第四章酶工程制药
教学目的
掌握：酶工程的概念
熟悉：固定化酶、固定化菌体的定义和特点
教学重点
固定化酶
计划学时：4
酶工程制药是生物制药的主要技术之一，主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。
药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。
酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效物质的技术过程。主要包括酶的催化反应、酶的固定化、酶的非水相催化等。
第一节概述
酶是生物催化剂。
所有生物体在一定条件下都可以合成多种多样的酶。生物体内的各种生化反应，几乎都是在酶的催化作用下进行的，所以酶对于生物体的新陈代谢是至关重要的。
一、酶的催化特性
酶是生物催化剂，具有催化剂的共同性质，即可以加快化学反应的速度，但不改变反应的平衡点。
1 酶的专一性强
2 酶的催化效率高
3 酶的作用条件温和
二、影响酶催化作用的主要因素
(一) 底物浓度对酶催化反应的影响
酶催化反应的底物即酶所作用的物质。根据参与反应的底物数量的不同，可分为单底物反应和多底物反应。
单底物反应只有一种底物发生变化。水解酶催化的水解反应有水参与，但由于水的量很大，可视为其浓度是恒定不变的，也属于单底物反应。
多底物反应是有两个或多个底物参与的反应。其底物浓度对反应速度的影响较为复杂，根据底物与酶的结合顺序，可分别用有序机制(Ordered bi bi mechanism)、随机机制(Random bi bi mechanism)和乒乓机制(Ping—pang bi bi mechanism)解释。
1单底物反应中底物浓度对酶促反应速度的影响
从图4—1可以看到，在底物浓度较低的情况下，反应速度与底物浓度成正比。
当底物达到一定浓度时，反应速度的上升不再与底物浓度的增加成正比，而逐步达到一个极限值(最大反应速度V m)。
1902年，Henri根据图4—1的结果，提出中间产物学说。
1913年，Michaelis和Menten提出快速平衡(Rapid equilibrium)理论，运用数学方法推导出米氏方程。其推导过程基于下列三点假设：
(1) 所测定的酶促反应速度为反应的初速度。在反应刚开始的—段时间内，产物的量很少，因
此由P十E逆反应生成ES的可能性可不予考虑。
(2) 底物浓度[S]大大超过酶的浓度[E]，ES的生成对底物浓度没有明显的影响，可用起始的底
物浓度[S]进行计算。
(3) 酶和底物结合生成中间产物ES的速度显著大于ES生成产物的速度。即在反应开始后，E
＋S＝ES快速达到平衡，ES生成产物的速度不足以破坏这个平衡。
根据上述三点假设，推导出米氏方程：
式中v－反应速度
v m－最大反应速度
K s－ES解离常数，K s＝K1’/K1
[S]－底物浓度
1925年，Briggs和Haldene认为，当K2>K1’时，快速平衡理论不一定能够成立，他们考虑了更有普遍性的酶催化反应式：
提出稳态(Steady state)理论，认为测定反应初速度的过程中，底物浓度[S]不断减少，产物浓度[P]不断增加，而中间复合物的浓度[ES]在一开始增高以后，可在相当一段时间内保持平衡，称之为稳态，即ES的生成速度与消耗速度相等，达到动态平衡，称之为稳态。
v=1/2v m时，K m＝[S]。即米氏常数等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。这两个式子均称为米氏常数。
2多底物反应中底物浓度对酶催化反应速度的影响
现以双底物反应为例分述如下：
(1) 有序机制(Ordered bi bi mechanism) 此类反应中，底物与酶的结合严格地按顺序进行，即酶先与底物A结合，然后再与底物B结合，反应后底物的释放也按规定顺序进行，即先释放产物P、再释放产物Q。
(2) 随机机制(Random bi bi mechanism) 此类反应中，酶与底物结合的先后是随机的，可以先A后B，也可以先B后A，反应后产物的释放先后也是随机的。
(3) 乒乓机制(Ping—pong bi bi mechanism) 此类反应中，酶先与底物A结合，释放出产物P以后，再与另一底物B结合，放出产物Q，并释放出游离酶E。底物与产物交替进出，就像打乒乓球一样．故
称为乒乓机制。
（二) 酶浓度对催化反应速度的影响
在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。其反应速度方程为：
(三) 温度对酶催化反应速度的影响
反应速度的温度效应常以温度系数Q10表示，Q10是指在其他条件相同的情况下，温度升高10℃时，反应速度增加的倍数。对于一般化学反应，Q10＝1~2。当温度超过一定界限时，酶的活力会受到影响，甚至引起变性而丧失其催化活性。
酶的最适反应温度与反应时间的长短有关，一般反应时间延长，最适温度会有所降低。
(四) pH值对酶催化反应的影响
只有在有效pH范围内，酶才显示其催化活性，在最适pH条件下，酶催化反应的速度最大。
pH值之所以影响酶的催化作用，主要是由于在不同的pH条件下，酶分子和底物分子的解离状态不同，从而影响酶促反应的进行。
(五) 抑制剂对酶催化反应的影响
凡是能够使酶的催化活性降低或丧失的物质称为酶的抑制剂。抑制剂可与酶催化作用的必需基团结合，影响酶的结构和性质，从而降低酶催化反应的速度。
根据抑制剂与酶相结合的情况，抑制作用可分为不可逆抑制和可逆抑制两种类型。
不可逆抑制剂对酶的抑制程度随抑制剂浓度的增加和抑制时间的延长而增大。
可逆抑制剂与酶的结合是可逆的。可以用透析、超滤等方法将抑制剂除去，而使酶的催化活性恢复的抑制作用称为可逆抑制。可逆抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。
1．竞争性抑制
抑制剂和底物竞相与酶分子结合而引起的抑制作用称为竞争性抑制。
2．非竞争性抑制
在非竞争性抑制中，酶分子可在不同的位点上分别与抑制剂和底物结合形成各自的复合物EI或ES，也可生成三元复合物EIS。
3.反竞争性抑制
在反竞争性抑制中，底物与酶分子结合生成中间复合物ES后，抑制剂再与中间复合物结合生成EIS三元复合物。
(六) 激活剂对酶催化反应速度的影响
能够增加酶的催化活性的物质称为激活剂。常见的激活剂有Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等金属离子和C1—等无机负离子。
三、酶的分类与命名
根据国际酶学委员会的建议，每种具体的酶都有其推荐名和系统命名。
酶的推荐名，是在惯用名称的基础上，加以选择和稍加修改而成。一般由两部分组成：(1) 底物的名称，(2) 催化反应的类型后面加一个“酶”字（—ase）。例如，葡萄糖氧化酶，表明该酶作用底物是葡萄糖，所催化的反应类型属于氧化反应。对于水解酶类，催化反应的类型为水解反应，在命名时可省去“水解”字样。有时还在底物名称前面在加上酶的来源，如胰蛋白酶。
系统命名包括了酶催化作用的底物，酶作用的基团以及催化反应的类型。
系统命名法根据酶所催化的反应类型，将酶分成六大类。即：
第l类，氧化还原酶；第2类，转移酶；第3类，水解酶；第4类，裂合酶；第5类，异构酶；
第6类，连接酶(或称合成酶)。
每—种酶都有其一定的系统编号，系统编号采用四码编号方法，每个号码之间用圆点(.)分开。第一个号码表示该酶属于六大类中的某一类，第二个号码表示属于该类中的某一亚类，第三个号码表示属于该亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。有关详细内容，请参看有关‘酶的分类与命名’的书籍或资料。
四、酶活力的测定
1 酶活力测定方法
酶活力测定包括两个阶段。首先要在一定条件下，将酶与其作用底物混合均匀，反应—段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。一般采用如下步骤：
(1) 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液。
(2) 确定酶催化反应的温度、pH值等条件。
(3) 在一定的条件下，将一定量的酶液与—定量的底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。
(4) 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种适合的生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。
终止酶反应的方法：
①反应时间一到，立即取出一定量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活。
②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活。
③立即加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶促反应的最适pH值，从而终止反应。
④将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低到10℃以下。
2 酶活力单位
1961年，国际生物化学联合会规定：在特定的条件下(温度可采用25℃或其他选用温度，pH等条件均采用最适条件)，每分钟催化1μmol底物转化为产物的酶量，定义为1个酶活力单位。这个单位称为酶的国际单位(IU)。
酶的比活力是指酶制剂中，每l mg蛋白质所具有的某种酶的活力单位数。即：
酶比活力＝酶活力(u)／蛋白质质量(mg)
第二节药用酶的生产
1 药用酶具有治疗和预防疾病功效的酶称为药用酶。
2 药用酶的生产方法
(1)提取法
运用各种生化分离技术，从动物、植物、微生物等的含酶细胞、组织或器官中提取、分离和纯化各种药用酶的方法称为提取法。例如，从动物胃中提取分离胃蛋白酶；从动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，或这些酶的混合制剂胰酶；从动物血液中提取超氧化物歧化酶(SOD)等。
(2)生物合成法
生物合成法是利用各种动物、植物和微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。主要是利用微生物细胞进行生产。例如，用枯草芽孢杆菌生产淀粉酶，用大肠杆菌生产青霉素酰化酶。
（3）化学合成法
由于酶的化学合成要求作为单体底物的各种氨基酸达到很高的纯度，合成的成本高昂，而且只能合成那些已搞清化学结构的酶，这就使化学合成法受到限制，至今仍停留在实验室阶段。
一酶生物合成及其调节理论
（一）酶的生物合成
1 RNA的生物合成—转录
某种细胞能否合成某种酶分子，首先取决于细胞中的遗传信息载体—DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。
DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录生成对应的RNA，然后再翻译成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。
转录是以DNA为模板，以核甘三磷酸为底物，在RNA聚合酶(转录酶)的作用下，生成RNA的过程。按其结构和功能不同，可分为mRNA，tRNA和rRNA。
2 蛋白质的生物合成—翻译
以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译。
新合成的肽链释放出来后，还需经过加工才能形成完整空间结构的酶或蛋白质。
（二）酶生物合成的调节
酶的生物合成要经过一系列的步骡，需要诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素都会影响酶的生物合成。有关研究表明，至少在原核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶的生物合成是至为重要的。转录水平的调节控制，又称为基因的调节控制。
基因对酶生物合成的调节控制方式：
1
(主要是诱导酶)生物合成的现象。例如，葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成等。
2 酶生物合成的诱导作用
导作用。起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β-乳糖苷酶的合成，淀粉诱导α-淀粉酶的合成等。
3酶生物合成的反馈阻遏作用
又称为产物阻遏作用，指的是酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。
二药用酶生产细胞的选择
（一）用于酶发酵生产细胞需具备的条件
（1）酶的产量高；（2）容易培养和管理；（3）产酶稳定性好;(4) 利于酶的分离纯化。(5) 安全可靠。
（二）常用产酶微生物
1 枯草芽孢杆菌
芽孢杆菌属细菌。可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。
2 大肠杆菌
可生产多种酶，一般都属于孢内酶，需经过细胞破碎才能分离得到。如谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、苄青霉素酰化酶、限制性核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶。
3黑曲霉曲霉属黑曲霉群霉菌
糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶等。
4米曲霉曲霉属黄曲霉群霉菌
可用于生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。
5青霉青霉属半知菌纲。
青霉菌分布广泛，种类很多。其中产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要
作用于青霉素V)、果胶酶、纤维素酶C x等；橘青霉用于生产5’—磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧
化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1。
6 木霉属于半知菌纲。
是生产纤维素酶的重要菌株。此外，木霉中含有较强的17α-羟化酶，常用于甾体转化。
7 根霉
用于生产糖化酶、α-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的17α-羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。
9 链霉菌是一种放线菌，形成分支的菌丝体。
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α-羟化酶，可用于甾体转化。
10 啤酒酵母
用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。
11 假丝酵母
假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊索酶、转化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有较强的17—羟基化酶，可用于甾体转化制造睾丸素等。
12植物细胞
植物细胞培养生产次级代谢物的研究是20世纪80年代才发展起来的新技术。首无从植物的外植体根、茎、叶、花、果实、种子等)中诱导得到愈伤组织，再经筛选、诱变、原生质体融合、基因重组等技术选育得到优良的产酶细胞。然后在反应器中如同微生物那样进行培养而得到各种所需的酶。例如用大蒜细胞生产超氧化物歧化酶，用木瓜细胞生产木瓜蛋白酶，用菠萝细胞生产菠萝蛋白酶等。
三提高药用酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中，为了提高酶产量，除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条件并根据需要和变化情况及时加以调节控制以外，还可以采取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂或其他产酶促进剂等。
1 添加诱导物
对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。例如乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸酯诱导蔗糖酶等。
诱导物一般分为三类：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。
2 控制阻遏物浓度
有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。阻遏作用有产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。阻遏物可以是酶催化反应产物，代谢途径的末端产物以及分解代谢物(葡萄糖等容易利用的碳源)。
控制阻遏物浓度是解除阻遏，提高酶产量的有效措施。
3 添加表面活性剂
表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。离子型表面活性剂又有阳离子型、阴离子型和两性离子型之别。
由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，特别像季铵型离子表面活性剂(如“新洁而灭”等)是消毒剂，不能用于酶的发酵生产。
非离子型表面活性剂，如：吐温(Tween)、特里顿(Triton)等，可积聚在细胞膜上，增加细胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的产量。例如，在霉菌发酵生产纤维素酶的培养基中，添加1％的吐温，可使产酶量提高1～20倍。要注意表面活性剂添加量应控制在最佳浓度范围内。此外，添加表面活性剂有利于提高某些酶的稳定性和催化能力。
4 添加刺激剂
在植物细胞培养生产次级代谢物的过程中，添加某些刺激剂，往往可以显著提高次级代谢物的产
量。
刺激剂主要有真菌的细胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶及一些小分子物质等。例如，在大蒜细胞培养液中添加1.0u／mL果胶酶，使SOD的产最提高27％。
5
产量有显著效果；例如，添加植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍。
四药用酶的分子修饰
通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。
1 金属离子置换修饰
通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。
在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换后的酶将会出现不同的特性。
2 大分子结合修饰
通常使用的水溶性大分子修饰剂有右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物（Ficoll)、聚氨基酸等。这些大分子在使用前，一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合，对酶分子进行修饰。经过此法修饰的酶可显著提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。
3 肽链有限水解修饰
酶的催化功能主要决定于酶的活性中心的构象，活性中心部位的肽段对酶的催化作用是必不可少的，而活性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。
酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况的一种。若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将失去其催化功能；若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则酶的活力仍可保持或损失不多；若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高。在后两种情况下，肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解。
利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。
4 酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。这些功能团主要有氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。这些基团可组成各种副键，对于蛋白质空间结构的形成和稳定起着重要作用。如果这些功能团发生改变，就会引起副键的改变，使空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能的改变。
常用的小分子侧链基团修饰剂：
(1)氨基修饰剂凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂。主要有二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。
(2) 羧基修饰剂可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物称为羧基修饰剂、羧基修饰剂可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的某些特性与功能。如乙醇—盐酸试剂，水溶性的碳化二亚胺、异噁唑盐等。
(3) 胍基修饰剂精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合
物，如环已二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用做胍基修饰剂。
(4)巯基修饰剂蛋白质的半胱氨酸残基侧链中含有巯基。
常用的巯基修饰剂有二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。
(5) 酚基修饰剂蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。修饰酚基的主要方法有碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，因而增加了对带正电荷的底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。
(6)分子内交联剂用含有双功能团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。
5 氨基酸置换修饰
酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键连结而成的。在特定位置上的各种氨基酸是酶的化学结构和空间结构的基础。若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法称为氨基酸置换修饰。
6 物理修饰
通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。
物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排。
酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下，先使酶原有空间构象破坏；然后在不同的条件下，使酶分子重新构建新的构象。
五、酶在疾病预防和治疗方面的应用
酶作为药物可以预防和治疗多种疾病，而且具有疗效显著、副作用小等待点。其应用越来越广泛(P290 表4—2)。
第三节药物的酶法生产
利用酶的催化作用，将前体物质转化为有用药物的过程称为药物的酶法生产。
一酶的选择与反应条件的优化
在药物的酶法生产过程中，首先要根据下列几点选择好适当的前体物(原料)、酶及其反应条件。
(1) 根据欲制造的药物的结构特点，选择好原料、反应步骤及所使用的酶或酶系。
(2) 根据药物的用途和要求，选择的酶需经过—定步骤进行纯化，以达到产品的要求，
(3) 根据酶的反应动力学特点，确定并优化反应的工艺条件，包括底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂的浓度等。
(4) 要求前体物质达到一定的纯度要求并廉价易得，以提高产品质量，降低生产成本。
二酶和菌体固定化
固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。
固定化菌体（固定化死细胞）：采用含酶菌体或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌体碎片中的酶或酶系进行催化反应。
（一）酶和菌体固定化的方法
1 吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称为吸附法。
物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用。
缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落。
2包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。
包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
(1)凝胶包埋法凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化菌体。
常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
(2) 半透膜包埋法半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。
3 结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
(1) 离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
制备方法：在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱，就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。
(2) 共价键结合法通过共价健将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。
共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某—基团反应，形成共价键。
使载体活化的方法主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。
4 交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。
5 热处理法
将含酶细胞在—定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化。
(二) 固定化酶的性质
1 稳定性
固定化酶的稳定性—般比游离酶的稳定性好。主要表现在：对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定性好；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。
2 最适温度
固定化酶的最适作用温度—般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些会有较明显的变化。固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。
3 最适pH值
酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。
影响因素：
(1) 载体性质对最适pH值的影响
一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶的最适pH值为高（即向碱性一侧移动）；用带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH值比游离酶的最适pH值为低(即向酸性一侧移动)；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值一般不改变。
(2) 产物性质对最适pH值的影响
—般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值低一些；产物为中性时，最适pH值一般不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。
4 底物特异性
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3％左右。
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。
(三) 固定化酶的应用
1固定化酶的优点：
(1) 酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
(2) 固定化酶可反复使用或连续使用较长的时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
(3) 固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
2 工业化生产的固定化酶
（1）氨基酰化酶用DEAE－葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，用于拆分D，L-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。
（2）固定化青霉素酰化酶用于合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。
此外，还有葡萄糖异构酶、天冬氨酸酶、延胡索酸酶、β-半乳糖苷酶、天冬氨酸-β-脱羧酶。
三酶的非水相催化
1 非水相催化反应体系特点：
(1) 提高非极性底物和产物的溶解度，从而提高反应速度。
(2) 可催化水解反应的逆反应，而合成多肽、酯类等化合物。
(3) 有利于反应后酶与产物的分离。
(4) 解除或减少某些产物对酶的抑制作用.
(5) 提高酶的稳定性。
2 非水相催化反应体系
酶的非水相催化反应体系与常规的水相催化反应体系的主要差别在于催化反应介质的不同。一般可分为微水相体系、反胶团体系、水-水溶性有机溶剂体系和水-水不溶性有机溶剂体系等四种。
不管何种体系，非水相催化反应的介质中都含有较多的有机溶剂和一定量的水。
（1）在非水相催化反应中，有机溶剂对反应主要有三方面的影响：
A 有机溶剂影响反应过程中底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应速度。
B 有机溶别影响酶分子微环境的水化层，从而影响酶的催化作用。
C 有机溶剂影响酶蛋白的空间结构，对酶的催化活性起抑制作用或使酶失活。
常用的有机溶剂有辛烷、正己烷、苯、吡啶、季丁醇、丙醇、己酯、二氯甲烷等。
（2）非水相催化反应介质中，水也是不可缺少的成分之一：
A 酶蛋白分子需要一层水化层，才可维持其催化活性。
B 水的含量影响到催化反应的化学平衡和反应速度。
C 水的含量与有机溶剂的种类以及酶分子的结构和性质有密切关系。
3 酶在非水相介质中的催化特性
(1) 底物特异性
在非水相介质中，由于酶分子结构发生变化，致使酶的底物特异性会发生一些改变。酶的立体异构专一性发生改变，一般来说，在疏水性强的介质中，D-型异构体比L-型异构体更容易与酶结合而发生反应。
(2) 热稳定性
许多酶在非水相介质中的热稳定性比在水溶液中更好。例如胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中，于20℃保存5个月活力不损失，而在水溶液中，其半衰期却只有几天。
酶在非水相介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。例如，在非水相介质中的水含量从0.06g ／g蛋白质增加到0.2g/g蛋白质时，核糖核酸酶的半衰期从120min减少到45min。
(3) 酶催化反应的最适pH
在非水相反应中，酶所处的pH环境，与酶在冻干或吸附到载体上之前缓冲液的pH相同。缓冲液的pH若与酶在水溶液中反应的最适pH相同，则酶在非水相中催化的最适pH与其在水溶液中催化的最适pH一样。
4 酶的非水相催化在药物生产中的应用
P309 表4-3。
四酶在药物制造方面的应用
表4-4 酶在药物制造方面的应用
酶名来源应用
蛋白酶微生物，胰脏，胃，植物制造水解蛋白、氨基酸
糖化酶微生物制造葡萄糖
青霉素酰化酶微生物制造半合成青霉素和头孢霉素
氨基酰化酶微生物拆分酰化-D,L-氨基酸，制造L-氨基酸或D-氨基
酸
由反丁烯二酸制造L-天冬氨酸
天冬氨酸酶大肠杆菌，假单孢菌，啤酒酵母
等
谷氨酸脱羧酶大肠杆菌等由谷氨酸制造γ-氨基丁酸
5′-磷酸二酯酶橘青霉等制造5′-核苷酸
多核苷酸磷酸化
大肠杆菌等由核苷二磷酸制造多核苷酸、聚肌胞等
酶
β-酪氨酸酶植物，微生物制造多巴
无色杆菌蛋白酶无色杆菌由猪胰岛素制造人胰岛素
羟基化酶微生物甾体转化
脂肪酶微生物等青霉素G前体肽的合成（非水相催化）L-酪氨酸转氨酶细菌制造多巴
α-甘露糖苷酶链霉菌制造高效链霉素
思考题：
1影响酶催化作用的因素有哪些？
2 提高药用酶产量的措施有哪些？
3 酶和菌体固定化的方法有哪些？
第一章 1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。 2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。 4.酶工程的组成部分？ 答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。5.酶的结构特点？ 答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。 6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。 7.酶作用机制有哪几种学说？ 答：锁和钥匙模型、诱导契合模型 8.酶催化活力的影响因素？ 答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。 9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？ 答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备 1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得 2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。完全破碎酵母和细菌细胞。 3.膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周 蛋白和固有蛋白两种类型 4.胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。 （二）蛋白质的浓缩和脱盐 浓缩方法主要有：沉淀法、吸附法、干胶吸附法、渗透浓缩法、超滤浓缩法
第二章 1.六大类酶基本概念和特点 （1）氧化还原酶：催化氧化还原反应，需要电子供体或受体 （2）转移酶：催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 （3）水解酶：催化底物的加水分解反应 （4）裂合酶：脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键外加入某一基团。 （5）异构酶：催化生成异构体反应的酶，分别进行外消旋，差向异构，顺反异构，醛酮异构，分子内转移，分子内裂解等 （6）连接酶：需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。 应用最多的是氧化还原酶，利用率最高的是水解酶 2.必需基团及其作用特点 必需基团包括：（1）活性部位，包括结合基团和催化基团 （2）维持酶空间结构的基团 必需基团是酶分子氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。必需基团在空间结构上相互靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异性结合并将其转化为产物 3.两种酶与底物的结合模型 （1）锁钥模型：底物结合部位由酶分子表面的凹槽或空穴组成，这是酶的活性中心，它的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，可专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物，同时酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。 三点结合学说指出，底物分子与酶活性中心的基团必须三点都互补匹配，酶才作用于这个底物。 （2）诱导锲合模型：酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。 4.影响酶催化作用的五种模型 （1）广义的酸碱催化 能供给质子的物质即为酸，能接受质子的物质即为碱。广义的酸碱催化就是指组成酶活性中心的极性基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用，这就是广义的酸碱催化。发生在细胞内的许多类型的有机反应都是广义的酸碱催化。 组氨酸的咪唑基值得特别注意，因为它既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基团。 影响酸碱催化速率的因素：一是酸碱的强度，在这些功能基团中，组氨酸的咪唑基的解离情况pK值为6.0，在生理pH条件下，既可以作质子的供体又可作质子的受体。因此，咪唑基是催化中最有效最活泼的一个催化功能基团；二是这些功能基团供出质子或接受质子的速度，其中的咪唑基的情况特别突出，它供出或接受质子的速度十分迅速，其半衰期小于10-10秒。而且，供出或接受质子的速度几乎相等。由于咪唑基有如此的优点，所以虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，却很重要，在许多酶的活性中心处都含有组氨酸 （2）共价催化 酶活性中心处的极性基团，在催化底物发生反应的过程中，首先以共价键与底物结合，生成一个活性很高的共价型的中间产物，此中间产物很容易向着最终产物的方向变化，故反应所需的活化能大大降低，反应速度明显加快。 常见形式是酶的催化基团中亲核原子对底物的亲电原子攻击。 （3）邻近效应和定向效应 邻近效应：在酶促反应中，由酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度增加。
第一章生物药物概述 1、生物药物(biopharmaceuticals) 指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液或其代谢产物，综合利用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理和方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。 2、抗生素（antibiotics）： 抗生素是生物，包括微生物，植物和动物在内，在其生命活动过程中所产生的(或由其它方法获得的)，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质”。 3、生化药品 从生物体分离纯化得到的一类结构上十分接近人体内的正常生理活性物质，具有调节人体生理功能，达到预防和治疗疾病的物质 4、生物制品（biological products） 是指用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 5、基因工程药物 采用新的生物技术方法，利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主，进行生产的作为治疗、诊断等用途的多肽和蛋白质类药物 6、生物药物分类 按生理功能和用途分类 （1）治疗药物：对疑难杂症如肿瘤、爱滋病、免疫性疾病、内分泌障碍等具有特殊的作用；（2）预防药物：对传染病的预防； （3）诊断药物：免疫诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、酶诊断试剂、放射性诊断药物和基因诊断药物等；某些生物活性物质亦是检测疾病的指标，如谷草转氨酶等； （4）其它生物医药用品：生物药物在其他方面应用也很广泛：如生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料等。 按原料的来源分类 （1）人体组织来源的生物药物：主要有人血液制品类、人胎盘制品类、人尿制品类；（2）动物组织来源的生物药物：动物的脏器、其他小动物制得的药物如蛇毒、蜂毒等。（3）植物组织来源的生物药物：中草药、有效成分； （4）微生物来源的药物：抗生素、酶、氨基酸、维生素等； （5）海洋生物来源的药物； 7、生物药物的特性 （1）药理学特性 （2）在生产、制备中的特殊性 （3）检验上的特殊性 （4）剂型要求的特殊性 （5）保藏及运输的特殊性 第二章生物药物的质量管理与控制 1、生物药物质量检验的程序与方法 基本程序：取样、鉴别、检查、含量测定、写出检验报告 2、药物的ADME A: absorption，药物在生物体内的吸收； D: distribution, 药物在生物体内的分布； M: metabolism，药物在体内的代谢转化； E: excretion，药物及其代谢产物自体内的排除。 3、药物的三级质量标准 1. 国家药典：凡例、正文、附录三大部分； 2. 部颁药品标准：性质与药典相同，具有法律的约束力。收载《中国药典》未收载的，但常用的药品及制剂。 3. 地方药品标准：对药典以外的某地区常用的药品、制剂的规格和标准，常制定地区性的
酶工程在医药上的应用 朱祺琪社科1003班3100104077 【摘要】本文为读书报告，从酶工程制药的工艺和工程化技术方面，以及酶工程在医药上的应用及对未来的展望对酶工程的一个方面进行概述。 【关键词】酶工程酶的固定化酶法手性合成技术非水相酶催化 【引言】酶，它作为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛重组DNA技术促进了各种有医疗价值的酶的大规模生产。用于临床的各类酶品种逐渐增加。酶除了用作常规治疗外，还可作为医学工程的某些组成部分而发挥医疗作用。如在体外循环装置中，利用酶清除血液废物，防止血栓形成和体内酶控药物释放系统等。另外，酶作为临床体外检测试剂，可以快速、灵敏、准确地测定体内某些代谢产物，也将是酶在医疗上一个重要的应用。 【正文】 一、酶工程制药的工艺和工程化技术 1）酶的固定化技术 在４０多年以前，几乎所有的工业化生产中采用的生物催化剂都是用全细胞或组织来进行的。作为生物催化剂的微生物细胞种类繁多，并带动了目前发酵工业的迅速发展。但由于正常发酵过程中的微生物生长和繁殖都需要消耗培养基中的营养物质并产生不必要的副产物，因而导致目的产物必须经过分离步骤才能从最终产物的混合物中分离出来，因此使用微生物细胞进行催化并不是十分有效的方法。
酶的固定化最早在１９１６年由Ｎｅｌｓｏｎ和Ｇｒｉｆｆｉｎ在研究酵母蔗糖酶时提出，他们发现蔗糖酶被吸附在活性炭上后仍然有活性。在２０世纪６０年代，羧肽酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶相继被固定化成功，从而使得固定化酶在制药工业中的应用受到越来越大的重视。１９６９年千烟一郎固定化氨基酰化酶工业化生产Ｌ 氨基酸；随后青霉素酰化酶固定化生产。氨基青霉烷酸获得成功。近十几年来，随着工业分离纯化技术的发展和应用，使得工业规模获得酶成为可能，离体酶在制药工业中应用在逐渐增加。其最明显的优势在于具有更有效的底物转化率、更高的投料量和产量以及更好的产物均一性。但这些优点极有可能被酶纯化所增加的成本和纯化过程中酶的失活所抵消掉，造成对酶应用的限制。许多科学家已经开始研究如何去克服这些困难，其中大批量进行酶纯化能够在一定程度上减低成本，但更有效的方法当属固定化酶的方法，这种方法使得酶在使用过程中稳定性提高，可重复使用，降低了生产成本。 2）酶法手性合成技术 近来，小分子与生物大分子间的相互作用引起了人们很大的关注。对于选择性酶抑制剂和受体激动剂或拮抗剂的研究是药用工业中靶目标定位研究的关键之一。在分子水平上对药物作用机制的深入了解引起了人们的广泛注意，意识到手性作为许多药物功效之关键的重要性。现在人们已经知道在许多情况下，药物中仅有一种对映体对功效是必需的，其他对映体或者无活性，或者活性下降，甚至产生毒害。现在制药企业已经意识到，新药的开发必须是单手性的，以此来避免由不需要的对映体引起的不必要的副作用。许多情况下，一旦由消旋体药物向对映体纯化合物的转化成为可能时，就是发展工业化过程的良机。与消旋化合物相比较，单一对映体的优势体现在制备过程和配方上。 手性药物中间体可通过不同途径制备。一个方法是从天然的手性化合物开始，这种手性化合物主要是由发酵过程产生。手性库主要用到廉价的，使用方便的，有旋光性的天然产物。第二种方法是通过拆分消旋化合物实现的，该方法是主要是通过对映体或非对映体结晶性质上的差异以及通过化学或生物催化的方法有效拆分消旋化合物来完成的。最后，也可以用微生物细胞或其代谢产物酶，
酶工程在现实生活的应用 学院：生命科学与食品工程学院 姓名：沈峰学号：5602209078 班级：生工092 摘要：酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通 过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。酶工程技术与我们生活息息相关，比如酿酒，制药工业等等。 Abstract:The enzyme is a specific protein, RNA or its complex which is used to catalytic specific chemical reaction.it's biological catalyst .It can accelerate reaction velocity by reduce the activation energy of reaction ,without changing the point of balance. The vast majority of enzyme's chemical nature is protein.so it have lots of Characteristics as high catalytic efficiency, high specificity, mild conditions and so on.The enzyme engineering is closely linked with our life ,for example,making wine pharmaceutical industry and so on. 关键字：酶工程酶啤酒制药 酶工程就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。 如果要了解酶工程在现实生活方面的应用的话，首先先要知道什么是酶，什么是酶工程，和哪些酶可以在起作用及酶的特性有哪些。 首先酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。目前已发现有2000 多种。分子量在数万至数十万之间。生物体内的含量一般极少，它能参与生物体的各种生理生化活动，起催化剂的作用。酶的种类众多，而在酿酒等工业方面方面应用的酶也不少。比如，曲霉，根霉，红曲霉，拟内孢霉，木霉，青霉，等等。所以没对于现实生活有着广而深的影响，对于酶的特性的了解也就十分必要。 酶工程：酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。 酶的特性主要四点：1、酶具有高效率的催化能力；其效率是一般无机催化剂的10的7次幂~~10的13次幂。2、酶具有专一性；（每一种酶只能催化一种或一类化学反应。）3、酶在生物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数量都不会发生改变(与催化剂相似)；4、酶的作用条件较温和。 一酶工程在酿酒制造业的作用 总所周知，现实生活中的许多家庭每天都或多或少会在酒的方面消费，还有社交
酶工程技术极其在医药领域的应用 摘要：随着生物技术的迅速发展，酶工程在生物工程中的核心地位得到了更好的体现。酶工程作为一种高新技术，已在医药、食品、轻工业、纺织等行业中得到越来越广泛的应用。本文将从酶的固定化技术、酶催化技术、酶的化学修饰、脱氧核酶、抗体酶和酶学诊断等几个方面来对酶工程在医药行业中的应用进行综述。 关键词：酶工程；医药；应用 Enzyme engineering technology and it’s application in the medical field Abstract: With the rapid development of biotechnology, enzyme engineering as a hard core of biological engineering has been better reflected. Enzyme engineering, as a new high-tech, has been widely used in medicine, food, light industry, textile and other industries. This article told the application of enzyme engineering in the medical industry from these aspects ,Enzymes Immobilization, Enzyme Catalysis, Enzymes Modification, Deoxyribozyme, Catalytic Antibody and Enzymatic diagnosis. Key words: Enzyme Engineering; Medicine; Application 1 引言：回顾20世纪，生物科学与生物工程在全球崛起并迅速发展，已经从整体水平发展到细胞水平和分子水平，在基础与应用研究领域取得了举世瞩目的成果。酶工程作为生物工程的重要组成部分，
第四章酶工程制药 教学目的 掌握：酶工程的概念 熟悉：固定化酶、固定化菌体的定义和特点 教学重点 固定化酶 计划学时：4 酶工程制药是生物制药的主要技术之一，主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。 药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。 酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效物质的技术过程。主要包括酶的催化反应、酶的固定化、酶的非水相催化等。 第一节概述 酶是生物催化剂。 所有生物体在一定条件下都可以合成多种多样的酶。生物体内的各种生化反应，几乎都是在酶的催化作用下进行的，所以酶对于生物体的新陈代谢是至关重要的。 一、酶的催化特性 酶是生物催化剂，具有催化剂的共同性质，即可以加快化学反应的速度，但不改变反应的平衡点。 1 酶的专一性强 2 酶的催化效率高 3 酶的作用条件温和 二、影响酶催化作用的主要因素 (一) 底物浓度对酶催化反应的影响 酶催化反应的底物即酶所作用的物质。根据参与反应的底物数量的不同，可分为单底物反应和多底物反应。 单底物反应只有一种底物发生变化。水解酶催化的水解反应有水参与，但由于水的量很大，可视为其浓度是恒定不变的，也属于单底物反应。 多底物反应是有两个或多个底物参与的反应。其底物浓度对反应速度的影响较为复杂，根据底物与酶的结合顺序，可分别用有序机制(Ordered bi bi mechanism)、随机机制(Random bi bi mechanism)和乒乓机制(Ping—pang bi bi mechanism)解释。 1单底物反应中底物浓度对酶促反应速度的影响 从图4—1可以看到，在底物浓度较低的情况下，反应速度与底物浓度成正比。 当底物达到一定浓度时，反应速度的上升不再与底物浓度的增加成正比，而逐步达到一个极限值(最大反应速度V m)。 1902年，Henri根据图4—1的结果，提出中间产物学说。
酶工程电子教案 第一章绪论 1、酶的基本概念 酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。 酶工程：酶的生产与应用的技术过程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用等。 2、酶的发展史 19世纪以前： 4000 多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术。 3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品。 2500多年前的春秋战国时期，就懂得用麴来治疗消化不良等疾病。 19 世纪30年以来： 1833年，佩恩（Payen）和帕索兹（Persoz）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到淀粉酶（Diastase）。 19 世纪中叶，巴斯德( Pasteur)认为在活酵母细胞内有一种可以将糖发酵生成酒精的物质。1878年昆尼（Kunne）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶（Enzyme ），这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中”。 1896年，巴克纳（Buchner）兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。 1902年，亨利（Henri）根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出中间产物学说。 k1k2 E ＋S ======== ES ========E ＋P
K－1 1913年，米彻利斯（Michaelis ）和曼吞（menten ）米氏方程： V m [S] v == K m + [S] “酶是生物体产生的具有生物催化功能的物质”。但是尚未搞清楚究竟是哪一类物质？ 1920年，德国化学家威尔斯塔特（Willstater）将过氧化物酶纯化12 000倍。 1926年，萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。 1960年，雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年，切克（Thomas Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26 S rRNA前体具有自我剪接功能（Self-splicing）。并将这种具有催化活性的RNA 称为ribozyme。1983年，阿尔特曼（Sidney Altman）等人发现核糖核酸酶P（RNase P）的RNA部分M1 RNA 具有核糖核酸酶P 的催化活性。 由此引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）”的新概念。 3、酶催化作用的特点 3.1酶催化作用的专一性强 酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。 酶的专一性按其严格程度的不同，可以分为绝对专一性和相对专一性两大类。
第一章绪论 1、生物技术药物：一般来说，采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类 药物。 2、生物药物按其功能用途可以分为三类：（1）治疗药物；（2）预防药物；（3）诊断药物。 3、生物技术药物的特性：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强， 疗效高；（4）稳定性差；（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内的半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络效应；（10）检的特异性 4、生物技术制药的特性：高技术；高投入；长周期；高风险；高收益。 第二章基因工程制药 1、基因工程制药的药物都是用传统方法很难生产的珍贵稀有的药品，主要是医用活性蛋白 和多肽类，包括：(1)免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体。(2)细胞因子，如各种干扰素,白细胞介素，集落刺激生长因子，表皮生长因子及凝血因子。（3）激素，如胰岛素，生长激素，心钠素。（4）酶类，如尿激酶，链激酶，葡激酶，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2、我国科学家经过8年刻苦攻关，成功地研制出世界上第一个采用中国健康人白细胞中克 隆的A1B型干扰素基因，组建杂交质粒，传染大肠杆菌使之高效表达的人A1B干扰素。 3、基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体，拼接，转入新的宿主细胞，构建 成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 4、基因工程药物制造的主要步骤：获得目的基因—组建重组质粒—构建基因工程菌—培养 工程菌—产物分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装。 5、简单叙事反转录法克隆基因的主要步骤：mRNA的纯化；CDNA第一链的合成；CDNA 第二链的合成；CDNA克隆；将重组体导入宿主细胞；CDNA文库的鉴定；目的CDNA 的分离和鉴定。 6、目前克隆真核基因常用的方法：化学合成和反转录法。 7、基因表达的微生物宿主细胞分为两类：原核生物，目前常用的有大肠杆菌，枯草芽孢杆 菌，链霉菌。真核生物，常用的有酵母，丝状真菌。 8、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。 9、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的剂量；（2）外源基因的表达效 率：启动子的强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码的间距；密码子组成。（3）表达产物的稳定性；（4）细胞的代谢负荷；（5）工程菌的培养条件。 10、融合蛋白：融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由 一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。 11、非融合蛋白：是指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核的mRNA的AUG为起始，在 其氨基端不含任何细菌多肽序列。 12、质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 13、质粒的分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象，它 主要与两个因素有关，一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌，质粒特性和培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。 14、提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌；选择合适的载体；选择压力；分阶段 控制培养；控制培养条件；固定化。 15、接种量：是指移入的种子液体积和培养液的体积的比例。 16、基因工程药物的分裂纯化特点：（1）目的产物在初始物料中含量低；（2）含目的产 物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差；（4）种类繁多；（5）应用面广。17、分离纯化的基本过程的5个步骤：包括细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高
习题： 1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_______和_______两大类别。 2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是________，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是___________。 3、进行分子内催化的核酸类酶可以分为_______，_______。 4、酶活力是_____的量度指标；酶的比活力是__________的量度指标；酶转换数是________的量度指标。 5、某酶的分类编号是，其中EC是指_______。此酶属于_______类型。 6、醇脱氢酶参与的反应表明无氧气参与（） 7、酶工程是_____________的技术过程。 8、酶的转换数是指（） A、酶催化底物转化为产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数 C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的分子数 9、酶的改性是指____________________________. 第二章 1、名词解释 转录、组成型酶、酶的反馈阻遏、分解代谢物阻遏、生长偶联型 2、微生物产酶模式可以分为同步合成型________、中期合成型、________。 3、可以通过添加（）使分解代谢物阻遏作用解除。 A、诱导物 B 激活剂 C、cAMP D、ATP 4、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以 A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力 D、提高细胞通透性 5、为什么滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成 6、操纵子是由_________、_______和启动基因组成的。 7______________和______是影响酶生物合成模式的主要因素。 8、RNA前体的加工是指____________ 6、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。 实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养肉汤培养基中，于37°C振荡培养，当OD550为时，经培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17ml培养液。于4个三角瓶分别添加 （A）3ml无菌水 （B）1ml乳糖溶液（L）和2ml无菌水 （C）1ml乳糖溶液（L）、1ml葡萄糖溶液（L）和1ml无菌水 （D） 1ml乳糖溶液（L）、1ml葡萄糖溶液（L）和1mlcAMP钠盐溶液然后在相同的条件下于37°C振荡培养2h，分别取样测定β-半乳糖苷酶的活力。 实验结果（A）和（C）瓶的β-半乳糖苷酶的活力为0，（B）瓶和（D）瓶β-半乳糖苷酶的活力为1000U/ml左右
第四章抗体制药 1．Ig分子是由二硫键连接起来的4条（两对）条多肽链构成的。 2．单克隆抗体制备时对动物的免疫方法分为体内免疫和体外免疫。 3．一般来说PEG的相对分子质量和浓度越大，细胞的融合率越高。 1.Ig分子的抗原结合部位是由（V L和V H的CDR区）共同构成。 2.制备单克隆抗体时一般采用与（骨髓瘤细胞）供体同一品系的动物进行免疫。 3.生物药物检验要求（理化指标和生物活性指标缺一不可）。 4.下列不属于基因产品液态保存的方法是（低浓度保存） 5.前预防乙型肝炎使用的生物制品属于（疫苗）。 单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的，这种抗体是针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 双功能抗体：就是双特异性单链抗体，将抗A抗原抗体的轻链可变区基因与抗B抗原抗体的重链可变区通过短肽链接子连接构建成双链抗体的表达质粒，表达后形成双特异性抗体。多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。 抗体：是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。 克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 免疫球蛋白：将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。 类型基本结构 人-鼠嵌和抗体人IgC-小鼠IgV 改型抗体小鼠CDR替换人CDR Fab 完整L链和Fd Fv V H和V L 单链抗体（scFv） V H-或-V L 单域抗体 V H或 V L 最小识别单位（MRU）一个CDR 人-鼠嵌和抗体：由于抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫原决定于抗体分子的稳定区（C）,如果在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链（H）和轻链（L）可变区分离出来，分别与人Ig的重链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。 Fab抗体：用胃蛋白可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段，在Fab片段之间仍保留有铰链区与二硫键，为Fab双体，具有完整的双价抗体活性，但相对分子质量减少了1/3，为10000，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应也相应降低30%，由于仍保持抗体分子的立体构型，因此在人体任然很稳定，成为小分子抗体的锥形。 单链抗体：是由一段弹性链接肽把抗体可变区重链（VH）与轻链（vl）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能单位。 单域抗体：抗体的V H-或-V L是具有结合抗原特异性的小抗体片段。 改形抗体：Ig 分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR 区），而不是整个可变区。 H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR 序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。又称CDR移植抗体。 （单克隆抗体）免疫导向疗法障碍有：1，单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，难以维持有效药物作用靶组织时间；2，完整的抗体分子，
二、问答 4. 如何从环境中筛选稀有放线菌中的小单孢菌，并说明各步骤的作用？ （一）所谓的稀有放线菌：即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。 如：小单孢菌、小双孢菌、马杜拉放线菌等。 选择培养分离——微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化： （1）抑制大多数其它微生物的生长。 （2）使待分离的微生物生长更快。 →使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。 （3）使待分离的微生物生长“突出”。 →直接挑取分离的微生物的菌落获得纯培养。 1）①利用选择培养法进行直接分离：Ⅰ、高温下培养：分离嗜热细菌。 Ⅱ、培养基中不含N：分离固氮菌。 Ⅲ、培养基加抗生素：分离抗性菌。 ②利用选择平板进行直接分离：Ⅰ、牛奶平板：分离蛋白酶产生菌。 Ⅱ、颜色反应：分离特定的菌株。 Ⅲ、利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化。 2）富集培养：特定的环境条件→仅适应于该条件的微生物旺盛生长 →待分离微生物在群落中的数量大大增加→从自然界中分离到所需的特定微生物（二）高选择性分离小单孢菌的程序： 土样自然风干→制成土壤悬浮液→1~5%苯酚处理→涂布平板 （HV琼脂+萘啶酸20mg/L+衣霉素20mg/L）衣霉素和萘啶酸作为细菌、真菌和非目的放线菌的抑制剂。 6. 如何利用同位素标记法研究微生物药物生物合成的机理？ 将同位素标记可疑前体物质加到培养基中→培养后分离目的代谢产物 →测定终产物中同位素含量和分布情况→判断可疑前体物质是否参与代谢产物的合成16. 如想开发生产葡萄糖苷酶的基因工程菌，该如何构建？如想进一步提高该酶的表达量，该如何进行？假如重组表达的酶以包涵体形式存在，以你学到的知识分析应该采取什么措施？ 基因工程酶（蛋白）的构建 （1）基因的获取（通过NCBI搜索欲构建的葡萄糖苷酶的基因序列，再设计引物，以所需的cDNA为模板PCR获得）。 （2）目的基因与表达载体的体外重组。 （3）导入宿主细胞。 （4）筛选和验证。 （5）目的基因的表达。 提高表达量：（1）利用高效表达质粒（强启动子和高拷贝）。 （2）优化密码子。 （3）优化翻译起始区的二级结构。 （4）使ATG和SD序列之间距离为9bp。 （5）优化表达条件。 减少包涵体：（1）降低培养温度。 （2）减少诱导剂的使用量。 （3）
第一章酶工程基础 1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学 ①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。 ②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。 ③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。 ④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。 ⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。 2.说说酶的研究简史 酶的研究简史如下： (1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。 (2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科 医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国 科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 (3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从 刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。 3.说说酶工程的发展概况 I.酶工程发展如下： ①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化： ②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤； ③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清； ④1949年，用微生物液体深层培养法进行 －淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕； ⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量； ⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。 II.在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，如：稳定性差，对强酸碱敏感，只 能使用一次，分离纯化困难等，解决的方法之一是固定化。 固定化技术的发展经历如下历程： ①1916年，Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性； ②1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸； ③1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。 4. 酶的催化特点 酶催化作用特性有： ①极高的催化效率：在37℃或更低的温度下，酶的催化速度是没有催化剂的化学反应速率 的1012-1020倍；
酶工程与生物制药 08生科杨菲200840700055 摘要: 生物技术正在越来越多地从根本上改变进行药物发现和开发的方法。酶工程是生物技术中发展时间较长的一门技术。本文着重从工程和技术化的角度介绍酶工程在制药工业中的应用. 关键词: 酶工程生物制药医药应用研究进展 酶的概述 酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白。其特点：催化效率高,专一性强,反应条件温和,催化活性受到调节和控制 1.酶工程简介 1.1 酶工程，又称酶技术，它是从应用的目的出发，将酶学理论和化学工程相结合，生产、制备、研究酶，利用酶的催化特性，将原料转化为目的产物的一门技术。20世纪20年代初，主要是自然酶制剂在工业上的大规模应用。 在七十年代以后，伴随着第二代酶——固定化酶及其相关技术的产生，酶工程才算真正登上了历史舞台。固定化酶正日益成为工业生产的主力军，在化工医药、轻工食品、环境保护等领域发挥着巨大的作用。不仅如此，还产生了威力更大的第三代酶，它是包括辅助因子再生系统在内的固定化多酶系统，它正在成为酶工程应用的主角。 2.酶的来源 酶作为生物催化剂普遍存在于动物，植物和微生物中，可以直接从生物体中分离提纯。但是，理论上，酶和其他蛋白质一样，也可以通过化学合成法制得。由于当前的条件，试剂和经济条件等多种因素存在，人工合成法来生产酶，还需要相当长的一段时间，所以目前我们还是直接从生物体中直接提取分离。 早期的生产多以动植物为主，从植物中提取的酶有蛋白酶，淀粉酶，氧化酶等，从动物中提取的酶有疑蛋白酶，脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶等。但是随着酶制剂应用范围大大扩大，原先生产的酶远远供不应求。人们就开始探索利用动植物细胞培养法生产酶的新方法来解决目前存在的问题。在这种进退两难的情形下，有关科学家发现了利用微生物来生产。1．种类多，酶品种齐全。 2．生长繁殖快，生产周期短，产量高。3．培养简单，原料来源丰富，经济效益高。4．适应性和适应力较强。所以目前工业上应用的酶大多数采用微生物发酵法来生产。 3.酶的生产菌 3.1 对菌种的选取。 菌种性能的优劣，产量的高低直接影响微生物发酵的成本，所以作为一个优良的产酶菌必须具备以下几点：1。繁殖快，产酶量高，2。不是致病菌，3。产酶性能稳定。4。廉价，周期短，易于培养。 3.2 生产菌的来源。
收稿日期:2005-05-16 作者简介:陈红霞,女,生于1962年,副教授,主要从事酶工程及应用的研究。文章编号:1001-8751(2005)06-0248-04 酶工程与抗生素工业 陈红霞 (山东济宁职业技术学院生物化学工程系, 济宁272037) 摘要: 酶工程是现代生物技术的重要组成部分,它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。介绍了酶固定化、基因工程菌(细胞)的固定化、植物细胞培养产酶、酶的化学修饰、核酸酶、抗体酶、酶标药物的理论和技术研究的最新进展以及酶工程在医药工业中的应用,对酶工程的发展前景进行了探讨。 关键词: 酶工程; 酶的固定化; 核酸酶; 抗体酶; 抗生素 中图分类号: Q814 文献标识码: A 1 酶工程技术 1.1 固定化酶和固定化细胞 固定化酶是指将可溶的自然酶束缚在特定的支持物上或固定在局限的空间,并能发挥催化作用,而固定含酶的细胞则形成固定化细胞。我国研制过的固定化酶或细胞已有50种左右,可以分为下述3种类型:固定化单酶或含特定酶的细胞;固定化双酶,将2种酶共固定在一种载体上或分别固定后串联在一起使用;固定化各类激酶构成ATP再生系统。目前已有多种固定化生物催化剂用于医药工业化生产。与天然酶相比,固定化酶和固定化细胞有酶稳定性高,可长期反复使用,利用效率高;反应后酶与产物易分离,可装柱进行反应,实现连续化操作及自动控制,设备小型化,节约能源和人力;转化液中产物浓度高,副产物少,产品易纯化,产品收率和质量高,成本低;绿化生产,无三废污染;可与溶菌酶共固定化或向反应液中加入抑菌剂,抗微生物污染能力强等优点。 固定化的方法主要有吸附、共价结合、包埋和选择性热变性等。固定化过程必须使用水不溶性固体支持物(载体)。载体要有良好的稳定性,对酸碱和温度有一定耐受性及亲水性,有一定的疏松网状结构和机械强度,颗粒均匀,能耐受酶和微生物作用,共价结合时可活化基团,并廉价易得。吸附法是利用吸附剂、表面作用力或离子交换剂电性作用将酶(细胞)定位于载体表面的技术,当底物或产物为大分子或水溶性较差的小分子物质时,常采用此法制备固定化生物催化剂。常用载体有活性炭、氧化铝、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、石英砂、Amber2 lite I RA、Amberlite I R、DEAEΟ纤维素、C MC、DEAEΟSephadex等,如硅皂土或膨润土吸附青霉素酰化酶和DEAEΟSephadex A25吸附氨基酰化酶等[1]。共价结合法是将酶(细胞)与载体之间通过共价键结合而固定的技术,酶(细胞)与载体结合牢固,不易脱落。常用的载体有纤维素、琼脂、对氨基苯磺酰(ABSE)Ο纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、对氨基苯纤维素及苯胺多孔玻璃等,如ABSEΟ纤维素与5′Ο磷酸二酯酶或多核苷酸磷酸化酶的共价结合物、纤维素与葡萄糖氧化酶的共价结合物等。包埋法是将酶(细胞)限制于凝胶网格内或微囊中的技术,如底物及产物为易溶于水的小分子时,可采用此法制备固定化生物催化剂。载体有聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶、琼脂、血纤维、胶原蛋白、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酸高聚物等,如聚丙烯酰胺凝胶包埋DΟ果糖二磷酸醛缩酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和卡拉胶包埋黄色短杆菌、大肠埃希菌等。选择性热变性技术是将酶限制于细胞内,但细胞内酶不变性的技术,如将白色链球菌于60℃加热10m in即成为具有葡萄糖异构酶活性的固定化白色链球菌。在制药工业中包埋法应用较多,其次是吸附法。 由于底物和产物性质、酶的性能反应特点及所有反应器类型的差异,要采用不同物理形状的生物催化剂。目前已用的生物催化剂有酶膜、酶片、酶块、酶纤维、酶珠、酶管和酶微囊等形状。 固定化细胞包括微生物细胞、动物细胞和植物细胞,目前更多地注重活细胞和增殖细胞的固定化。
名词解释 第一章酶学与酶工程 酶：生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学。从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。 单体酶（monomeric enzyme）：由一条多肽链组成，如溶菌酶；由多条肽链组成，肽链间二硫键相连构成一整体。 寡聚酶（oligomeric enzyme）：由两个或两个以上的亚基组成的酶。 多酶复合体（multienzyme complex）：由几种酶非共价键彼此嵌合而成。 催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。 酶活力(酶活性)：指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小：一定条件下所催化的某一化学反应的反应速度， 酶反应速度：单位时间内底物的减少量或产物的增加量。 酶的活力单位（U，activity unit）：酶活力的大小及酶含量的多少。 酶单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。 Katal（Kat）单位：一个katal单位是指在最适反应条件下，1秒钟催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。 酶的比活力（specific activity）：代表酶的纯度，比活力用每mg蛋白质所含有的酶活力单位数表示。对同一种酶比活力愈大，纯度愈高。 酶的转换数：以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数来表示酶的催化效率。 酶动力学：是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。 抑制剂:任何分子直接作用于酶使他的催化速度降低即称为~。 不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活性丧失，不能用透析，超滤或凝胶过滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。 可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活。 第二章酶的发酵生产 酶的生物合成：生物体在一定的条件下都能产生多种多样的酶。酶在生物体内产生的过程，称为~。 酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产——是现在酶生产的主要方法。 固体发酵法（麸曲培养法）：以麸皮和米糠为主要原料，添加谷糠、豆饼，无机盐和适量水分，制成固体或半固体状态，经灭菌、冷却后，供微生物生长和产酶用。 液体表面发酵法：将已灭菌的液体培养基接种后，装入可密闭的发酵箱内的浅盘中，液体厚约1~2cm，然后向盘架间通入无菌空气，维持一定的温度进行发酵。 液体深层发酵法：采用液体培养基，置于发酵罐中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。 保藏：性能优良的产酶细胞选育出来后，必须尽可能保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。 细胞活化：保藏细胞在使用前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这叫做~。