唾液酸酶法与常规镜检法的临床应用比较 摘要：目的通过唾液酸酶检测法和白带常规镜检法的结果进行对比分析，探讨唾液酸酶法在细菌性阴道病（BV）中的诊断价值，为临床快速诊断BV提供可靠的方法。方法将480例患者按年龄分为四组（50岁），同时应用唾液酸酶法和常规镜检法检测，对比分析结果。结果唾液酸酶法的阳性率为17.91%，白带常规镜检法的阳性率8.75%，两种方法检测细菌性阴道病的阳性率的比较，差异有统计学意义（P50岁组的阳性率为最高（25.68%）。结论唾液酸酶法操作简便、快速，提高了阳性检出率和准确度，适合临床推广。 关键词：细菌性阴道病；阴道分泌物；白带常规镜检法；唾液酸酶法 Abstract：Objective To investigate the significance of sialidase test in diagnosis of bacterial vaginosis by comparing sialidase test with conventional microscopy，and provide rapid and reliable methods for diagnosis BV in clinic. Methods Sialidase test and conventional microscopy were used to determine 480 samples （50 years old group） and the results were analyzed comparatively. Results The positive rate of sialidase test for diagnosis BV was
丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC0380 规格:50T/48S 产品内容： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体1mL×1支，-20℃避光保存； 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：粉剂×1支，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 工作液的配制：临用前把试剂四、五、六、七转移到试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。 产品说明： PDH（EC4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本的处理 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃11000g离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。 2、每个样本需要900μL工作液，按样本数加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。 3、空白管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL水，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2，计算ΔA空白=A1-A2。 4、测定管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL样本，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。 三、PDH活性计算 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T =913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.828×(ΔA测定-ΔA空白) V反总：反应体系总体积，9.5×10-4L； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.05mL；
在有氧条件下丙酮酸能否在细胞质基质中分解成酒精和二氧化碳 丙酮酸是营养物质代谢过程的中间产物，有氧代谢时进一步分解为水和二氧化碳和ATP，无氧代谢时进一步分解为乳酸。 对于真核生物，细胞的有氧代谢是在线粒体中进行的，经过线粒体内膜上一系列的复合酶催化完成，最终产物为二氧化碳和水。细胞质基质中因没有反应所必需的复合酶，故无法进行该过程。 部分原核生物，细胞以细胞质膜内褶完成类似的活动，即在细胞质基质中完成。 综上，部分原核生物，在有氧且氧气不充足时，丙酮酸可能会在细胞质基质中分解成酒精和二氧化碳。 【急需】向分离出来的细胞质基质中加入丙酮酸，会反应吗？？ 答案上说能， 不是先由葡萄糖分解出[H]和丙酮酸，丙酮酸又和[H]反应生成酒精（酵母菌）和二氧化碳呀。 光放丙酮酸没有[H]呀，应该不能反应吧（原来不应该有[H]留着吧，有也应该反应了） 满意回答 作为一个高中生，你犯了大忌，就是把题目太当真。 首先说了是细胞质基质，那就只用考虑无氧呼吸了，因为没有线粒体。 以典型的呼吸过程为例，丙酮酸如果是产生酒精，则是丙酮酸先脱羧产生乙醛和二氧化碳，这个过程不需要NADH（也就是所谓的[H]），乙醛转变成乙醇则是需要NADH的。 如果丙酮酸是产生乳酸，那么确实需要NADH作为还原剂。 如果丙酮酸是产酸，则是在甲酸裂解酶作用下分解成甲酸和乙酸，也不需要NADH。 所以题目本身就是模棱两可的，因为根本没说明是什么细胞。而且我上面说的也仅仅是典型的代谢途径而已。更何况你怎么保证细胞质中的NADH都反应掉了？要知道有机反应基本都是不能完全反应的。 所以要在中国念好书，就别把高中的书本太当回事，进了大学你会发现好多都是不严谨不科学，甚至是错误的。
唾液酸（SA）测定试剂盒（神经氨酸苷酶法）适用范围：该产品用于体外定量测定人血清或血浆中唾液酸的浓度。 1.1 产品规格
1.2 组成成分 1.2.1 试剂组成 试剂1： Tris缓冲液 0.1 mol/L PH=7.0 神经氨酸苷酶 >0.2U/mL 乳酸脱氢酶 >2U/mL 试剂2： Tris缓冲液 0.1 mol/L PH=9.0 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH） >0.13mmol/L N-乙酰神经氨酸醛缩酶 >2U/mL。 1.2.2 校准品的组成 单水平的液体校准品，在水基质中添加唾液酸（60mg/dL），稳定剂<0.1%； 定值范围：(50-70)mg/dL。 1.2.3质控品的组成 两个水平的液体质控品，在牛血清（30g/L）中添加唾液酸（60mg/dL和150mg/dL），稳定剂<0.1%； 定值范围：（50-70）mg/dL、（120-180）mg/dL。 2.1 外观 液体双试剂：试剂1:无色至淡黄色液体，试剂2：无色至淡黄色液体。 校准品：无色至淡黄色澄清液体。
质控品：无色至淡黄色澄清液体。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 空白吸光度 在规定参数下，试剂空白吸光度≥0.8。 2.4 分析灵敏度 浓度为60mg/dL时，吸光度变化应≥0.005.。 2.5 线性 在(0，200]mg/dL线性范围内，线性相关系数r ≥0.996。在(0，50]mg/dL范围内绝对偏差不超过5mg/dL，在（50，200]mg/dL范围内的相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 变异系数CV应≤8% 2.7 批间差 不同批号之间测定结果的相对极差应≤10%。 2.8准确度 回收试验：回收率应在90%-110%范围内。 2.9 质控品赋值有效性 测定值在质控靶值范围内。 2.10校准品溯源性要求 根据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品控制物质赋值的计量学溯源性》及有关规定提供唾液酸校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容。校准品溯源至唾液酸纯品（Sigma）。
血气分析中血乳酸检测之临床意义？ 全测定在的应用 乳酸测定 §乳酸是糖()的。乳酸产生于骨胳，肌肉，脑和。经后由肾分泌。血乳酸测定可反映组织氧供和代谢状态以及量不足。乳酸水平的增高可见于多种临床疾病。 乳酸酸中毒 §相乳酸升高最常见于乳酸酸中毒，但也可与关联: –A型乳酸酸中毒：严重组织缺氧时发生，任何原因引起的组织缺氧将导致A型乳酸酸中毒发生。 –B型乳酸酸中毒：组织缺氧并不明显，但组织缺氧可同时存在。 A型乳酸酸中毒 § §严重 § § §局域性不足（组织缺氧） B型乳酸酸中毒 §药物引起 – – – –双呱类（药物） B型乳酸酸中毒 §疾病 –糖尿病 – –肝脏疾病 –(由于在血中的堆积，导致严重到可引起死亡的代谢性酸中毒和酮症的一类先天性代谢性疾病) –缺陷(影响糖类合成的酶缺陷) –缺陷(影响的疾病) – 正常参考范围 –
乳酸测定 §在以下科室或中检测乳酸有重要 意义： –外科手术(如) –重症监护科（ICU） – –（重点）实验室 乳酸测定临床应用 §心脏手术 §冠状动脉分流术 §体外膜氧合(交换膜式) §休克状况的评估 §内球囊植入术 §急诊科患者的分类救治 §创伤病人的评估 §的诊断 §烧伤患者 …… 开放性心脏手术 §通过血中乳酸测定对开放性心脏手术后进程的重要意义已经明确。通常手术后的恢复期，血中乳酸水平仅轻度升高，24小时至接近正常水平。若手术后的24小时内/后的血中乳酸结果不符合该模式，就需要进行容量支持、心脏、扩展和呼吸支持的治疗。 体外膜氧合(ECMO) §由于ECMO（体外循环交换膜式氧合作用）的强迫性与高费用，只有在病人的病情严重情况下才进行。血乳酸的测定作为是否需要进行ECMO的依据，也用来评价ECMO为组织供氧的效果。 休克状况的评估 §血乳酸升高常见于循环性休克的患者，循环性休克（严重）可由的减少（失血或脱水），心输出量减少或脓毒血症（）性血流紊乱等引起。虽然各种疾病的发生休克机理不一样，但休克情况下导致乳酸升高的原因似乎与组织缺氧或氧的利用缺陷有关。乳酸测定也同样用于疗效监测，如早期检测，乳酸结果可作为休克是否存在及严重性的重要指针，此时针对休克状况所采取的治疗措施是最为有效的。 冠状动脉分流术 §作为心肺分流术（CPB）的常规方法，需要诱导心动阻止，常引起乳酸的升高。如在CPB血乳酸检测峰值达到或超过L，手术后患者的死亡危险性更高。 §手术后，随着心脏血的再灌注，乳酸通常会降低。如再灌注后乳酸持续产生，即血乳酸浓度升高或不下降，表明心脏氧（）利用恢复到正常的延迟。这与功能降低相关，可能需要心脏兴奋剂或主动脉内球囊起博器的支持。 主动脉内球囊起博器植入术 §主动脉内球囊起博器植入术（IABP）有时作为在心外科手术遇到困难时的一种治疗手段。即便如此，其死亡率也是相当高的。如果有一个早期指标可提示
白带常规与BV唾液酸酶法联合检测的临床价值 发表时间：2013-12-10T12:57:52.687Z 来源：《医药前沿》2013年11月第31期供稿作者：朱建新 [导读] 在育龄期妇女的阴道感染性疾病中，细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎和滴虫性阴道感染是最为常见的妇科病。 朱建新（江苏省常熟市辛庄中心卫生院检验科江苏常熟 215500） 【摘要】目的对白带常规、BV唾液酸酶法在妇产科常规检查中的临床价值。同时观察BV合并霉菌滴虫感染情况。方法对本院妇产科门诊2012年11月至2013年10月321例阴道分泌物常规检查。通过盐水涂片法查找滴虫，进行革兰染色判断清洁度及检查念珠菌、线索细胞，通过唾液酸酶检测细菌性阴道病(BV)。结果清洁度Ⅱ度占31.46%；Ⅲ度占62.62%；Ⅳ度占5.92%；霉菌感染占20.87%；滴虫感染占3.43%；BV唾液酸酶法检测阳性占27.10%；念珠菌、滴虫和BV阳性混合感染占4.05%。结论白带常规与BV唾液酸酶法联合检测在妇科常规检查中两者都有其独立的临床价值，能更好的正确诊断、合理用药，规范治疗，提高治疗效果。 【关键词】白带常规 BV唾液酸酶法联合检测 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）31-0262-01 在育龄期妇女的阴道感染性疾病中，细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎和滴虫性阴道感染是最为常见的妇科病。特别是对于孕前女性阴道分泌物常规筛查，女性患有阴道炎症会引起产道感染和宫内感染，还会造成早产、胎膜早破、低体重儿、先天发育畸形等严重后果。现对本院321例阴道分泌物检测结果分析报道如下。 1 资料与方法 1.1 临床资料对我院妇产科门诊2012年11月至2013年10月321例阴道分泌物进行白带常规与BV唾液酸酶法联合检测。 1.2 试剂（1）0.9％的氯化钠溶液。（2）细菌性阴道病检测试剂盒（唾液酸酶法）。 1.3 仪器江元医疗AT-1600全自动细菌性阴道病检测仪。 1.4 检测方法通过显微镜检和形态学检测阴道毛滴虫、霉菌、线索细胞和清洁度。 （1） 0.9％氯化钠湿片法：阴道毛滴虫采用0.9％氯化钠湿片法高倍镜观察20个视野，找到波状运动的阴道毛滴虫可以判断为阳性。（2）革兰染色法：霉菌性阴道炎采用革兰染色法，油镜观察。霉菌可以找到革兰氏阳性孢子或假菌丝与出芽细胞相连接，成链状及分枝状。（3）细菌性阴道病检测（唾液酸酶法）：根据仪器操作规程与细菌性阴道病检测（唾液酸酶法）试剂盒操作规程操作。 1.5 白带常规清洁度判定标准：参照《全国临床检验操作规程》第三版。 2 结果 2.1 妇产科门诊321例白带常规与BV唾液酸酶法联合检测结果。见表（1）。 表（1） 321例白带常规与BV唾液酸酶法联合检测结果 3 讨论 通过阴道分泌物检查除了可以判断阴道有无炎症，还能进一步诊断炎症发生的原因。当清洁度达到Ⅲ、Ⅳ度时，多数情况下可诊断为阴道炎症（如滴虫性阴道炎、真菌性阴道炎和细菌性阴道炎）为炎症的治疗提供依据。单纯清洁度增高多见于非特异性阴道炎。在检查中发现有阴道滴虫可诊断为滴虫性阴道炎或滴虫感染。有阴道霉菌时可作为霉菌性阴道炎的诊断依据。此外，清洁度、阴道霉菌、阴道滴虫，它们与BV无直接关联。但患有滴虫性阴道炎和霉菌性阴道炎的患者由于其阴道内正常菌群数量减少，更易感染BV，也就是会出现合并感染。 镜检有线索细胞，但BV检测不一定是阳性。因为镜检时有人为带来的错误，而且现在主张线索细胞占20%以上才能判断线索细胞阳性。所以，如果把镜检有线索细胞就认为BV检测一定阳性这错误的观点用在诊断和治疗中，就会产生不良的后果。BV则是由于阴道内原有的菌群比例发生了改变，加特纳菌、厌氧菌占绝对优势而引起的阴道病症，和长期滥用抗生素有关，该病阴道黏膜无充血的炎症表现。在临床上，清洁度II度时，BV检测阳性率也占了一定的百分比。因此，白带常规与BV唾液酸酶法联合检测，在临床妇科病的诊断和治疗中有积极意义。 参考文献 [1] 《全国临床检验操作规程》第三版 324. [2] 辛华，占伏良等《白带常规找线索细胞检测细菌性阴道炎与Amsel、BV Blue结果比较》检验医学 2006,21(3) 307-308.
货号：QS2103 规格：50管/48样丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 测定原理： PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 试剂八：粉剂×1支，4℃保存; 工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆 器或研钵匀浆。 2、将匀浆600g，4℃离心5min。 3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。 5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W， 超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PDH活性测定。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm处，蒸馏水调零。 2、工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。 3、在1mL玻璃比色皿中加入50μL样本和900μL工作液，混匀，立即记录605nm处初始吸光 第1页，共2页
唾液酸测定试剂盒（神经氨酸苷酶法）适用范围：本品用于体外定量测定人血清中唾液酸的含量。 1.1规格 规格1： (试剂1：15mL；试剂2：5mL)； 规格2： (试剂1：30mL；试剂2：10mL)； 规格3： (试剂1：60mL；试剂2：20mL)； 校准品：（选配）: 规格1（0.3mL×1；1水平)；规格2（0.5mL×1；1水平)；规格3（1.0mL×1；1水平)； 质控品：（选配） 规格1（0.5mL×2；2水平)；规格2（1.0mL×2；2水平)。 1.2组成 试剂盒组成见表1 表1 唾液酸测定试剂盒组成
注：校准品及质控品赋值具有批特异性，每批次浓度详见标签。 2.1试剂 2.1.1外观 试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；组分齐全，液体无漏液；试剂1、试剂2为透明液体，不得有沉淀和絮状物。 2.1.2装量 每瓶不少于标示值。 2.1.3试剂空白吸光度 用指定的空白样品测试试剂（盒），在光径1cm下，在340 nmm处测定试剂空白吸光度≥0.8A，空白吸光度变化率≤0.01A。 2.1.4分析灵敏度 试剂测定75mg/dL被测物，吸光度变化≥0.01A。 2.1.5线性范围 2.1.5.1在[2，200] mg/dL内,相关系数R≥0.990。
2.1.5.2在[2，40] mg/dL内，线性绝对偏差不超过±4mg/dL；(40，200] mg/dL 内，线性相对偏差不超过±10%。 2.1.6 重复性 重复测试（75±15）mg/dL和（150±30）mg/dL样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于5%。 2.1.7批间差 测定（75±15）mg/dL和（150±30）mg/dL样本，所得结果的批间相对极差（R）应不大于10%。 2.1.8准确度 ）中加入一定体积高于200 mg/dL的唾液酸纯在正常浓度范围的临床样本（C 品（Cs）或由纯品配制的标准溶液，回收率应在90%-110%范围内。 2.2校准品 2.2.1外观 校准品为淡黄色液体。 2.2.2装量 每瓶不少于标示值。 2.2.3准确度 与配套试剂组成测试系统，指标要求同2.1.8。 2.2.4 校准品溯源性 根据GB/T21415-2008的要求，校准品溯源至工作校准品，工作校准品采用上海聚创医药科技有限公司SA试剂盒进行方法学比对赋值。 2.3质控品
丙酮酸（pyruvic acid PA）含量测定试剂盒使用说明 货号：BC0970 规格：50管/48样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。操作步骤： 一、丙酮酸提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的
比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。 2、取300μL样本+100μL试剂一于1.5mL EP管中，混匀，静置2min，加入500 μL试剂二，混匀，于520nm波长处测定管吸光值A。 三、丙酮酸含量计算： 1、标准条件下测定回归方程为y=0.0466x+0.0675；x为丙酮酸钠含量（μg/mL）， y为吸光值。 2、按照血清（浆）体积计算 丙酮酸含量（μg/mL）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6× (A-0.0675) 3、按照蛋白浓度计算 丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46× (A-0.0675)÷Cpr 4、按照样品质量计算 丙酮酸含量（μg/g鲜重）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675)÷W 5、按照细菌或细胞密度计算 丙酮酸含量（μg/104cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675) V1：加入反应体系中样本体积，0.3mL；V2：加入提取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）
可治性罕见病—丙酮酸脱氢酶E1-α缺乏症 一、疾病概述 丙酮酸脱氢酶缺乏症是一系列的较为常见的神经系统退行性病变，并伴随线粒体代谢异常的疾病，也是儿童高乳酸血症最常见的病因之一。其中，丙酮酸脱氢酶E1 -a缺乏症( pyruvate dehydrogenaseEl -a deficiency)是由于丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDH complex)中E1 -a亚基的缺陷造成的。编码El-α亚基的PDHA1基因位于Xp22.1上[1]。该病呈X染色体连锁显性遗传，其临床表现和生化缺陷存在较大的异质性。该病尚无明确的发病率和患病率报道，多为散发病例，男女发病率大致相等。 PDH复合物是细胞核基因编码的线粒体基质多酶系统，催化依赖硫胺素的丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A，将糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，在线粒体能量代谢中起重要作用。PDH复合物缺乏导致丙酮酸代谢障碍，造成乳酸堆积和能量生成不足，引起神经系统结构和功能异常。该复合物包括 3种酶：丙酮酸脱氢酶(E1酶)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2酶)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3酶)。E1酶的作用是移除丙酮酸上的羧基，并把乙酰基转给E2酶。El酶的a亚基是其活性部位，并且参与组成PDH复合物的核心结构。El-a亚基的缺陷可造成ATP生成减少和丙酮酸盐堆积，PDHA1基因突变是PDH复合物缺乏最常见的病因。ATP缺乏导致的能量供应不足对脑组织影响较大。丙酮酸盐堆积可导致丙酮酸盐、丙氨酸、乳酸之间的平衡被打破，最终引起乳酸酸中毒。ATP缺乏常引起肌张力低下、肌无力或运动不耐受等[2]。 二、临床特征 PDH复合物缺乏症患者的临床表现呈高度的异质性，发病年龄可从胎儿期至成人各年龄阶段，症状可从新生儿期的致死性乳酸酸中毒，到慢性神经功能异常伴大脑发育不全。本病一般在婴儿期和儿童早期发病，临床表现较复杂，主要累及代谢和神经系统。可有胼胝体发育不良、婴儿痉挛、Leigh病、复发性共济失调、慢性神经病变等。病情轻重及存活时间的长短取决于乳酸酸中毒的严重程度。患儿残存的酶活性越低，临床症状出现越早，血乳酸越高，死亡越早[3]。 男性患者可归纳为3类表型：一种是严重的新生儿高乳酸血症和大脑发育
全血乳酸(LA)测定在临床中的应用 急诊科苏中杰 【概况】：乳酸(Lactic acid, LA) 分子量90，是葡萄糖分子量的一半，是体内糖无氧代谢(糖酵解)的代谢终产物。主要由葡萄糖通过糖酵解途径在细胞浆中生成。乳酸主要产生于骨胳，肌肉，脑和红细胞，经肝脏代谢后由肾脏分泌排泄。血乳酸测定可反映组织氧供和代谢状态以及灌注量是否不足。 乳酸水平的生理性增高可见于剧烈运动所致的肌肉痉挛等，但病理性增高则最常见于乳酸性酸中毒等多种临床疾病，而与呼吸性碱中毒也有关联。 A型乳酸酸中毒：严重组织缺氧时发生，任何原因引起的组织缺氧将导致A型乳酸酸中毒发生。常见于休克、严重哮喘、一氧化碳中毒、心衰、局域性血流灌注不足（组织缺氧）。 B型乳酸酸中毒：组织缺氧存在但并不明显。包括： （1）.药物引起者有：酒精中毒、阿斯匹林、氰化物、双呱类（糖尿病药物）。 （2）.疾病引起者有：糖尿病、恶性肿瘤、肝脏疾病、甲基丙二酸血症(由于甲基丙二酸在血中的堆积，导致严重到可引起死亡的代谢性酸中毒和酮症的一类先天性代谢性疾病)、糖原酶缺陷(影响糖类合成的酶缺陷)、脂肪酸氧化缺陷(影响脂肪酸分解的疾病)、脓毒血症。 血浆乳酸的正常值为1.0士0.5mmol／L， <2mmol／L均可视为正常，大于此值即可诊断为“高乳酸血症”。在危重病人，虽然低灌注和缺氧是“高乳酸血症”的重要原因，但不是唯一的原因，儿茶酚胺分泌增加和碱中毒等也可因促进糖酵解而增加乳酸含量。此外，肝功能下降导致乳酸摄取减少也会造成血乳酸增加。由此可见，血浆乳酸水平可受许多非循环因素的影响，单纯的“高乳酸血症”并不足以判断外周灌注不足和缺氧。但在上述情况下，乳酸水平一般不会很高，往往<5mmol ／L，称为“中度高乳酸血症”。同时由于缓冲系统通常是正常的，一般不会伴有酸
细胞唾液酸化相关酶的荧光成像检测新方法研究糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它们在各种基础生命活动的过程中起重要作用,并且对机体的恶性转化特别敏感。绝大部分聚糖的生物合成发生在细胞的内质网和高尔基体中,然而即使在糖蛋白生物合成之后,聚糖结构的修饰依然在酶催化作用下不断的进行着,这一过程称为聚糖重构。 聚糖重构主要受两类酶的催化作用,糖基转移酶和糖苷水解酶,它们的作用分别为生成和降解糖苷键。由于细胞的糖基化程度通常与疾病,尤其是肿瘤,密切相关,因此糖基转移酶和糖苷水解酶作为潜在的药物靶点和肿瘤诊断标志物引起了研究人员的极大兴趣。 唾液酸化是糖基化中一个备受关注的分支,可以在附着于蛋白质或脂的聚糖链末端位置引入唾液酸(N-乙酰神经氨酸),肿瘤细胞中唾液酸的表达普遍是异常的。糖缀合物上唾液酸的表达主要受唾液酸转移酶和唾液酸酶的活性的影响。 然而在大多数情况下,肿瘤细胞中唾液酸化异常改变的机理,唾液酸化相关酶的活性与唾液酸化聚糖的表达之间的相互关系仍然未知。为了阐明唾液酸化相关酶的生物学和病理学功能以及使其作为疾病诊断和治疗的工具,发展检测唾液酸转移酶和唾液酸酶活性的新方法已成为迫切需求。 因此,本工作将化学生物学,细胞学和分子生物学等进行交叉结合,并利用荧光显微技术,纳米材料等,设计发展了新型分析检测方法和纳米探针,对肿瘤细胞中唾液酸转移酶,唾液酸酶的活性分别进行了原位无创检测,为研究聚糖生物合成机理、肿瘤临床诊断和药物开发提供了有力工具。具体包括以下两个部分工作:1、基于化学选择性识别的活细胞内唾液酸转移酶活性检测唾液酸化的聚糖结构是由唾液酸转移酶(Sialyltransferase,ST)催化合成的,为了阐明唾液酸转移
丙酮酸脱氢酶复合体 成都医学院?检验医学院检验一队4班任亮 摘要：丙酮酸脱氢复合体广泛存在于动物、植物和微生物体内。主要是附着于线粒体上。丙 酮酸脱氢酶复合体是2-氧（代）酸脱氢酶复合体中的一种。丙酮酸脱氢酶复合体是一种限 速酶。主要作用是催化丙酮酸不可逆的转变为乙酰辅酶A，同时将NAD+还原成NADH，后 者进入呼吸链产生ATP。丙酮酸脱氢酶复合体还使得糖的有氧氧化中的糖酵解途径和三羧 酸循环联系了起来。 关键词：丙酮酸脱氢酶复合体；调控机制；蛋白质的结构和功能 一、丙酮酸脱氢酶复合体的组成 丙酮酸脱氢酶复合体是由三种酶以及相应的辅助因子形成，因物种的不同其各种成分的所占比例不同。丙酮酸脱氢酶复合体的分子量为7×106kDa。 第一种酶为丙酮酸脱氢酶（E1），它的辅助因子是焦磷酸硫胺素（ThDP），所以这种酶是ThDP依赖型酶。它是以α2β2四聚体的形式存在。α、β亚单位的分子量分别是41和36kDa。 第二种酶为二氢硫辛酰胺转乙酰酶（E2），它的辅助因子是硫辛酸，所以这种酶是硫辛酸依赖型酶，它的分子量是52kDa。 第三种为二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3），它的辅助因子是FAD，所以这种酶是FAD依赖型酶，它的分子量是55kDa，是以二聚体的形式存在。 此外，在高等生物的体内还有丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）、E3蛋白结合酶（E3BP）和NAD+、CoA-SH。 二、丙酮酸脱氢酶复合体的结构 每个丙酮酸脱氢酶复合体是由30个E1、60个E2和12个E3构成的，其中60个E2相互紧密连接但是以非共价键的形式形成的核心部分，而每个E2的亚单位都是由形成核心部分的内部区域和形成外部延伸部分的“Super arm”构成的，所以一个丙酮酸脱氢酶复合体就会有60个外部延伸部分。E1是以非共价键的形式连接在E2的外部延伸部分的E1结构区域。E3则是通过E3连接蛋白与E2的核心部分相连的。 三、丙酮酸脱氢酶复合体的作用机制 在丙酮酸脱氢酶复合体总的催化反应中。首先是丙酮酸在Mg2+( Mg2+结合在 ThDP 的磷酸基团上)存在下脱去的羧基与丙酮酸脱氢酶的辅助因子ThDP 形成羟乙基OThDP, 丙酮酸脱氢酶与 ThDP在α、β亚单位之间的深沟内结合。然后，羟乙基被氧化并将乙酰基转移到 E2,，即二氢硫辛酸乙酰转移酶的硫辛酰基形成中间产物乙酸硫酰胺，同时释放出ThDP，接下来在二氢硫辛酸乙酰转移酶催化下，乙酰硫酰胺上的乙酰基从乙酰硫辛酰基转移给辅酶A ，形成乙酰辅酶A。最后二氢硫辛酸脱氢酶E3 与二硫化物结合，被还原的硫辛酸重新氧化并将氢递给它的辅基FAD。在氧化和脱羧过程中硫辛酸充当乙酰基载体和电子传递体。
丙酮酸含量测定 一、目的：丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。 二、原理：植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯阱反应，生成丙酮酸一 2 ， 4 一二硝基苯踪，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。 三、仪器、试剂、材料 1、1.5 mol/L NaOH 2、 8% 三氯乙酸 3、 0.1% 2,4 一二硝基苯肼 4 、丙酮酸标准液 5、.材料大蒜的鳞茎。 四、操作步骤 1、.植物材料提取液的制备 称取 0.5—1g大蒜于研钵内加适量 8% 三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用 8% 三氯乙酸洗入 25ml 容量瓶，定容至刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。取约 10ml 匀浆液离心（ 4000 r/min ） 10min ，上清液备用。 2、标准曲线制作（略） 3、.组织液中丙酮酸的测定 取 1. 0ml 上清液于一刻度试管中，加 2ml 8 ％三氯乙酸，加 1.0ml 0.1％2.4 －二硝基苯肼液，摇匀，再加 5.0 ml 1.5mol/L, NaOH 溶液，摇匀显色，10min 后在 520 nm 波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查得测定管的丙酮酸含量。 五、结果处理
丙酮酸含量（mg/g鲜重）=A*V*稀释倍数/样品重(g)*1000
式中， A 为在标准曲线上查得的丙酮酸的微克数。 V为提取液体积。 六、注意事项 1. 所加试剂的顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加 8% 三氯乙酸，最后加 1.5mol/ L NaOH 。 2 .应反应 10min 后再比色。
附件6 唾液酸检测试剂盒（酶法） 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对唾液酸检测试剂盒（酶法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对唾液酸检测试剂盒（酶法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 唾液酸检测试剂盒（酶法）是指基于分光光度法原理，利用全自动生化分析仪、半自动生化分析仪或分光光度计，对人血清、血浆或其他体液中的唾液酸含量进行体外定量分析的试剂。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监
督管理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管…2013?242号），唾液酸检测试剂盒（酶法）管理类别为Ⅱ类，分类代号为6840。 目前唾液酸(SA)含量的测定方法主要有比色法和酶法两种方法。比色法是一种直接测定方法，如间苯二酚法、Ehrlich 法、色氨酸、过氧化氢法、氢氯酸和硫乙酸法等；酶法是一种间接测定方法，国内常规检测为酶偶联速率法，一种是利用丙酮酸氧化酶的比色法，另一种是利用乳酸脱氢酶的紫外分光光度法。 详情如下： 1.丙酮酸氧化酶法 原理：血清中的SA受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺；其中丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成H2O2，借助于Trinder反应，在POD 作用下生成有色醌，引起540nm波长下吸光度的上升。通过测定其540nm波长下的吸光度变化，与经过同样处理的校准品比较，即可计算出样品中SA的含量。 2.乳酸脱氢酶比色法 原理：血清中的SA受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺；其中丙酮酸与NADH在乳酸脱氢酶（LDH）作用下生成乳酸和NAD+，引起340nm波长下吸光度的下降。通过测定340nm波长下的吸光度变化，与经过同样处理的校准品比较，即可计算出样
第八章生物氧化 1.生物氧化：物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内彻底分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。 2.生物氧化中的主要氧化方式：加氧、脱氢、失电子 3.CO2的生成方式：体内有机酸脱羧 4.呼吸链：代谢物脱下的成对氢原子通过位于线粒体内膜上的多种酶和辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水，这一系列酶和辅酶称为呼吸链，又称电子传递链。 NADH →复合物I→ CoQ →复合物III →Cyt c →复合物IV →O 产2.5个ATP (2)琥珀酸氧化呼吸链:3-磷酸甘油穿梭 琥珀酸→复合物II→ CoQ →复合物III → Cyt c →复合物IV →O 产1.5个ATP 含血红素的辅基：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶 5.细胞质NADH的氧化:胞液中NADH必须经一定转运机制进入线粒体，再经呼吸链进行氧化磷酸化。 转运机制 （1）3-磷酸甘油穿梭：主要存在于脑和骨骼肌的快肌，产生1.5个ATP （2）苹果酸-天冬氨酸穿梭：主要存在于肝、心和肾细胞；产生2.5个ATP 6.ATP的合成方式： （1）氧化磷酸化：是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。 偶联部位：复合体Ⅰ、III、IV （2）底物磷酸化：是底物分子内部能量重新分布，通过高能基团转移合成ATP。 磷/氧比：氧化磷酸化过程中每消耗1摩尔氧原子（0.5摩尔氧分子）所消耗磷酸的摩尔数或合成ATP的摩尔数。 7.磷酸肌酸作为肌肉中能量的一种贮存形式 第九章糖代谢 一、糖的生理功能：（1）氧化供能 （2）提供合成体内其它物质的原料 （3）作为机体组织细胞的组成成分 吸收速率最快的为-半乳糖 二、血糖
全血乳酸(LA)测定在临床中得应用 急诊科苏中杰 【概况】：乳酸(Lactic acid, LA) 分子量90，就是葡萄糖分子量得一半，就是体内糖无氧代谢(糖酵解)得代谢终产物。主要由葡萄糖通过糖酵解途径在细胞浆中生成。乳酸主要产生于骨胳，肌肉，脑与红细胞，经肝脏代谢后由肾脏分泌排泄。血乳酸测定可反映组织氧供与代谢状态以及灌注量就是否不足。 乳酸水平得生理性增高可见于剧烈运动所致得肌肉痉挛等，但病理性增高则最常见于乳酸性酸中毒等多种临床疾病，而与呼吸性碱中毒也有关联。 A型乳酸酸中毒：严重组织缺氧时发生，任何原因引起得组织缺氧将导致A型乳酸酸中毒发生。常见于休克、严重哮喘、一氧化碳中毒、心衰、局域性血流灌注不足（组织缺氧）。 B型乳酸酸中毒：组织缺氧存在但并不明显。包括： （1）、药物引起者有：酒精中毒、阿斯匹林、氰化物、双呱类（糖尿病药物）。 （2）、疾病引起者有：糖尿病、恶性肿瘤、肝脏疾病、甲基丙二酸血症(由于甲基丙二酸在血中得堆积，导致严重到可引起死亡得代谢性酸中毒与酮症得一类先天性代谢性疾病)、糖原酶缺陷(影响糖类合成得酶缺陷)、脂肪酸氧化缺陷(影响脂肪酸分解得疾病)、脓毒血症。 血浆乳酸得正常值为1、0士0、5mmol／L， <2mmol／L均可视为正常，大于此值即可诊断为“高乳酸血症”。在危重病人，虽然低灌注与缺氧就是“高乳酸血症”得重要原因，但不就是唯一得原因，儿茶酚胺分泌增加与碱中毒等也可因促进糖酵解而增加乳酸含量。此外，肝功能下降导致乳酸摄取减少也会造成血乳酸增加。由此可见，血浆乳酸水平可受许多非循环因素得影响，单纯得“高乳酸血症”并不足以判断外周灌注不足与缺氧。但在上述情况下，乳酸水平一般不会很高，往往<5mmol／L，称为“中度高乳酸血症”。同时由于缓冲系统通常就是正常得，一般不
神经氨酸酶检测试剂盒 产品编号产品名称包装 P0306 神经氨酸酶检测试剂盒 100次 产品简介： ?神经氨酸酶检测试剂盒(Neuraminidase Assay Kit)是一个用荧光法快速高灵敏度检测神经氨酸酶酶活性的试剂盒。?本试剂盒可以检测来源于不同生物的神经氨酸酶的酶活力，包括禽流感病毒的神经氨酸酶的酶活力。 ?试剂盒中提供了纯化的神经氨酸酶作为阳性对照，便于检测体系的建立。 ?试剂盒中提供了可以被神经氨酸酶催化产生荧光的底物，该底物被神经氨酸酶催化后可以产生较强的荧光，从而实现了对神经氨酸酶的快速高灵敏检测。 ?一个包装的本试剂盒可以检测100个样品或标准品。 包装清单： 产品编号产品名称包装 P0306-1 神经氨酸酶检测缓冲液 10ml P0306-2 神经氨酸酶50μl P0306-3 神经氨酸酶荧光底物1ml P0306-4 Milli-Q水 1.2ml — 说明书1份 保存条件： -20℃保存，半年有效。 注意事项： ?相同体积的情况下，样品中神经氨酸酶的酶活力不宜高过试剂盒中所提供的标准品的酶活力。单位体积内酶活力过高会导致荧光底物相对不足，使测定出来的酶活力低于实际的酶活力。如果样品中酶活力过高，可以适当稀释后再进行测定。 ?神经氨酸酶和神经氨酸酶荧光底物尽量避免反复冻融。 ?试剂盒中所用溶液溶解后4℃保存，两天有效。如果两天内不能全部用完，建议尽早把留作以后使用的神经氨酸酶和神经氨酸酶荧光底物适当分装后-70℃保存，-20℃冻存也可，但有效期会较短。其余试剂直接-20℃或-70℃保存即可。 ?需使用荧光酶标仪，并需自备专门用于荧光酶标仪荧光检测的96孔荧光酶标板。或使用可以检测小体积样品的荧光分光光度计。使用荧光分光光度计时参考荧光酶标板的操作方法。 ?由于荧光检测非常灵敏，测定出来的荧光强度有时容易产生波动。一方面要避免灰尘等掉入检测孔中产生荧光干扰，另一方面所有检测最好在同一块检测板上做双份平行检测甚至三份平行检测。 ?为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.阳性和阴性对照检测的准备(参考表1)： a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液。 b.每孔再分别加入10或0微升神经氨酸酶。 c.每孔再加入10微升溶解神经氨酸酶的溶液。例如神经氨酸酶在RIPA溶液中，则加10微升RIPA溶液。 d.每孔再加入0或10微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。 2.样品检测的准备(参考表1)： a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液。 b.每孔再加入10微升神经氨酸酶样品。 c.每孔再加入10微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。 3. 检测(参考表1)： a.振动混匀约1分钟。 b.每孔加入10微升神经氨酸酶荧光底物。 c.再振动混匀约1分钟。