放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取
一、实验目的
1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法
2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法
3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论
4、了解小型发酵罐的基本结构
5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养
6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；
7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术
二、实验原理
①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。
②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临
床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。
③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。
抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比
例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式2.10-1)
V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)
式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；
UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；
SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；
SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；
（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3) 式中：θ：供试品和标准品的效价比；
D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1
I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
⑶求出Pr ：Pr = Ar×θ(式2.10-4)
式中：Pr：供试品实际单位数；
Ar：供试品标示量或估计单位
④甲醛滴定法测定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物，使NH3+上的H+游离出来，这样就可
用碱滴定NH3+放出的H+，从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果即可算出氨基氮的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值保持恒定。
甲基红的变色范围是PH4.4~6.2,意思是说:
1.其pH值在4.4~6.2区间时,呈橙色,
2.其pH值≦4.4时,呈红色,因是靠近酸性强的一边时的颜色,故又称之为酸色。
3.其pH值≧6.2时,呈黄色，因是靠近碱性强的一边时的颜色,故又称之为碱色
二、仪器与材料
（一）培养基
高氏一号培养基：
可溶性淀粉20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g
K2HPO40.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g
蒸馏水1000ml，PH 7.4，
发酵瓶培养基：
①淀粉3%,葡萄糖2%,黄豆饼粉2.5%,蛋白胨0.5% ,
酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%,KH2PO4, 0.03%,
CaCO3 0.4%, PH 6.0。
②黄豆饼粉4g,淀粉10g,酵母粉0.25 g ,蛋白胨1.5g,
MgSO40.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO40.3 g,
α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml. 100ml PH7.4-7.6
③可溶性淀粉2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，FeSO4.7H2O 0.001g，
加蒸馏水至100ml，PH 7.4，
牛肉膏蛋白胨
牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸馏水（1000mL），pH 7.2~7.4 发酵罐培养基(2L)：
黄豆饼粉80g 淀粉200g
酵母粉 5 g 蛋白胨30g
MgSO40.5 g CaCO38g
(NH4)2SO4 6 g
?-淀粉酶（105u/ml）0.2ml
（二)流加补料
碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸铵（10%）250ml,控制16%
调PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH
（三)分析指标及方法所用试剂及溶液
①测残糖-DNS法
1.3，5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：将6.3g的3，5二硝基水杨酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶
液中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000ml
2. 1.0mg/ml葡萄糖溶液：称取1g葡萄糖，加蒸馏水定容到1L。
3. 6mol/l氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠24g,加蒸馏水定容到100ml。
4. 6mol/l的盐酸：取浓盐酸49.68ml,加蒸馏水定容到
100ml。
测残氮的方法-甲醛法
1. 甲基红：0.1g甲基红，用95%乙醇定容100ml。
2. 0.3mol/LHCL：取浓盐酸2.48ml,加蒸馏水定容到100ml。
3. 0.02858mol/L NaOH：称0.11432g,定容100ml。
4. 1%酚酞指示剂：称取1g酚酞指示剂粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。
5. 95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。
6.18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红，定容到100ml。（四）器材
玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤、5L-发酵罐，无菌室、培养皿（直径9 cm）、
陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台，无菌培养皿，酒精灯，牛津杯，镊子，移液器等等
（五）.生物效价测定所需材料
（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为106个/mL。菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。
（3）培养基：效价检定用培养基1号。
（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30 min备用。
（5）草酸，10 M NaOH
四、实验步骤
⑴筛选高产放线菌
从土壤里筛选出高产放线菌，于斜面培养基中保藏
⑵接种
在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种针挖块约
0.5×1cm2，接种于灭过菌的高氏一号培养基中。
⑶培养
将接种好的种子摇瓶于28℃恒温室摇床上，转速为200r/min，培养48小时左右。
⑷实罐灭菌
1、将冷凝水管路断开，拔下电极，打开罐盖，将发酵培养基装入发酵罐及补料瓶，易产生泡沫的培养基尽量不要超过两升。
2、连接管路：取样管路连接，补料管路连接；空气过滤器用硅胶管与罐盖空气管连接，并用弹簧夹夹紧；排气口与过滤器用硅胶管连接；安装温度电极、pH电极、溶氧电极，pH电极用们帽盖紧电极上端口，溶氧电极用铝铂纸包裹电极上端口，防止受潮。盖紧其它罐盖接口。
3、提起玻璃罐体及补料瓶放入灭菌锅，盖好牛皮纸，盖好锅盖，确定发酵温度及时间。
4、灭菌结束后，尽快将罐放回原位并尽快通入空气。
⑸发酵操作
1、将灭菌后的罐体放回原位，连接冷凝水管路，通入冷凝水，连接通气管路，调整通气量至3～5L/min。
2、将温度电极、pH电极、溶氧电极与控制器连接。
3、补料管连接：打开补料蠕动泵防护盖，搬开进出口处的白色管夹，将硅胶管嵌入入口处的管夹并夹紧，用手转动泵头，将硅胶管沿凹槽安装直至出口处，开手动开关约十秒后夹紧出口处管夹，关手动开关；将酒精棉球放在罐盖补料口内，将针头插入并穿透密封盖；
打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液，置于自动状态。
⑹接种
将培养48小时的摇瓶种子接种于发酵罐中，使用接种圈放置酒精棉点燃，进行无菌接种，接入100ml种子。接种后立即进行第一次
取样。
⑺发酵生产
⑻发酵过程的测定：
①发酵液状态观察：粘度、颜色、气味、菌丝形态
②发酵中残糖的测定-DNS法：
1.取1.0mg/ml葡萄糖标准溶液，按下表加入试剂。沸水浴加热5min，冷水冷却定容至25ml摇匀，在520nm按波长测吸光度。
编号葡萄糖标准溶液/ml 水/ml 溶液糖含量/mg DNS试剂
/ml
0 0 2 0 1.5
1 0.
2 1.8 0.2 1.5
2 0.4 1.6 0.4 1.5
3 0.6 1.
4 0.6 1.5
4 0.8 1.2 0.8 1.5
5 1.0 1.0 1.0 1.5
6 1.2 0.8 1.2 1.5
7 1.4 0.6 1.4 1.5
8 1.6 0.4 1.6 1.5
2.取发酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的盐酸溶液2ml，在沸水溶液中加热15min水解，冷水冷却后及时6mol/l氢氧化钠溶液1.8ml，并定容到50ml的总糖水解液。
3.取总糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS试剂1.5ml 沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25ml摇匀，以空白作对照在520nm波长测吸光度。
氨基酸氮的测定：甲醛法(陈钧鸣和徐玲娣,1991)。取2ml发酵液滤液于三角瓶内,加蒸馏水10ml,甲基红指示剂2滴,用O.3MHCI调节pH至溶液呈红色,再用0.02858MNaOH溶液调pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,摇匀,静置10min,加l%酚酞指示剂8滴,用0.02858NNaOH标准溶液滴定至微红色为终点。氨基氮的计算公式为:氨基氮(mg/l00ml)=滴定体积*20。
⑼放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的
1、配制培养基高压灭菌。
2、倒平板。
3、涂布指示菌。
4、以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。
5、收集发酵液，缓缓加入草酸将发酵液酸化至pH 1.4- 3.0左右，70 ℃，2 min，以10000 rpm离心20 min。
6、取上清加入水稀释20%左右，在4℃，用10 M NaOH中和至pH6.4- 6.8。
7、吸取中和液100 μL 加入牛津杯中，37℃培养16hr，观察结果。
⑽效价测定
1. 称量
称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前1~2小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水
称样量的计算W=V*C/P (式2.10-4)
式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg）
V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL）
C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，μg/mL）
P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，μg/mg）
2.稀释
从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预
计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。3.双碟制备
在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径18~22 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。
4.放置钢管
用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置5~10 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5.滴加抗生素溶液
每批供试品取5~10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SH→TH →SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表标准品，T代表供试品，
H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入35~37℃恒温培养室，培养至所需时间。
6. 抑菌圈测量
用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。
五、结果与计算
根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。