大规模培养细胞技术
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大规模培养细胞技术
摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。
关键词：细胞培养；贴壁；悬浮；固定化
前言
动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。本文对细胞的培养工艺做一综述。
1.细胞培养的定义
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
2.动物细胞培养的工艺
2.1贴壁培养法
贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。贴壁依赖性细胞在培养时要贴附于培养容器的壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
贴壁培养系统主要有滚瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等，其中尤以滚瓶培养和微载体生物反应器培养更为多见。
2.1.1滚瓶培养系统
培养贴壁依赖性细胞最初采用滚瓶系统培养。滚瓶培养的优势在于能增加供细胞贴壁的表面积，同时温和的滚动有利于细胞生长。细胞接种在滚动的圆筒形滚瓶中，培养过程中滚瓶不断滚动，在培养瓶滚动时，细胞有一段时间离开培养基，使细胞交替接触培养液和空气，增加了气体的交换，有利于细胞生长。滚瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需要简单的增加滚瓶数量等优点。但滚瓶培养也有其缺点，劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。
2.1.2微载体培养系统
微载体培养技术于1967年被用于动物细胞大规模培养[1]。经过30余年的发展，该技术目前已日趋完善和成熟，并广泛应用于生产病毒疫苗和重要蛋白质产品等。
微载体培养原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，但动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，所以无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停，数小时后，待细胞附着于微载体表面后，维持低转速（最大速度75r/min），进入培养阶段。
我国从20世纪80年代后期开始了细胞培养专用介质的研究工作，成功地开发了CT-1、CT-2和CT-3等适合于不同细胞系培养的微载体[2,3]。
微载体法培养动物细胞有很多好处[1]：①可在反应器中提供大的比表面积；②兼有悬浮培养和贴壁培养的优点；③可采用均匀悬浮培养；④可用普通显微镜观察细胞
在微载体上的生长情况；⑤放大容易；⑥适用于多种贴壁依赖性细胞培养；⑦细胞收获容易；⑧劳动强度小，占地面积小。微载体系统也有它的缺陷：①细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤；②微载体价格比较贵；③需要较高的接种细胞量。近年来，已经开发了许多新的多孔性微载体和新的反应器系统，以弥补微载体系统的不足。张孝兵等[4,5]以明胶为原料，用悬浮成球、甲苯制孔的方法制备了大孔明胶微载体。
目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统和培养模式，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统和灌注式生物反应器培养模式等。
（1）搅拌式生物反应器系统该系统已有较长的历史，具备简单、实用及价格低廉等特点。Werner等[6]成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。
（2）旋转生物反应器（RCCS）RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其中培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今，近百种的组织细胞均在该系统内进行了大规模扩增[7]。
（3）灌注式生物反应器培养模式其特点是在细胞培养生物反应器系统中安装细胞/微载体截流装置，培养中不断加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖，既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，可以提高细胞密度在10倍以上[8]。
在生物反应器中用微载体大规模培养贴壁细胞时，细胞经消化进行传代，操作很复杂。现在已有不经消化直接进行微载体间细胞转移的成功报道，通常称为“球转球”。张立等[9]用球转球方法，以5LCelliGen细胞培养用生物反应器作法，在国产50LCellCul-50A细胞培养反应器中培养Vero细胞，通过换液和灌注的方法，培养8天，细胞密度达1.2×107个/ml，然后接种狂犬病毒，连续培养10天，病毒滴度超过国家标准。另外，用这种球转球方法，放大培养鸡胚细胞生产法氏囊病毒液获得了成功[10]。
2.1.3巨载体培养
巨载体培养，是相对微载体和细胞而言的。在这种培养方式中，细胞虽然也像微载体一样贴附于固定的表面生长，但巨载体在生物反应器中是固定的，不因为搅拌而跟随培养液一起运动。
2.2悬浮培养
细胞悬浮培养是指在反应器中自有悬浮生长的过程。悬浮培养系统主要用于非贴壁依赖性细胞的培养。杂交瘤细胞的悬浮培养是研究得最广泛和透彻的动物细胞培养
过程，培养规模最大，操作最成熟。近年来，随着无血清培养技术的发展，越来越多的贴壁依赖性细胞被驯化适合于无血清悬浮培养，例如重组CHO细胞和BHK细胞的大规模悬浮培养都获得了成功[11]。
2.3固定化培养
固定化培养是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养的方法。细胞固定化的制备方法很多包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微载体法、自絮凝发等。
（1）吸附法用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。
（2）共价贴附法利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法。
（3）离子/共价交联法双功能试剂处理细胞悬浮液，在细胞间形成桥而絮结产生交联作用的方法。
（4）包埋法将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。
（5）微载体法[12]用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜的方法。
（6）自絮凝发[13]许多哺乳动物细胞系，特别是在无血清培养下，具有相互聚集、形成细胞团的倾向。利用细胞的这一特性，可以采用沉降或过滤的手段，是细胞团截流在搅拌培养系统中，起到类似于微载体和多孔微载体的作用，结合细胞培养过程的检测成，提高机体对矿物质和微量元素的利用率③产生消化酶提高营养物质的利用率。
和控制，实现细胞高密度长期培养和产物高效生产的方法。
3.发展前景
现利用细胞培养技术已经可以产出多种生物制品，如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子等生长因子，激素、干扰素、白细胞介素等生物调节剂，单克隆抗体及酶制剂等。
细胞的大规模培养已成为必然趋势，大规模生产细胞技术将的到广泛应用。
参考文献
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[4]赵孝兵,张元兴,李雨田.大孔明胶微载体的制备[J].华东理工大学学
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[5]赵孝兵,张元兴.用大孔明胶微载体培养Vero细胞[J]. 华东理工大学学报,1997,23:417~421
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[10]Zhang L,Zhang Y,Yan C,et al.The culture of chicken embryo fibroblast cells on microcarriers to
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外文翻译题目：牛痘病毒疫苗的过去、现在和未来
牛痘病毒疫苗的过去、现在和未来
摘要：牛痘病毒疫苗一度比其他人用疫苗更为广泛的用于人类的疫病免疫。近两个世纪以来，牛痘病毒疫苗被大量使用，为人们抵抗天花的感染提供交叉保护，直到上世纪70年代天花被人类彻底消灭。即使天花已经被完全消灭，但人们仍继续对牛痘病毒疫苗进行不间断的研究，并研制出许多具有更高安全性的改良疫苗。通过在非易感宿主体内连续传代、敲除病毒的毒力基因，或者增强病毒保护性抗原的表达等策略，疫苗的毒性已经得到进一步的降低。高度减毒的第三或第四代的牛痘病毒疫苗现今仍被大量储备，以防备可能被用于生物恐怖武器的天花病毒。科研人员现在也常常将牛痘病毒的基因组作为一个有力的基因工具，用来生产多种新型的基因载体疫苗，例如一种用于野生动物狂犬病的口服疫苗，其关键的糖蛋白基因即是由重组的牛痘病毒所携带并有效表达。
关键词：痘病毒；痘；天花；牛痘病毒；疫苗载体
导言
200年前，爱德华·詹纳第一次引种牛痘病毒抵御天花病毒，这是人们历史上唯一一次非常成功的公众健康干预事例。这种方法起源于英国格洛斯特郡，在农场周围被广泛使用，最终在70年代末引起一场全球性消灭天花的运动的发生。虽然自然感染的天花病毒已由于人们的免疫接种而被消灭，但人们对牛痘病毒以及天花病毒牛痘疫苗的兴趣并没有消失。在过去的三十年中，研究人员通过各种实验室手段，发现并获得一株高度减毒的、安全性能明显提高的新型病毒。与此同时，牛痘基因组因其高度的复制能力和载体功能，被病毒学家视为生产多种病原微生物疫苗的首选。
1.正痘病毒抗原交叉反应和推广战略
痘病毒分为8个属。其中人们最感兴趣的正痘病毒属包括：天花病毒，即痘病毒的代表性病毒；牛痘病毒，即詹纳最先使用的疫苗；疫苗毒，在19世纪的某些期已取代牛痘病毒成为首选的免疫制品。由于正痘病毒属病毒蛋白结构天然具有高度的保守性，因此由VACV可为其它多种正痘病毒例如猴痘病毒的感染，提供交叉保护。
痘病毒具有大型的基因组（130,000-375,000个核苷酸），因其允许插入和表达外来的大型基因，使得它们成为理想的基因工程苗载体。痘病毒复制周期中的许多特点都将影响其作为疫苗在使用中的功效。复制起始阶段，病毒核芯进入细胞，早期基因转录的结果将产出一系列免疫调节蛋白，可封阻机体抗病毒反应程序的启动，包括IFN的作用。经过现代研究表明，敲除或修改这些病毒基因是修改病
毒疫苗毒力的一种非常有效的手段。在其后的复制周期中，具有传染性的病毒粒子即可产生具有牛痘疫苗效果的病毒蛋白，并在病毒粒子成熟后从病毒的囊膜表面释放出来。通过基因敲除技术，改变病毒囊膜表面的特定蛋白（如B5R）也可以减弱病毒疫苗的毒力。
2.全球消灭天花运动前牛痘苗的发展
在人类对抗天花历史上，1000年前已有人进行人痘接种(Radetsky,1999)。人们从天花病人的脓胞液中获取天花病毒，经吹入法或划痕法给人群接种，这种方法虽会引起严重的局部反应、周身皮疹和全身症状，但它将由感染天花而导致的人群死亡率由20-30%降至0.5-2%。尽管并发症的发生几率比较高，但人痘接种还是被普遍的应用，直至19世纪初期。
因为痘病毒属成员的抗原都具有较高的同源性，所以经免疫后，人类几乎可以抵抗任何痘病毒属病毒的攻击。17世纪后期，爱德华·詹纳发现牛痘可以帮助人们预防天花。自从人们发现牛痘接种比人痘接种要安全以后，牛痘接种很快成为了最主要的免疫手段。随着时间的流逝，牛痘病毒疫苗已经取代了人痘疫苗成为免疫的主要制剂。众所周知，牛痘病毒疫苗在遗传上与人痘病毒和天花病毒皆有所不同，虽然它与马痘极其相近，但它的起源我们无从得知。詹纳的牛痘病毒是第一代痘病毒的代表。
3.第一代牛痘疫苗和全球消灭天花运动
人类是唯一一个已知的天花病毒的自然宿主。正是由于这个原因以及牛痘疫苗的确切功效，使得人们在1966年加紧了全球消灭天花计划。这项计划的基本策略是在每个地区建立监测系统，防止暴发流行。由于这些措施的有效实施，天花的发病率逐年降低，最后一个自然感染的天花病例出现在1977年的索马里。1980年5月，世界卫生大会发表声明，世界将不会再有自然发病的天花病人（Rotz.等人,2001; Wehrle，1980）。1982年，在美国唯一一家允许生产牛痘疫苗的厂家停止生产一般用牛痘疫苗，1983年普通人群也停止了疫苗的使用。在消灭天花病毒计划实施期间，这些疫苗的大多数是在活的绵羊、水牛及兔子的皮肤上生产的(Anon.,2002)。
在消灭天花计划过程中应用了许多病毒毒株。美洲和非洲西部用的是纽约市卫生局的毒株（NYCBH）。这个计划的相关研究一直在惠氏公司的实验室进行，并持续到2007年8月前。Dryvax?是唯一在美国可以有限制使用的商品化牛痘苗(Rosenthal et al.,2001)。Dryvax?牛痘苗是以NYCBH为生产毒株，感染小牛皮肤后收取淋巴液而获得的。EM-63毒株是NYCBH毒株的一个衍生，俄罗斯将它广
泛应用在印度消灭天花计划上(Anon.,2002)。李斯特毒株发现于英国李斯特实验室。1968年到1971年，李斯特毒株是世界各地使用最广泛的疫苗株(Rosenthal et al.,2001)。
4.大自然“赐予”的疫苗和疫苗接种的并发症
通常，人在接种后如果于接种部位出现水疱或皮肤脓疱病灶，则说明接种成功。随着人们对痘病毒的关注，一个感染人类重要的病原体——猴痘被发现，天花病毒也被纳入生恐怖武器之列，所以人们正在对牛痘病毒疫苗的使用，疗效和安全性进行重新评估(Kretzschmar.et al.,2006; Neff.et al.,2008; Parrino and Graham,2006)。发热是接种后的普遍现象，报告人称有5-9%的人超过100?F (37.7?C)，还有3%的人超过102?F (38.8?C) (Kretzschmar.et al.,2006; Rotz.et al.,2001)。而且还有许多人报告称接种后会有温和的全身并发症，包括头疼、肌痛、恶寒、恶心和疲乏。接种后的中等和严重并发症有种痘后湿疹（已接种者有湿疹或特异性皮炎历史）、全身性种痘反应，坏疽性牛痘（已接种者免疫受损）、心肌心包炎和种痘后脑炎（大部分是儿童）。每百万人接种疫苗大约有1-250人出现中等严重的并发症(Rotz.et al., 2001)。
原文出处：Bertram L,Jacobs,Jeffrey O,et al.Vaccinia virus vaccines:Past,present and future.Antiviral Research,2009,84:1~13