细胞培养基本理论
一细胞培养概述
细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。
克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。
特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。
器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。
特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。
细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，
生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。
三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异
呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态.
细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型
细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。
按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型
贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞
处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞
贴壁型细胞形态比较
成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源
上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等
游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期
多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
四贴壁型细胞的生长特点：贴附和伸展；接触抑制；生长的密度限制
接触抑制（Contact inhibition）：细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；正常细胞并不互相重叠生长，但转化的细胞或肿瘤细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。
生长的密度限制（Density Inhibition）又称：密度依赖性调节）正常细胞接触汇合成单层后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制导致细胞分裂停止。而转化细胞或肿瘤细胞的密度依赖性调节常常降低，能生长至较高的终末细胞密度。
生长过程单个细胞的生长过程——细胞周期（cell cycle）
细胞系的生长过程——培养细胞的生命周期（Life Span of Culture Cells）
每代细胞的生长过程
原代培养期与细胞系
原代培养（primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。
细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。
细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖
克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
传代培养期（Passage）
在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。
?细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。
?一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。
衰退（老）期（senescence）
?一般有限细胞系在此期的细胞增殖缓慢，并逐渐完全停止，进而发生衰退和死亡。
?其特点是端粒酶进行性缩短，直到最后细胞不能再进一步分裂。
?例外：生殖细胞、干细胞和转化细胞（肿瘤细胞）
?
组织培养细胞一代生存期分为潜伏期；指数增生期；停滞期
实验室组成基本要求便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察
基本需要实验准备、无菌操作、控制培养
基本组成基本实验室：消毒准备室、制备室、无菌操作室
辅助实验室：细胞学实验室生化分析室摄影室及暗室
消毒准备室配备包括实验台，高压灭菌锅、排风灭火设备、干热消毒柜、超声波清洗器、洗瓶机等。
制备室配备包括低温冰箱、天平、真空负压泵、PH计、旋转混合仪、水浴箱等。
基本设施配置基本设备；灭菌设备；无菌操作设备；光温控制设备；细胞培养设备；细胞学鉴定设备
灭菌设备包括蒸汽压力灭菌锅；干热消毒柜；过滤灭菌装置；喷雾消毒器；紫外灯
消毒物理消毒射线、紫外线、干热、湿热、滤过
化学消毒来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸、70%酒精
无菌操作设备
原理：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤，净化或垂直气流的状态送出，从而形成无菌洁净工作环境。
分类：垂直流/水平流超净工作台；单边操作台，双边操作台；普通操作台，医用（生物）操作台。
维护：检查滤膜，定期清洗，更换。
基本设施配置之一
?生物安全柜根据主要几项生物安全柜国际标准的规定，安全柜可分为一级、二级和三级三大类以满足不同生物研究和防疫的要求。安全柜的分类级别与生物安全
登记无关。
一级生物安全柜：保护工作人员和环境，而不保护样品。排气口安装有HEPA过滤器。自带风机，依赖外接通风管中的风机带动气流。
二级生物安全柜：可提供对样品，环境，工作人员的保护。排气口安装有HEPA过滤器，独有特征是具有垂直层状薄片（无定向的）HEPA过滤器。内置风机，形成下沉气流;无自带风机，依赖外接通风管中的风机带动气流。
三级生物安全柜:为3－4级实验室生物安全等级而设计，柜体完全气闭。通过手套进行操作，俗称“手套箱”。实验品通过双门的传递箱进出。适用于高风险的生物实验。
二级生物安全柜的使用：确认通风橱已经打开，并且空气正在循环；把框格降低到刻度处；不要阻碍空气流通；使用前用70％乙醇擦拭台面；不要使用酒精灯；减少手臂再通风橱内晃动
基本设施配置之二光温控制设施包括时间程序控制器；空调及温度感应器
基本设施配置之三
细胞培养设备温度37℃±0.5℃；CO2浓度5%；相对湿度100%；定期清洗、消毒
基本设施配置之四固定角式转子；水平转子；垂直转子注意：1000 RPM 10 MIN配平基本设施配置之五细胞学鉴定设备（倒置显微镜;荧光显微镜;酶标检测仪;流式细胞仪）
三常用器皿、器械(解剖器具\培养器皿\移液器\特殊用具)
?解剖器具主要用于解剖动物、取材和原代培养中切割组织。常用的手术器械有手术刀柄及刀片、组织剪、眼科剪、镊子、尖镊、止血钳、持针器等。各种器械至少
要准备两套，以备轮换消毒用。各种金属器械使用后，及时刷洗干净，用干净纱布
拭干，上一薄层液体石蜡，以防生锈。消毒法采用高压蒸汽灭菌或采用70％乙醇浸
泡消毒。
?培养器皿如溶液瓶、培养瓶、培养皿、培养板等。多孔培养板材料仅有塑料的一种，适宜少量细胞和单克隆生长，也适宜进行分组比较的生化、药理、毒理等方面
的实验，其规格主要有6孔，12孔、24孔、96孔培养板。
?移液器电动移液器、微量移液器、多通道微量移液器
?特殊用具细胞筛网、细胞刮刀、细胞计数板
天然培养基最普遍使用的天然培养基是血清，基本以小牛血清最为普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。常见使用最为5-20%。
血清培养基的主要问题：1血清的准确成份、含量仍不清楚。2批间差异大，保存期短，标准化和连续性受到限制。3非生理学液体，可能促进/抑制某些细胞生长。4含有细胞毒性物质（补体、抗体、细菌毒素等）。5取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。
6价格昂贵
合成培养基根据细胞所需物质的种类和数量,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。
显示剂：酚红谷氨酰胺
?无血清培养基(serum free medium,SFM)
不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
?无蛋白培养基（protein free midium,PFM）不含有动物蛋白的培养基。
?限定化学成分培养基(chemical defined medium, CDM)
不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。
常用培养基
?MEM细胞培养基系列
DMEM细胞培养基系列
RPMI-1640细胞培养基系列
199细胞培养基系列
水解乳蛋白细胞培养基
欧氏平衡盐
F-10,F-12细胞培养基系列
其它类型细胞培养基
常用干粉培养基的配置
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些
根据实验需要决定。
配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。
所用器皿应严格消毒。
配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
五、实验室操作注意事项做好实验前准备，避免反复进出而增加污染机会
进入细胞培养室前需更换工作服,换鞋并洗净、消毒双手。
注意无菌室内的紫外灯
室内常规用品不准随意拿出室外，所有物品不得挪作它用
冰箱内的培养液要注明姓名、配制日期，不随便使用他人的培养液，以免交叉污染 注意各类设备运行状态，发现问题及时报告
实验完毕，及时清洁工作台面，将使用过的实验用品移出无菌室
定期对无菌室进行消毒灭菌
细胞因子的检测方法：
1) 生物学方法①依赖性细胞株：生物分析法②功能检测：生物分析法
2) 分子生物学方法①分子杂交技术：mRNA的测定②多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定
3）免疫学方法①免疫测定：免疫酶技术②功能测定与抗体抑制
抗体检测技术1）免疫酶技术2）免疫荧光技术3）间接血凝试验4）放射免疫测定5）蛋白印迹6）免疫共沉淀
酶联免疫吸附测定(ELISA)
实验原理ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性
按一定步骤进行抗原抗体反应
加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析
检测方法：1.直接法2.间接法 3.双抗体夹心法4.双夹心间接法
一、试剂及仪器准备
（一）免疫吸附剂
1.固相载体⑴要求：①吸附力强②能保持Ag或Ab活性③不参与化学反应
⑵载体性能比较①载体材料：+、- 结果差别大②ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV<10% ⑶常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等；形状：小试管、小珠、微量反应板
2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：⑴包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法⑵封闭：包被后在用1—5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰
㈡酶结合物：
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm) 四甲基联苯胺
(TMB)：蓝色(450nm)
4. 酶结合物的制备：⑴戊二醛交联法⑵过碘酸盐氧化法
（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪
操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。
二、操作步骤（间接ELISA法）
1.样本的收集；
2.包被抗原；
3.封闭；
4.加稀释的待检样品；
5.加酶标抗抗体；
6.加底物显色；
7.终止反应
（一）样品的收集和保存：
注意事项1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用于HRP的辅基)；2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”；3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”；4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增加； 5.标本中含NaN3，可出现假“-”。
（二）包被：将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
包被的条件pH9.6 碳酸盐缓冲液；pH7.2 磷酸盐缓冲液；pH7-8 Tris-HCl缓冲液。
加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜或37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml
最适工作浓度的选择：棋盘滴定法
包被抗体和酶标抗体工作浓度：将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度，反应后显色。阳性值在0.8左右，阴性值小于0.1为最适，可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度
方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度
（三）封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附常用封闭剂：1%的BSA；10%的小牛血清或1%明胶; 5%脱脂奶粉,比较价廉
（四）加样抗原或抗体：纯化抗原/抗体(天然但干扰多)、合成抗原/抗体(多肽分子较小，常有空间位阻)、基因抗原(与片段的选择和制备水平有关)
（五）加酶标抗体酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂
?纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检
标本中不存在相同的酶
?酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易
于测定等
?在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等
（六）显色
?显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显
色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加
强。适当提高温度有助于加速显色进行。
?TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实
验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色
（七）结果判定拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中
以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算
结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"
1. 定性测定：在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔
2.定量测定：测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
三、基本操作注意事项
（一）加样:在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡（二）孵育：ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的孵育温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
（三）洗涤
目的：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这
种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
四、实验中常出现的问题
1. ELISA出现“一片黄”的原因：⑴酶结合物浓度过高⑵底物不新鲜⑶洗涤不干净
2.ELISA出现“一片白”的原因：⑴载体吸附性能差⑵底物错⑶稀释液作包被液⑷加错试剂⑸包被时间过短⑹酶活力低或下降⑺样品含有NaN3
间接ELISA法操作步骤1.样本的收集；2.包被抗原；3.封闭；4.加稀释的待检样品；5.加酶标抗抗体； 6.加底物显色；7.终止反应
凋亡时细胞的形态学改变
1.细胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，结构更加紧密
2.染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段
3.胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由胞膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)。凋亡小体内可含细胞浆、细胞器和核碎片，有的不含核碎片
4.凋亡小体被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，细胞内容物不释放出来，所以不引起炎症反应
坏死（necrosis）是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应
?细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。
?细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种
因素的干扰方面都起着非常关键的作用。
细胞凋亡过多引起的疾病
?艾滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减少
?移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞死亡
?缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞的凋亡增多
?神经系统退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson…s病）
细胞凋亡过少引起的疾病
?肿瘤：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病
?自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮
?各种病毒感染：腺病毒、疱疹病毒、痘病毒感染
三. 细胞凋亡的过程及特征
1凋亡信号转导当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后，细胞产生复杂的生化反应，并形成与凋亡有关的第二信使：cAMP ,Ca2+,神经酰胺等信号分子形成死亡信号。
2. 凋亡基因激活调控的凋亡基因在接受死亡信号后，开始按预定程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶和相关物质。
3. 凋亡的执行凋亡的主要执行者有两类酶：核酸内切酶（Dnase ）彻底破坏细胞的生物命令系统；Caspases 3 —细胞的结构全面解体
4.凋亡细胞的清除凋亡后细胞可以被邻近巨噬细胞分解
凋亡时细胞的生化特征变化
1.胞浆内Ca2+浓度升高。
2.细胞内活性氧增多。
3.质膜通透性变大。
4.DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp为基数的有序片段。
5.Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。
1.DNA 的片段化由于核酸内切酶激活，基因组的DNA 在核小体连接区发生非随机性降解，产生寡核小体片段，其大小相当于核小体（180 ～200bp ）的倍数。在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性的“梯”状（ladder pattern ）条带
2.钙依赖蛋白酶可导致细胞膜的改变—磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露
四、细胞凋亡的发生机制
?氧化损伤机制氧化应激（oxidative stress）指机体活性氧产生过多或抗氧化能力
下降，活性氧的清除不足，导致活性氧在体内积聚并引起氧化损伤的病理过程。
氧化应激引起细胞凋亡的可能机制
1.DNA受损激活P53基因
2.生物膜损伤膜通透性↑ΔΨm↓Ca内流↑DNase ↑脂质过氧化产物↑
3.多聚ADP核糖合成酶活化，NAD＋耗竭，ATP大量消耗
4.可活化NF-kB、AP-1，加速细胞凋亡相关的一些基因表达
?钙稳态失衡机制
钙稳态失衡诱导细胞凋亡的机制
1.激活Ca2＋/Mg2＋依赖的DNase
2.激活谷氨酰胺转移酶（GTase），促进凋亡细
胞中蛋白广泛交联，有利于凋亡小体的形成 3.激活Ca2＋敏感的蛋白酶核骨架蛋白酶核基质蛋白丝氨酸蛋白酶膜蛋白 4.激活核转录因子，加速促凋亡基因的转录
?线粒体损伤机制线粒体损伤诱导细胞凋亡的机制
线粒体的功能改变表现为线粒体内膜通透性↑线粒体内膜的跨膜电位（Δψm）↓
能量合成水平↓
细胞凋亡相关基因
?促凋亡基因P53 p53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。p53基因在人
类肿瘤有关基因的突变率最高，人类肿瘤的50％以上是由p53基因的缺失造成的
?抑制凋亡基因Bcl2家族Bcl2是一种原癌基因，是ced9在哺乳类中的同源物。Bcl2
能延长细胞的寿命，但不促进细胞增殖，能抑制细胞凋亡
?caspase家族与凋亡caspase是近年发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的
半胱氨酸蛋白酶，它们可特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。切割的结果是使某些蛋白活化或失活，由此细胞凋亡
?天然的caspase抑制剂细胞凋亡失机体用来清除病毒、防止其进一步感染的一种
机制，而病毒也发展出一种对抗机制──抑制caspase的活性，来逃避或阻止凋亡的发生。痘病毒蛋白CrmA和杆病毒蛋白p35就是这样的天然的caspase抑制剂五.细胞凋亡的检测(一) 细胞凋亡的形态学检测(二) 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）(三) 线粒体膜势能的检测(四) DNA片断化检测(五) TUNEL法(六) Caspase-3活性的检测(七) 凋亡相关基因的基因芯片检测(八) 有关基因表达的检测
(一) 细胞凋亡的形态学检测
1.光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态
2.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡。
常用的DNA特异性染料：Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时可发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，使用时用PBS稀释成终浓度为2～5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色，使用终浓度一般为0.5～1mg/ml。
荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜结果判定
?Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态
?Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化
?Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体
透射电子显微镜观察
?凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩
?凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构
?Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，
产生凋亡小体
（二）磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法
1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5-1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照
2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞
3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
注意事项 1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞
2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测
（三）线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低
方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度
注意事项1始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位2与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化
（四）DNA片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段,或180-200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)
1．DNA Ladder 测定
方法：收获细胞，加入细胞裂解液，13000 rpm 5min, 收集上清。1% SDS和RnaseA 2h。蛋白酶2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜。14000 rpm 15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer。1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。
本实验虽然具有较高的诊断价值，但缺点是敏感性差，需较大量的凋亡细胞才能显示出阳性反应，此外不能定位发生细胞凋亡的部位。
2. 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡
根据正常、死亡细胞对某些DNA结合荧光染料的通透性不同来加以区别，其实质是检测细胞内DNA含量。最常用的PI（碘化丙啶）染色法，此外尚有丫啶橙、溴乙锭染色法等。方法：收集细胞，70%冷乙醇4℃固定过夜, PBS洗涤，1000rpm 10min。RNase A消化30min，PI（50mg/ml）染色，室温避光15min。FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。
该法具有快速、可定量、检测细胞数量大等优点。不足是不能区分凋亡细胞与坏死细胞，不能检出早期凋亡细胞，对有S期或G2/M期阻滞的细胞凋亡漏检率较高等。
3. LM-PCR Ladder Assay
当凋亡细胞数量少及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接用琼脂糖电泳可能观察
不到核DNA的变化。CLONTECH公司的LM-PCR Ladder Assay Kit 通过LM-PCR (ligation-mediated PCR), 连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而检测细胞凋亡。
优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。
（五）TUNEL法脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL ）是检测细胞凋亡较常用的方法。
主要原理：细胞凋亡中DNA断裂是内切酶的作用，其断端3 ′-OH暴露，这是凋亡细胞DNA断裂的特征，以此区别细胞坏死DNA断裂。
TUNEL是一种将生化技术与免疫组化相结合，在组织切片或细胞涂片上显示细胞凋亡的新技术。由于不需要模板，每一标记处平均掺入4个左右的标记dUTP，因此敏感性较高。但多次实验亦证实，由于该方法敏感性较高，会使固定不当或具有基因转录活性的非凋亡细胞也出现阳性反应，即假阳性较明显。
（六）Caspase-3活性的检测
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
1. Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物PARP的裂解。方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜转移→封闭→加Caspase-3多抗或单抗→TBS-T洗3次→加HRP-标记的二抗→TBS-T 洗3次→显色。
2. 荧光分光光度计分析
原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收获细胞正常或凋亡细胞。PBS洗涤，制备细胞裂解液。加Ac-DEVD-AMC ，37 ℃反应1h。荧光分光光度计分析荧光强度
3. 流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞。PBS洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37 ℃反应1h。UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
(七) 凋亡相关基因的基因芯片检测
基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）技术指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
(八) 有关基因表达的测定利用原位杂交、免疫组化等方法，检测bax、bcl-2、c-myc、p53 等凋亡相关调控基因的表达水平。
单克隆抗体的制备
一、抗体的定义免疫球蛋白：结构概念抗体：功能概念
与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白
?抗体生产技术的三个时代多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体
?基因工程抗体:人源化全人源小型化噬菌体抗体库
二、单克隆抗体(monoclonal antibody) 由一个B淋巴细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”。针对一个抗原决定簇，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体?特点：特异性强、性质均一、易于大量生产
三、单克隆抗体的制备生物方法：病毒诱导物理方法：电融合化学方法：PEG融合
融合前的准备抗体检测方法的建立;针对抗体的特异性：ELISA ;针对抗体使用目的;WB 细胞染色;免疫组化
小鼠的标记(1)染色法（常用）3.5%－5%的苦味酸溶液;先左后右，从前到后;双色：双位数
(2)打孔法(3)戴环法
免疫小鼠
(1)一般选择健康8-12周龄的雌性BALB/C小鼠：融合用骨髓瘤细胞多来自此品系小鼠
(2)常用的免疫途径：腹腔注射：完全福氏佐剂---初次;不完全福氏佐剂---加强
静脉注射
脾内包埋、注射：抗原少、快速、高效
(3)一般要经过初次免疫、加强免疫、冲击免疫三个过程
(4)免疫前取血作阴性对照，加强免疫时取血检测特异性抗体的产生和效价，决定冲击免疫和融合时机
免疫流程 1.每只小鼠100μg抗原与完全福氏佐剂等量混匀，腹腔注射2. 2~4周后，同量抗原加不完全福氏佐剂追加免疫一次（检测抗体效价，必要时重复步骤2）
3.同量抗原不加佐剂静脉冲击免疫一次
4.冲击免疫后3~4天获取小鼠脾细胞
亲本细胞的选择
骨髓瘤细胞：1.本身不分泌抗体2.次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞
B淋巴细胞：1.经特定抗原免疫能产生目的抗体2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系3.细胞准备
复苏小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞，培养至细胞对数生长期
融合收集小鼠脾细胞1.取血：阳性血清、减少脾内红细胞2.处死小鼠3.消毒小鼠：75%
酒精浸泡4.取出脾脏：分层打开、更换器械5.分离脾细胞：研磨法、
注射法6.离心收集（1500rpm,5min）
无血清培养基分别冲洗脾细胞和骨髓瘤细胞各三遍
细胞计数：脾细胞/骨髓瘤细胞=2-10/1
融合：均在37℃水浴中进行，加入融合剂时需连续搅拌
1.1min：0.7ml PEG加入混合细胞中
2.2min：继续搅拌
3.3min：1ml无血清培养液
4.4min：3ml无血清培养液
5.5min：加至30ml
6.离心：800-1000rpm,5min
7.加入HAT选择培养基
8.铺板
9.注意事项
1. PEG：MW 1000~4000 浓度30%~50% 作用时间
2. 培养液缓缓加入：渗透压改变
3. 加入和倾倒PEG时均需彻底
融合细胞的选择原理: HAT选择培养基荧光流式细胞仪（FACS）分选
A. HAT选择培养基
?1964年Littlefield首先发明了HAT (H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin 甲氨喋呤，T—Thymidine 胸腺嘧啶核苷) 培养基的选择培养
?HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的
B. 荧光流式细胞仪分选（FACS法）
两种颜色荧光素分别标记两种融合细胞:异硫氰酸荧光素（FITC）,罗丹明
筛选同时有两种荧光素的融合细胞所筛细胞直接接种96孔板
融合后的管理
?换液
1.Day 3：半量换液
2.Day 7：半量换液
?观察融合细胞生长状况，有无细胞克隆的出现
?检测
1.一个高倍视野大小
2.检测上清
3.间接法
4.筛选阳性孔入24孔板扩增
?亚克隆
1.软琼脂克隆法
2.有限稀释法(常用) ：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个
细胞
亚克隆细胞的培养
1.添加饲养细胞：胸腺细胞
2.提高血清浓度：20%
3.添加细胞因子：IL-6，胰岛素
?多次亚克隆（2-3次）
1.确保每个孔中只有来自于一个细胞的克隆群
2.淘汰核型不稳定的克隆，获得稳定基因型和稳定分泌抗体的克隆
?体外培养
1.培养上清中的牛血清可能干扰抗体活性，影响纯化效果
2.逐步降低培养基中血清浓度20%-10%-5%-2.5%-1%-0 把握时机
3.专用无血清培养基
4.生物反应器（Bioreactor）
?体内培养
1.小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，诱导含有大量单克隆抗体的腹水
2.将对数生长期杂交瘤细胞洗涤后重悬于无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中注射
3.接种前一周需用降植烷处理小鼠腹腔，抑制腹腔免疫系统，有益于杂交瘤接种
4.抗体效价高，但可能被小鼠自身抗体污染
实验内容
?腹腔注射小鼠眼眶取血处死小鼠原代脾细胞的分离
腹腔注射：
①用左手拇指和食指紧紧抓住颈部背的皮肤，手掌成杯状紧握鼠背，同时用小指压住
尾根，固定好动物
②抬高小鼠腹部，右手将注射器的针头刺入左下腹皮肤
③针尖通过腹肌后抵抗力消失，固定好针尖，缓缓注入液体
④为避免刺破内脏，可将小鼠头部放低，尾部抬高，使脏器移向横膈处
小鼠眼眶采血：
先将鼠倒持，压迫颈部，使眼球突出充血，酒精棉球局部消毒，用毛细管或塑料管沿眼角向后、下方插入眼底静脉丛，血可从毛细管中自然流出
脾细胞分离：
①拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒体表
②用剪刀依次剪开小鼠腹部皮肤和腹膜，暴露腹腔，取出脾脏，剃除周围结缔组织和脂肪，无血清培养液冲洗一次后置于100目不锈钢网中
③轻轻研磨脾脏，并用无血清培养液冲洗，收集脾细胞悬液，以1000rpm 离心5min，弃上清，重悬浮于不完全培养液中
抗原抗体应用
一、抗体的分离纯化及测定
1.抗体的分离纯化按照分离方法分类，大致分为沉淀、盐析、膜技术、电泳以及色谱等方法。只有色谱和电泳可用于抗体的精细分离即纯化。
1）盐析原理：蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度而变化。蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，致使蛋白质分子相互聚集而沉淀。
盐的选择：硫酸氨、硫酸镁、硫酸纳、氯化钠、磷酸钠等。
注意的问题：盐的饱和度、PH、蛋白浓度、温度、脱盐。
2）膜分离技术以多孔膜进行过滤或过筛子的过程。滤膜，透析带，超滤管等。
通常超滤膜的孔径在1～100nm之间，截留的分子量在几百到一百万，所需的驱动压力在0.1～1.0 MPa左右。
3）色谱法也称为层析法。分离的本质是溶质在流动相和固定相之间分配的差异。
使用最多的是离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱。
A．凝胶色谱是体积排除色谱的一种，溶质与填料以及流动相之间没有额外的相互作用，只依据其分子体积的大小而分离。
常用的有交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
B．离子交换色谱通过酯化、醚化或氧化等化学反应，在合成的高聚物型凝胶上引入具有碱性或酸性离子基团。含有阳离子基团时，可交换阴离子样品，称之为阴离子交换树脂；反之为阳离子交换树脂。
C．亲和色谱利用抗原、半抗原与其抗体，蛋白A和一些抗体之间，具有专一性的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的。
蛋白A——大部分哺乳动物的IgG
蛋白G——机制相似，能力不同，与蛋白A互补。
蛋白L——专一的与K链结合
蛋白H——很强的种属专一性和温度依赖性。
组氨酸——IgG
金属鳌合亲和色谱——MCAC 常用Zn2+、Ni2+、Cu2+等。
2．抗体的测定
包括抗体纯度、含量、抗体活性、抗体特异性以及抗体亲和力的测定等几个方面。
1）抗体特异性的测定：
ELISA测定法
放射免疫测定（RIA）：利用核素示踪法的高灵敏度和抗原－抗体免疫学反应的高特异性。免疫荧光测定：FITC、Rhodamine
2）抗体含量及免疫活性的测定
检测杂交瘤上清中McAb的含量一般用夹心ELISA。
高效液相色谱（HPLC）法测定抗体含量
毛细管电泳（CE）测定抗体含量
3）抗体亲和力的测定抗体的亲和力（affinity）指的是抗体与其抗原相结合的紧密程度，
亲和力越强，则结合越牢固。
决定抗体亲和力除了抗体结合位点与抗原决定簇的空间构型的适合度外，抗体抗原分子间的分子键、库仑引力、范德华引力，反应条件如pH等也有一定的作用。
亲和力的测定方法Scatchard分析竟争结合方法硫氰酸盐洗脱法非竞争酶免疫实验二、抗体的规模生产抗体的规模生目前大量制备单抗的方法主要有两大系统。
动物体内生产法是国内外实验室所广泛采用
体外培养法
动物体内生产单抗
?通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/C
小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得。
?操作简单、经济
?腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白，很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动
物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。
体外培养生产单抗的方法
要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。
单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。
体外培养生产单抗目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统。
悬浮培养系统采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体
细胞固定化培养系统包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统
悬浮培养法：目前小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。
微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。
可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为
基质的产品。微载体培养的基本方法上与悬浮培养相同。研究表明，该法是杂交瘤
细胞大培养的理想途径之一。
中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。用于细胞培养的中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、多聚碳酸硅等材料制成。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，其孔径只允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单抗等）有滞留作用。
目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式、板框式和中心灌流式。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。
微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。
三．抗体的应用基础研究诊断治疗预防
1抗体的基础研究
1）抗体功能抗体阻断病原体入侵宿主细胞；抗原抗体结合后激活补体，对病原体产生杀伤作用；ADCC；ADCI干扰病原体的营养代谢；某些抗菌素和杀虫药有抗体依赖性2）组织定位，受体定位，结构研究
3）抗原纯化eg: 亲和层析
4）定量
5）分类（型）eg: 病毒分型, 寄生虫种群分类, CD细胞分型
后基因组时代重要的研究工具
2抗体在疾病诊断中的应用
1）抗体检测
2）抗原检测
3）免疫复合物检测国内诊断试剂80%依靠进口，每年约25亿人币。
各类细胞因子检测eg:双抗体夹心定量
放射免疫显像和导向技术
免疫病理检测
免疫诊断技术的发展趋势
⑴单克隆抗体（MAb）将部分取代多克隆抗血清。
●MAb特异性强，只与抗原分子上某一抗原决定簇结合。
●质地始终如一，重复性好。
●可用少量不纯抗原、全细胞和组织粗提物作为免疫原。
●可大批量生产。
●免疫诊断技术的发展趋势
⑵将用Fab‘或F( ab’)2片段而不是整分子IgG，因为片段可除外Fc 的干扰，进一步提高检测的特异性。
⑶双抗体夹心ELISA法引入放大系统可使敏感度提高10-100倍，检测抗原水平达ng/ml，高于放射免疫测定的pg/ml水平。
⑷双特异抗体（BsAb）和抗独特型抗体（anti-idiotypic antibody），重组抗原，肽抗原等
更多地用于免疫诊断。
⑸定量技术的发展，有助于提高诊断和基础研究水平。快速诊断技术如金标渗滤法，试条
法（dip-stick）有助于ELISA进入家庭自我检测。
⑹无损伤性检测如尿液唾液、粪便中的抗原或抗体检测技术将从实验室研究进入现场应用。
⑺自动化、标准化、操作程序的发展有助于提高诊断效率和获取结果的客观化。
⑻单一功能的免疫诊断技术正在发展中并逐渐应用于临床和现场，如能考核疗效，确定感染程度、病期，评估疫苗接种效果，预测发病的相关指标，提示免疫力水平等。
(9) 多表位检测技术：如液体蛋白芯片、Luminex等正在发展中。
3抗体在疾病治疗中的应用
肿瘤自身免疫性疾病器官移植心血管疾病感染性疾病其他
抗体的治疗机制：阻断和中和作用Fc的免疫效应机制信号传导和细胞凋亡免疫调节靶向抑制肿瘤的生长
●中和/封闭抗体
●靶向抗体、生物导弹
●激发性抗体
●其它如溶栓等
（1）免疫治疗
●自身免疫性疾病的治疗
●抗移植反应T细胞
●中和病毒抗乙脑疫苗
●Anti-id用于抗肿瘤、抗病疫苗
●生物导弹技术组成：载体、药物连接方法：化学、免疫学、分子生物学
（2）抗体在变态反应性疾病中的应用许多变态反应与IgE有关。血清IgE水平与哮喘、
遗传性过敏症的症状严重程度相关，提示中和IgE活性的抗体治疗可能有效。
（3）抗体的抗肿瘤作用关于单抗的临床应用，研究最早投入最多的是抗体对肿瘤的治疗。
●Rituxan是针对CD20抗原的的嵌合抗体，用于治疗淋巴瘤
●Herceptin是人源化的鼠IgG1抗体，能识别人表皮生长因子受体2（HER2）蛋白
抗原，后者大约在30%的人乳腺癌细胞上表达。
?抗体在肿瘤治疗中存在的问题
●抗体对实体癌的疗效显著低于血液系统肿瘤；
●聚集于肿瘤的抗体达不到一定数量；
●抗体的组织穿透力弱：抗体在肿瘤内沉积具差异性，完整抗体主要分布在实体瘤的
周边部分，只有少量穿透，应用抗体分子片段也不能均匀分布到肿瘤细胞；
●肿瘤细胞的抗原表达具广泛的异质性，合适的肿瘤特异性抗原很少；
●出现对治疗用抗体的免疫反应。
4．抗体在免疫预防中的应用丙球多克隆抗体
抗独特型抗体疫苗替代抗原用于诊断疫苗
●抗独特型抗体
在肿瘤治疗中的应用主要是利用其对肿瘤相关抗原模拟作用及对免疫网络的调节作用，较之常规疫苗有下属优点：
1、对糖类的肿瘤抗原，抗独特型抗体可将之转化为蛋白性抗原，从而更易于刺激T细胞的反应及引起IgG型抗体的的产生。
2、抗独特型抗体可大量获得，而通常肿瘤相关抗原的纯化颇为困难。
3、由于抗独特型抗体可调节免疫网络，较之单纯的抗原免疫更易获得有效的免疫保护及打破免疫耐受。
?单抗药物在肿瘤治疗领域具有优势。
?每一个基因都可能产生几种甚至几十种不同形式的蛋白质，每一种蛋白质都是一种
抗原，它包含数种乃至上百种抗原表位。人的一生中会接触到上百万种自身与外源性抗原，一个人的一生中可以产生针对上百万个抗原的抗体。
?每一个新抗原表位及单克隆抗体的发现和功能的确定及与疾病关系的建立，都具有
新的知识产权。抗原表位组学和抗体组学是建立在基因组学和蛋白组学基础上的新兴系统生物学及免疫学学科，以大规模高通量建立抗原表位库及抗体库为特色，将大大加速药物靶标筛选及抗体组药物的研发进程。
?抗体组药物是在基因工程药物、基因组药物和传统的抗体药物研发的基础上利用基
因组学、蛋白组学、免疫组学、抗体组学、抗原表位组学及系统生物学的最新研究成果，结合鼠、兔、人及重组单克隆抗体技术，经过大规模建立抗原表位库及抗体库，高通量筛选研发抗体药物。
?与传统的抗体药物研发生产相比，抗体组药物研发是以高通量、整体化、信息化和
系统化为特色。
?一方面大大提高了抗体药物的开发速度，缩短了药物开发的周期。
?另一方面由于抗体组药物的筛选利用了基因芯片、蛋白芯片和组织芯片等技术，这
样既可以获得广谱的抗体药物又可以生产个性化的抗体药物，应用领域更加广泛。
细胞生物学实验： 《细胞生物学实验》是高等教育出版社出版的一本书籍，作者是王崇英、高清祥。 内容简介： 《细胞生物学实验(第3版)》在保留第2版简明、可操作性强等特点的基础上，删除了相对陈旧和不适用的实验，增加了反映目前细胞生物学研究现状和发展趋势的实验，并对每个实验的结构体系进行了调整，强化了要点提示及注意事项，增加了预期实验结果。全书共3篇7章42个实验和11个附录。第一篇7个实验介绍了“普通光学显微镜”、“特殊光学显微镜”、“激光扫描共聚焦荧光显微镜”、“双光子激光扫描荧光显微镜”和“电子显微镜”的原理及使用方法；第二和第三篇从基础性、综合性和设计性实验层面安排了35个实验，涵盖了“细胞形态结构和生理活动”、“细胞分裂与染色体标本制备”、“细胞培养、遗传转化及基因表达”、“染色体分析技术”以及“细胞周期与细胞凋亡”等内容，旨在培养学生的基本实验技能和综合创新能力；附录部分提供了“实验室注意事项”、“实验报告的书写要求”、“离心机转数与离心力换算表及公式”、“常用缓冲液的配制”和“常用细胞生物学词汇”等资料。书后附有部分实验的彩色图片和照片。《细胞生物学实验(第3版)》配有数字课程（基础版）网站。网站内容包括部分实验内容的录像片段、彩色图片和照片，供学有余力的学生学习和教师教学参考。《细胞生物学实验(第3版)》适合作为综合性大学、师范、农林、医学等院校相关专业本科生的细
胞生物学实验教材使用，也可供研究生、相关科研及实验技术人员参考。 目录： 第一篇显微镜技术 光学显微镜及其使用 普通光学显微镜及其使用 特殊光学显微镜及其使用 暗视野显微镜 相差显微镜 偏振光显微镜 微分干涉相差显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜和双光子激光扫描荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜 双光子激光扫描荧光显微镜 电子显微镜及其使用 透射电子显微镜技术 透射电子显微镜的原理、用途与使用方法 透射电子显微镜样品制备(超薄切片) 扫描电子显微镜技术 扫描电子显微镜的原理、用途与使用方法 扫描电子显微镜样品制备
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
细胞生物学实验 实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的] 通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。 通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。 [实验原理] 应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。 该实验完成需时6学时。 [实验材料、试剂和仪器] 一、仪器 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。 二、材料 洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。 三、试剂 生理盐水，10μg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存） [实验步骤] 一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。 2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。 4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。 5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生
细胞生物学实验测试题 1、试述荧光显微镜的原理和用途。（并操作） 原理：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 （滤光镜片：获得所需波长的激发光；光源：高压汞灯） 用途：荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研 究的工具之一。 2、试述酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤。 原理：酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的标志酶，通常酸性磷酸酶在pH 为5左右时发挥作用能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸 铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，需再与黄色的硫化 铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。其反应过程如 下： β-甘油磷酸钠+酸性磷酸酶→甘油+PO43- PO43-+Pb(NO3)2 →Pb3(PO4)2↓ Pb3(PO4)2+(NH4)2S →PbS↓(棕黑色) 主要步骤： 1、前处理：获取小白鼠或大白兔腹腔液（猪肝） 2、制片： （1）、将腹腔液（肝细胞悬液）滴一滴于冰冻的干净载玻片上，用牙签涂开，自然干燥。 （2）、放入10%中性福尔马林固定液中固定30min。 （3）、蒸馏水中漂洗,3-5次。（洗去固定液） （4）、磷酸酶作用液，37°C，30Min。 （5）、蒸馏水中漂洗3次，5min一次。（洗去游离铅离子） （6）、1%硫化铵处理（3-5min）; （7）、吉姆沙染液复染15min;（使细胞核、轮廓显示出来） （8）、制片观察。 结果：阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。 对照实验：标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min，使酶失去活 性，做好标记，其他步骤相同。 3、试述DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤。 原理：DNA经稀盐酸（1mol/L HCL溶液）处理后，可使嘌呤碱与脱氧
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
细胞生物学实验讲义 实验一不同细胞形态观察、大小测量，结构比较 一、实验目的 利用光学显微系统对生命的基本组成单位——细胞进行观察，了解不同细胞的形态、结构和大小区别。 二、实验原理 细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构入手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。 三、实验内容和步骤 A、血涂片的制作 1．取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的载玻片作为推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载玻片保持30～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。 2．操作 ①将干燥血片用甲醇固定3-5分钟。 ②将固定的血片置于被pH6.4 -6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的Giemsa染液中，浸染10-30分钟（标本较少可用滴染法）。 ③取出用水冲洗，待干后镜检。 注意： ①取血滴不宜过多，以免涂片过厚，影响观察。 ②要使涂片厚薄均匀、拿片角度和速度都要适中，用力要均匀。涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。 ③涂片一般在后半部为好，白细胞在边缘和尾端较多。 B、洋葱表皮临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水 2)用刀片在洋葱鳞片叶内侧表皮上，划出2-5平方毫米的小方格，然后用镊
子撕下方格内的表皮放在载玻片的水滴中。 3)用镊子将表皮展平。 4)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的水滴，慢慢放平。3.染色 1)用滴管在盖玻片的一侧滴适量稀释的碘酒。 2)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸染液。 4.观察 C、人的口腔上皮细胞临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水。 2)用凉开水漱口，取消毒牙签在口腔侧壁上轻刮几下，将刮下的碎屑在载 玻片的液滴中涂抹均匀。 3)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，慢慢放平。 3.染色 a)用滴管在盖玻片的一侧滴适量碘液。 b)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸碘液。 4.观察 四、实验准备 1.器材：普通光学显微镜，牙签、酒精棉球、载玻片。 2.材料：洋葱表皮，口腔上皮，血涂片，永久制片。 3.试剂：碘液，Giemsa染液，生理盐水，甲醇，香柏油。 五、作业 描绘你所观察到的各种细胞的结构及大小（以比例尺表示）。 1、血液涂片（必做）。 2、永久制片，洋葱表皮，人口腔上皮选做其一。 实验二植物细胞微丝束的观察 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝R250染植物细胞内微丝束的方法。了解在微丝束细胞内的分布特点。 二、实验原理
细胞生物学实验教案 【经典学习资料，收藏必备】
实验一、细胞形态结构与几种细胞器的观察 【实验目的】 在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。 【实验原理】 细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等，一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。 （自拍图） （a）（b） （c）（d） 图 1 细胞形态结构 a. 柿胚乳细胞示胞间连丝； b. 马蛔虫受精卵分裂中期示中心粒； c. 兔的神经细胞中高尔基体； d.小鼠肝细胞线粒体 【实验仪器、材料和试剂】 1. 仪器：复式显微镜、擦镜纸 2．材料：洋葱根尖切片、小白鼠肝切片、兔神经节切片、马蛔虫受精卵切片3．香柏油或石蜡油、二甲苯 【方法与步骤】
一、洋葱根尖切片细胞的观察 先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。 二、兔神经节细胞切片高尔基体的观察 先在低倍镜下找到兔神经节细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞内淡黄色的背景上有黄褐色的细胞核，核的周围分布着许多深褐色的（硝酸银镀染）高尔基体，呈弯曲的线状，颗粒状，少量分散在细胞质。 三、小白鼠肝细胞切片线粒体的观察 先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被苏木精染成深紫色的线粒体，呈颗粒状和线状。 四、马蛔虫受精卵切片中心体的观察 1．取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。 实验一、细胞的显微测量 【实验目的】 掌握显微测微计的基本原理及使用方法。 【实验原理】 细胞长度、面积、体积的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。在显微镜下用来测量细胞长度的工具叫显微测量计，由目镜测微尺（ocular micrometer）和镜台测微尺（stage micrometer）组成，两尺要配合使用。目镜测微尺是放在目镜内的一直径为2cm圆形玻片上，里面有100等分格的刻度尺。每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而不同。镜台测微尺是一块特制的载玻片，在它的中央由一片圆形盖片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺全长为lmm，分为100等份的小格，每小格的长度为0.01 mm（10μm），标尺的外围有一小黑环，便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、解剖剪、解剖镊、注射器、载玻片、盖玻片、试管、无菌采血针 （二）材料：血涂片 （三）试剂：生理盐水、瑞氏（Wright）染色液 【方法与步骤】
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
细胞生物学实验 班级：生科142 姓名：旷江 学号：10143131 组号： 2 小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞 华东理工大学 应用生物学系
摘要 本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。 关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构
Abstract The cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life. Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization）
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
第五章物质的跨膜运输与信号传递 一．教学目标：1深刻理解被动运输、主动运输和内吞外排的概念，以及物质跨膜运输的重要意义；2．理解细胞信号传递的主要特点，掌握甾类激素信号 通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路和EGF受体信号通路的主 要环节。 二．重点：跨膜运输的方式和细胞通讯的信号通路。 三．难点：跨膜运输的机制。 四．授课方式与教学方法：讲授、讨论、多媒体辅助教学。 五．教学内容: 细胞膜是细胞与细胞外环境之间的一种选择性通透屏障，物质的跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要。多细胞生物是一个繁忙而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢与能量代谢，还有赖于细胞通讯与信号传递，以协调细胞的行为。 第一节物质的跨膜运输 一.被动运输（passive transport） ◆定义：通过简单扩散或协助扩散实现物质由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。转运的动力来自物质的浓度梯 度，不需要细胞提供能量。 ◆类型：简单扩散（simple diffusion）、协助扩散（facilitated diffusion） ◆膜转运蛋白： ?1.载体蛋白（carrier proteins）——通透酶（permease）性质； 介导被动运输与主动运输。 ?2.通道蛋白（channel proteins）——具有离子选择性，转运速率高；离子通道是门控的；只介导被动运输膜转运蛋白通道蛋白(被动运输)膜转运蛋白 载体蛋白单运输 (被动运输+主动运输) 共运输 协同运输 对向运输 细胞膜上的运输蛋白： 载体蛋白：通过构象变化运输物质 通道蛋白：形成通道、运输物质 载体蛋白:膜上一类转运蛋白，可特异的、可逆的与某物质结合，通过构象变化将物质从膜的一侧运到另一侧。又称通透酶，与运输物质的结合与酶的动力学相似。 通道蛋白:形成亲水的通道，允许一定大小和一定电荷的离子通过。因运转的几乎都是离子，又称离子通道. 通道蛋白形成通道：
第二节细胞生物学实验方法与技术 细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体
细胞生物学实验汇总
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。