAA AACGGTGTAA CAAGGGTGAA CACTATCCCA TATCACCAGC TCACCGTCTT 541 TCATTGCCAT ACGTAATTCC GGATGAGCAT TCATCAGGCG GGCAAGAATG TGAATAAAGG 601 CCGGATAAAA CTTGTGCTTA TTTTTCTTTA CGGTCTTTAA AAAGGCCGTA ATATCCAGCT 661 GAACGGTCTG GTTATAGGTA CATTGAGCAA CTGACTGAAA TGCCTCAAAA TGTTCTTTAC 721 GATGCCATTG GGATATATCA ACGGTGGTAT ATCCAGTGAT TTTTTTCTCC ATTTTAGCTT 781 CCTTAGCTCC TGAAAATCTC GACAACTCAA AAAATACGCC CGGTAGTGAT CTTATTTCAT 841 TATGGTGAAA GTTGGAACCT CTTACGTGCC GATCAACGTC TCATTTTCGC CAAAAGTTGG 901 CCCAGGGCTT CCCGGTATCA ACAGGGACAC CAGGATTTAT TTATTCTGCG AAGTGATCTT 961 CCGTCACAGG TAGGCGCGCC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA 1021 GGAACTAAGG AGGATATTCA TATGGACCAT GGCTAATTCC CATGTCAGCC GTTAAGTGTT 1081 CCTGTGTCAC TGAAAATTGC TTTGAGAGGC TCTAAGGGCT TCTCAGTGCG TTACATCCCT 1141 GGCTTGTTGT CCACAACCGT TAAACCTTAA AAGCTTTAAA AGCCTTATAT ATTCTTTTTT 1201 TTCTTATAAA ACTTAAAACC TTAGAGGCTA TTTAAGTTGC TGATTTATAT TAATTTTATT 1261 GTTCAAACAT GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGAGC 1321 TTAGTACGTT AGCCATGAGG GTTTAGTTCG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTTAAACAT 1381 GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTACT ATCAACAGGT TGAACTGCGG 1441 ATCTTGCGGC CGCAAAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA 1501 AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 1561 ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 1621 CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA 1681 TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT 1741 ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT 1801 TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 1861 TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 1921 GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC 1981 CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC 2041 CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT 2101 GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2161 AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 2221 ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC 2281 TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA 2341 GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG 2401 AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 2461 TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGCAT CGATGGCCCC 2521 CCGATGGTAG TGTGGGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 2581 CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 2641 CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 2701 GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGCCATC 2761 CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTGGCCAGTG CCAAGCTTGC ATGC