酵母菌的表达系统
生物工程一班
覃懿
学号：200810902058
内容摘要：
基因表达式是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术至北大的各种的目的基因的重组蛋白质，在分析基因表达的调控、基因结构与功能、基因治疗已经生物制药的领域均取得了令人阵风的成果。其中酵母表达系统拥有转录有加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外援蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。
关键词：酵母菌、表达、基因、系统
酵母的生长代谢特征与大肠杆菌有许多像是之处，但在基因表达调控模式尤其是转录水平上与原核细菌有着本质的区别，因此酵母菌是研究真核生物表达调控的理想模型。外源基因在酵母中高效表达的关键是选择高强度的启动子，改变受体细胞基因基底水平转录的控制系统。下面主要以酿酒酵母为例做阐述。
0．酵母菌表达体统的特点
首先酵母是真核生物，毒性比细菌小；其次酵母繁殖速度快，能进行高密度培养，并且能够耐受较高的流体净压，因此，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力；第三，酵母菌表达的外源蛋白可分泌到细胞外并可以使某些蛋白质糖基化而更加稳定，便于产品的分离纯化；第四，酵母菌（主要是酿酒酵母）的分子生物学研究已取得重大进展，已完成了基因组DNA的序列分析，它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，因此，酵母作为基因工程的表达系统特别是在大分子真核生物基因表达方面得到日益广泛的应用]。自从Hitzeman等在1981年用酵母细胞表达人干扰素基因获得成功后，随后又成功地表达了其它多种原核和真核生物的基因[124]。
但是酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。
1．酵母菌启动子的基本特征与选择
用于启动转录蛋白质的结构基因的酵母菌II型子有基本区域和调控区域两部分组成，基
本区包括TATA盒和转录起始位点。
在酿酒酵母中，转录起始位点位于TATA盒下游30~120bp的区域内，但非洲酒裂酵母的mRNA合成位点紧邻TATA盒，与高等真核生物的启动子结构十分相似。这两种来源的启动子在启的动基因转录方面具有交叉活性，但其转录起始位点的选择与宿主系细胞的性质密切相关。例如，非洲裂解酵母的基因在酿酒酵母细胞中的转录起始位点位于其正常转录起始位点的下游，而酿酒酵母的基因在非洲裂解酵母细胞的转录却在其TATA盒的邻近区域开始，也就是说，同一个基因的转录产物在两种宿主细胞中的大小并不一致，这种现象有可能直接影响mRNA的翻译过程，因此启动子与受体细胞之间的合理匹配对异源基因在酵母菌中的表达起着重要做用，一般而言，II型 mRNA聚合酶启动mRNA合成的最佳位点位于TATA盒下游40~140bp区域内。酵母菌启动子的调控区位于基本位于上游几百碱基对的区域内上游激活序列（UAS）和上游位阻序列（URS）等顺式元件组成。这些元件均为相应的反式蛋白调控因子的作用位点，并激活或关闭有TATA盒介导的基因转录，而反式蛋白调控因子的表达及其活性状态的该表又受到特异性分信号分子的影响，由此构成酵母菌基因表达的时空特意调控网络。
获得强启动子可以从已有的启动子中构建杂合启动子。例如，将酿酒酵母的乙醇脱氢酶II基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛—3—磷酸脱氢酶基因（GAP-DH）所属启动子的下游基因本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子。ADH2 启动子为葡萄糖阻遏并可用乙醇诱导，而GADPH启动子是酿酒酵母细胞中表达最强的组成型表达启动子。用这个杂合启动子表达人胰岛素与超氧化歧化酶的融合基因，克隆菌在富含葡萄糖的培养基上迅速生长，但不表达融合蛋白；当葡萄糖耗尽后，融合蛋白获得高效表达。
2．酵母菌启动子的可调控表达系统
外源基因的定时可控性表达对重组微生物高产异源蛋白至关重要，尤其当高浓度的表达产物对受体菌有毒性作用时，重组细胞必须在生长到一定密度后才能诱导外源基因的表达。目前广泛使用的酵母菌课控性启动子表达系统有半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸启动子（PHO）等。
（1）温度控制表达系统
酿酒酵母PHO5基因通常在培养基中游离磷酸盐耗尽时被诱导高效表达，将PHO5启动子与ɑD-干扰素基因重组，转化子在高磷酸盐的培养基中30℃迅速生长，当将之转移到不含磷酸盐的培养基中，其合成干扰素的能力提高100-200倍。PHO5基因的编码产物是PHO5基因表达的正调控子，其温度敏感性突变基因ph04TS的编码产物在35℃时失活，因此含有ph04TS-PHO5型启动子的克隆菌在35℃时能正常生长，但不表达外源基因。当培养温度下降到23℃时，ph04TS基因表达的正确调控因子促进PHO5启动子的转录启动活性，进而诱导其下游外源基因的表达。、
酿酒酵母的a型和α型两种单倍体由位于交配类型遗传位点的MATa和MATα等两个等位基因共同决定。
具有MATa-hmlα2-102-sir3-8TS基因型的酵母细胞在25℃培养时，应具有a交配类型，
因为此时仅有MATa基因能表达,hmlα2-102为Sir蛋白所阻遏；但当这种细胞生长在35℃时，MAT和HML均能表达，只有α2基因被阻遏，因此细胞呈现α交配类型。当外源基因于a特异性基因的启动子控制之下时，a交配型的受体细胞在25℃时可表达这基因，但在35℃式不表达；相反，如果外源基因与α特异性基因的启动子重组，则它仅在35℃时表达，而在25℃时不表达。
（2）超诱导表达系统
当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基中时，其GAL1、GAL7、GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或葡萄糖时，启动子活性被诱导1000倍。
半乳糖的诱导作用与GAL4基因和GAL80蛋白质的性质密切相关，GAL4编码一种调控蛋白，能与GAL1、GAL7、GAL10启动子上游的UAS特异性结合，GAL80蛋白则是GAL4因子的拮抗剂。在一般情况下，GAL4基因表达的水平较低，限制了半乳糖诱导作用的程度，这种情况当外源基因克隆在含有半乳糖的启动子的多拷贝质粒上时表现的尤为突出。在此系统中过量表达原来属于组成型表达的GAL4基因并不能解决问题，因此此时GAL启动子已转入组成型表达状态。
将野生型的GAL4基因置于GAL10启动子调控之下，并将这个基因表达序列整合在酿酒酵母的染色体DNA上，可以提高半乳糖的诱导效果。
3．外源基因在酵母菌中表达的限制性因素
(1)重组异源蛋白低产率的主要原因是稳定态的mRNA的水平降低，而非表达产物的产物的不稳定性。例如将α-干扰素基因插在野生型PGK表达单元内部，即PKG结构基因终止密码子下游处16bp处，则融合基因转录出的mRNA中含有人α-干扰素的编码序列。
（3）mRNA的翻译活性是外源就基因低水平表达的第二大限制因素。
（4）密码子的偏爱性控制基因表达的产物丰度模式在真核生物细胞中也相当普遍。在酿酒酵母中，高丰度蛋白质中96%以上的氨基酸参加是有25个密码子编码的，它们对应于异常活跃的高组分tRNA，而为第组分tRNA识别的密码子基本上不使用。利用DNA技术将野生型PKG基因中的高成分密码子分别更换使用频率较低的兼并密码子，则突变基因表达水平的降低程度与突变密码子占编码序列中密码子总的比例成正相关，其中更换164个密码子PKG突变基因的表达水平比野生型的PKG下降为10%。
（5）在使用酵母菌启动子和终止子等基因表达调控元件的前提下，异源基因的表达水平与稳定态mRNA的半衰期密切相关。如果外源基因mRNA的半衰期足够长，那么即便它含有许多对于与酵母菌低成分tRNA密码子，受影响的只是重组异源蛋白的合成速率，不至于大幅度降低蛋白质最终含量。但外源基因在酵母菌中的低效率表达恰恰表现其mRNA 不稳定性上。外源基因在较短的半衰期内，由于密码子与tRNA的不对应性，蛋白质的生物合成速率下降，导致最终异源蛋白的合成总量减少。
酵母菌PKG基因mRNA的半衰期随着简并密码子的更换程度而缩短，含有164个突变
密码子的PKA基因，其稳定态转录产物mRNA的含量只有野生型的mRNA的30%。说明，酵母菌tRNA与外源基因密码子的不匹配行不仅仅影响mRNA的翻译速率，更主要的是降低mRNA结构的稳定性，两者共同导致外源基因表达水平的下降。
4．酵母菌表达系统的选择
酵母菌的宿主载体系统已成功得用于多种重组的异源蛋白的生产，但也暴露出一些问题。如由于乙醇发酵途径的异常活跃导致生物大分子合成代谢普遍受抑制，因此外源基因的表达水平不高。酿酒酵母细胞能使重组异源蛋白超糖基化，这使得有些异源蛋白与受体细胞紧密结合而不能大量分泌。但上述缺陷可以用非酿酒酵母型的其他酵母表达系统来弥补，包括克鲁维酵母，巴斯德毕赤酵母和多型汉逊酵母等。
（1）乳酸克鲁维酵母表达系统
克鲁维酵母属长期用于发酵β—半乳糖苷酶。含自主复制序列及LAC4乳糖利用基因的质粒高频转化酵母菌也是在克鲁维酵母菌中首次证实的。由果蝇克鲁维酵母中分离出来的双链环状质粒Pkd1已被广泛用作重组异源蛋白生产高效表达的稳定性载体。有PKD1构建的各种衍生质粒，即使在没有选择压力存在的情况先下，也能在许多可鲁维酵母菌中稳定遗传。此外，乳酸克鲁维酵母整合系统也相继建立起来，其中以高拷贝整合质粒Pmirk1最为常用，它由乳酸克鲁维酵母的5S、17S、26S、rDNA、无启动子的trpl-d基因以及大肠杆菌质粒PMIRK1的多拷贝整合能使外源基因获得更高的表达水平，转化子也更稳定。
以乳酸克鲁维酵母表达分泌系统和非分泌型的重组异源蛋白，均优于酿酒酵母系统。由PKD1衍生质粒构建的人血清白蛋白基因重组子在乳酸克鲁维酵母中的分泌水平远远比酿酒酵母要高，而且在分泌过程中，重组蛋白能正确折叠。
（2）巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，它能在相对廉价的甲醇培养基中生长。培养基中的甲醇可高效诱导甲醇的代谢途径各酶编码的基因表达，其中第一步反应的乙醇氧化酶基因AOX1，在甲醇培养基中生长的巴斯德毕赤酵母细胞可积累占总蛋白30%的AOX1 酶。因此，生长迅速、AOX1基因的强启动子及其表达的课诱变性是该酵母菌作为外源基因表达的三大优势。现在使用的巴斯德毕赤酵母受体菌大多是组氨醇脱氢酶的缺陷株，这样表达质粒上的his标记基因可用来正向晒选转化子。尽管两个自主复制序列PARS1和PARS2已从毕赤酵母菌属基因文库中克隆并鉴定，但由此构建的自主复制型质粒在该菌属中不能维持，而通常将外源基因通过一系列的表达载体整合入受体细胞的染色体DNA上。
（3）多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。这种酵母的两个自主复制序列HARS1和HAR2已被克隆，但与入世克鲁维酵母和巴斯德酵母相似，由HARS构建的自主复制型质粒在受体细胞有丝分裂时显示出出稳定性。不同的是，这种质粒能以较高的频率自发的整合在受体细胞的染色体DNA上，有的HARS型表达载体还可以在染色体上整合多达100多个拷贝，因而重组多型汉逊酵母的构建同样可以采用整合的策略。
参考文献:
1.谢友菊. 遗传工程概论. 北京, 北京农业科技大学出版社；1993
2.吴梧桐.基因工程药物-基础与临床. 北京：人民卫生出版社，1996
3.俞俊棠，唐孝先. 生物工艺学. 上海：华东化工学院出版社，1991
4.张惠展.途径工程-第三代基因工程. 北京：中国轻工业出版社，2002
5.张惠展. 基因工程概论. 上海：华东理工大学出版社，1999
6.孙乃恩，孙东旭. 分子遗传学. 上海：南京大学出版社，1990
7.孙丽萍，吴海珍，张惠展. 第三代基因工程-代谢工程.药物生物技术，2000
8.吴乃虎. 基因工程原理(上册). 第二版.北京：科学出版社，1998
9.王建勋，陈松森. RNA功能研究进展. 生命的化学，1996
10.黄东勇，黄建生，郭明秋. 白介素15. 生命的化学. 1996
11.沈同，王镜岩.生物化学.第二版. 北京:高等教育出版色。1990
第二章基因工程工具酶 一、解释下列名词 1、Restriｃtiｏn and ｍｏdificａｔion（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质(DNA）得现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主得限制作用称为修饰。 ２、 Matched enｄｓ（or cohesive ｅnｄ）（匹配末端或粘性末端)识别位点为回文对称结构得序列，经限制酶切割后,产生得相同得，互补得末端称为匹配粘端，亦即粘性末端 ３、 Blｕｎt ｅndｓ平末端。在回文对称轴上同时切割DNＡ得两条链，产生得没有碱基突出得末端称为平末端。 4、Ｓtar ａctiｖiｔy星星活性。在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似得序列，这个改变得特殊性称星星活性。 5、 KlｅnoｗfrａｇｍeｎｔＫｌenow 片段。KlｅnoｗDNA聚合酶就是E、col ｉＤNA polymｅrase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去5’——3’ 外切活性得多肽大片段,而聚合活性与3＇-—5' 外切活性不受影响. 6、Rｅveｒse trａnsｃriｐtasｅ反转录酶。即依赖于RNA 得ＤNA 聚合酶，它有５’--3＇合成DNA 活性,但就是无3’——５＇外切活性。 7、Ｔermiｎａｌｔransferaｓe（末端转移酶) 8、Ligase连接酶。催化DＮA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来得酶。 9、T４polyｎuｃｌeｏtide kinase（T4多聚核苷酸激酶)催化AＴP得γ-磷酸基转移至ＤＮＡ或ＲNA 得5' 末端。 1０、Alkalｉne phosphatａse（碱性磷酸酶）催化除去ＤNＡ或RNA ５' 磷酸11、S1 ｎｕcleａse Sｌ核酸酶.可降解单链DNA 或RNA ，产生带5＇磷酸得单核苷酸或寡核苷酸双链;对dsＤＮA,dｓＲNA ，DNＡ：ＲNA杂交体不敏感。 二、填空题 １、限制性内切核酸酶（Ｒestriction eｎｄonucleａse)得命名就是按属名与种名相结合得原则得，通常第一个大写字母取自（属名得第一个字母 ),第二、三个字母取自（种名得前两个字母）,第四个字母则用(菌株名）表示。 ２、Ⅱ型限制酶识别回文对称序列,在回文序列(内部)或（附近）切割DNA,产生带3'－OH 与5’-P基团得ＤNＡ得产物，需（Mg2+)得存在才能发挥活性,相应得修饰酶只需SＡM。 3、识别相同序列得限制酶称（同裂酶） 4、ＤNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端,能发生载体自连，影响载体与外源DＮA得连接效率,常用得防止载体自连得方法有(去磷酸化)、(部分补平)。 5、完全得回文序列应具备两个特点即(能够在中间划一个对称轴，两侧得序列两两对称互补配对)与（两条互补链得5'-—3’ 得序列组成相同，即将一条链旋转１80°，则两条链重
第二章习题 一、单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ） A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是（ A ） A. 37℃ B.30℃ C.25℃ D.16℃ E.33℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）
高中生物基因工程知识详解 高中生物基因工程的基本工具 1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶( 限制酶) (1) 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2) 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 (3) 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2. “分子缝合针” 一一DNA连接酶 (1) 两种DNA1 接酶(E•coliDNA 连接酶和T4-DNA 连接酶) 的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E•coliDNA 连接酶来源于T4 噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起 来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2) 与DNA聚合酶作用的异同：¬¬¬DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3. “分子运输车”——载体 (1) 载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保 存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2) 最常用的载体是¬¬ 质粒, 它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3) 其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒高中生物基因 工程的应用 1. 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2. 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3. 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 误区提醒 ①动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。 ② DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开。 ③ Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫
基因工程的诞生 ?1. 进化论Darwin 2. 细胞学说的建立M. Schleiden and T. Schwann（1839） ?3. 遗传学说的建立1）遗传学说创始G. Merdel 提出独立分配定律（1865） ?2）染色体（chromosome）遗传学说.W. S. Sutton（1903） ?3）基因定位T. H. Morgan 提出连锁定律（1915） ?4）基因载体（gene vector）O. T. Avery，C. M. Macleod and M. McCarty（1944） ?4. 分子生物学 ?1）DNA双螺旋结构的发现Watson and Crick（1953） ?2）DNA复制模式的破解M.Meselson and F. W. Stahl（1958） ?3）中心法则的确立F. Crick(1958) ?4）密码子（codon）破译F.Crick，S. Brenner等多人（1961~1966） ?5. 基因工程创始 ?1）SV和入phage DNA重组P. Berg and H. Boyer（1972） ?2）R6-5 质粒和PSC101的DNA重组S. Cohen（1973） ?3）PSC101和非洲爪蟾核糖体DNA重组S. Cohen and H. Boyer（1973） 1 基因工程的基本概念A 重组DNA技术的基本定义B基因工程的基本定义 C重组DNA技术与基因工程的基本用途D基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的基本定义 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 B 基因工程的基本定义（基因工程说的是在脱氧核糖核酸上进行手术）基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 1、分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 2、大规模生产生物活性物质 3、设计、构建生物的新性状甚至新物种 D 基因工程的基本形式 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程
有关转基因植物争论的看法摘要与前言：植物转基因工程是指通过基因枪等基因工程手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系令列人鼓舞的成果。毫无疑问,能够按照人类意愿来“创造”优良作物新品种的植物基因工程近年来所取得的长足进展是激动人心的,它必将为未来农业的发展和满足人类日益增长的器要发挥巨大的作用。但是.在给人们带来明显经济效益和社会效益的同时,植物基因工程也可能带来一些重大的潜在危险。所以.必须从利弊两方面来考虑转基因植物的最终应用，并要对其做出正确的安全性评价。
目录 一：什么是转基因植物。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。3 二：转基因植物的发展方向。。。。。。。。。。。。。。。。。。。4 三：转基因安全性评价。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。5 四：对转基因争论的看法。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。6
一：什么是转基因 转基因植物是经过遗传改良进天然物种不具有基因序列的植物。这些基因序列来自不同的物种，并通过引入改变植物的一些基本特性。农作物是最经常实施转基因工程的植物，能通过引入新遗传材料提高产量和品质。 其中一些能培育进这些转基因植物的优良品质包括抗病虫害，提高产量，更高品质的水果、蔬菜或花卉，以及天气条件耐受性增加等。在发明人工插入新遗传材料之前，植物只是简单的在同一物种中找出最好的种子加以培育以期获得更高产量和品质。而转基因能让这一过程变的更有效。 首先要做的是确定需要替代的基因。DNA的每一个部分都管辖不同的植物部位。遗传专家必须确定用哪些基因控制每一个特定过程，并确定要被替代的植物部分。在本土环境中，植物通过授粉过程获得新遗传材料。转基因植物可以通过多种方式在这一过程中人工插入新信息。例如，基因枪是一个把新DNA通过细胞壁直接注射进植物细胞的新技术。这种方法在单子叶植物植入过程中很受欢迎。 在创造转基因双子叶植物时，农杆菌介导法最成功。该过程把基于土壤的农杆菌当做载体。在注入新的DNA后，细菌被导入植物根茎附近的土壤。这种独特的菌株会侵入植物并用植物自己的细胞再生，然后引入新的遗传品系。
基因工程强化训练（精品） 1．(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_________________________________________________________________ ___________________________________________________(答出两点即可)。 (2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。 2、(2018·天津卷，10)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。 (2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。 (3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程 序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因； 利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二
酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA 聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。 ②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性内切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分内容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习内容，不能仅仅着眼于记住这几 个条件，而应该深入思考每一个条件的内涵， 通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些 条件才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链
基因工程难题详细解析 1.一位科学家正在使用氨苄青霉素敏感型菌株进行研究，该菌株不能利用乳糖，这是因为它的乳糖操纵基因异常。该科学家有两种质粒，一种含有正常的乳糖操纵基因，另一种含有氨苄青霉素抗性基因。她运用限制酶和DNA连接酶，获得了一些含有这两个基因的重组质粒。然后在一个仅以葡萄糖为唯一能源的培养基中培养该细菌，并向其中加入高浓度的重组质粒，使细菌增殖。再将实验组细菌（含重组质粒）和对照组细菌（不含重组质粒）放人下图所示环境中让其生长。请回答下列问题： （1）在基因工程的基本操作程序中，______________是基因工程的核心。限制酶是基因工程中常用的工具，若要提取限制酶，可选择的生物是______________ （举出一例）。本实验中使用限制酶的作用是：____________________________。 （2）在以葡萄糖为唯一能源的培养基中加入高浓度的质粒，为了促进细菌更好的吸收重组质粒，还应用______________处理细菌，使细菌处于______________。该培养基以葡萄糖为能源是因为__________________________________________。 （3）若没有新的突变发生，细菌最有可能在哪些培养基上生长出菌落?（） A．只有1、2和4号B．只有3、5和6号C．只有1、2、3和4号D．只有4、5和6号 （4）如果在准备制作重组质粒时未使用DNA连接酶，则细菌最可能在______________号和______________号平板上长出菌落。 （5）若该科学家用该培养基进行另一项实验如下图，在该培养基中用乳糖为唯一能源，则细菌能在哪一培养基中长出菌落（） A．只有10号 B．只有8号 C．7号和8号 D．8号和10号 1（1）基因表达载体的构建 大肠杆菌（只要答出的生物属于原核生物即可给分，只答原核生物不给分） 在质粒DNA上切割（合理给分） （2）Ca2+感受态葡萄糖是单糖，可被细菌吸收，确保细菌均能在此培养基中均能正常生长（意思对即或给分） (3) C (4) １号4号(5) C 1解析（1）限制酶主要存在于原核生物（2）乳糖只能被被部分细菌利用，所以不能用乳糖 (3) 5号和6号培养基都存在氨苄青霉素，但不含重组质粒的菌株无氨苄青霉素抗性基因 (4) 未使用DNA 连接酶时，含重组质粒的菌株只含乳糖操纵基因或只含氨苄青霉素抗性基因。不管哪种重组质粒，都可在1号平板上长出菌落，但只含乳糖操纵基因的菌株不能在2号或3号培养基上生存(5) 含重组质粒的菌株既
酵母菌的表达系统 生物工程一班 覃懿 学号：200810902058 内容摘要： 基因表达式是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术至北大的各种的目的基因的重组蛋白质，在分析基因表达的调控、基因结构与功能、基因治疗已经生物制药的领域均取得了令人阵风的成果。其中酵母表达系统拥有转录有加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外援蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。 关键词：酵母菌、表达、基因、系统 酵母的生长代谢特征与大肠杆菌有许多像是之处，但在基因表达调控模式尤其是转录水平上与原核细菌有着本质的区别，因此酵母菌是研究真核生物表达调控的理想模型。外源基因在酵母中高效表达的关键是选择高强度的启动子，改变受体细胞基因基底水平转录的控制系统。下面主要以酿酒酵母为例做阐述。 0．酵母菌表达体统的特点 首先酵母是真核生物，毒性比细菌小；其次酵母繁殖速度快，能进行高密度培养，并且能够耐受较高的流体净压，因此，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力；第三，酵母菌表达的外源蛋白可分泌到细胞外并可以使某些蛋白质糖基化而更加稳定，便于产品的分离纯化；第四，酵母菌（主要是酿酒酵母）的分子生物学研究已取得重大进展，已完成了基因组DNA的序列分析，它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，因此，酵母作为基因工程的表达系统特别是在大分子真核生物基因表达方面得到日益广泛的应用]。自从Hitzeman等在1981年用酵母细胞表达人干扰素基因获得成功后，随后又成功地表达了其它多种原核和真核生物的基因[124]。 但是酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。 1．酵母菌启动子的基本特征与选择 用于启动转录蛋白质的结构基因的酵母菌II型子有基本区域和调控区域两部分组成，基
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
基因工程课程习题选择题 001 基因工程操作的三大基本元件是【Ａ】 I 供体II 受体III 载体IV 抗体V 配体 ＡI + II + III ＢI + III + IV ＣII + III + IV ＤII + IV + V ＥIII + IV + V 002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】 I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV Ｅ I + II + III + IV 003 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】 Ａ基因诱变 Ｂ分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ遗传工程 Ｅ基因无性繁殖 004 基因工程的单元操作顺序是【B】 Ａ增，转，检，切，接 Ｂ切，接，转，增，检 Ｃ接，转，增，检，切 Ｄ检，切，接，增，转 Ｅ切，接，增，转，检 005 下列有关基因的叙述，错误的是【A】 Ａ蛋白质是基因表达的唯一产物 Ｂ基因是 DNA 链上具有编码功能的片段 Ｃ基因也可以是 RNA Ｄ基因突变不一定导致其表达产物改变结构 Ｅ基因具有方向性 006 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【D】 Ａ修复自身的遗传缺陷
Ｂ促进自身的基因重组 Ｃ强化自身的核酸代谢 Ｄ提高自身的防御能力 Ｅ补充自身的核苷酸消耗 007 天然 PstI 限制性内切酶的来源是【D】 ＡBacillus amyloliquefaciens ＢEscherichia coli ＣHaemophilus influenzae ＤProvidencia stuartii ＥStreptomyces lividans 008 T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【D】 Ａ 2' -OH 和 5' -P Ｂ 2' -OH 和 3' -P Ｃ 3' -OH 和 2' -P Ｄ 3' -OH 和 5' -P Ｅ 5' -OH 和 3' -P 009若载体 DNA 用 M 酶切开，则下列五种带有 N 酶粘性末端的外源 DNA 片段中，能直接与载体拼接的是【D】 M N Ａ A/AGCTT T/TCGAA Ｂ C/CATGG ACATG/T Ｃ CCC/GGG G/GGCCC Ｄ G/GATCC A/GATCT Ｅ GAGCT/C G/AGCTC 010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是【B】 Ａ质粒是共价环状的双链 DNA 分子 Ｂ天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列 Ｃ质粒在宿主细胞内能独立于染色体 DNA 自主复制 Ｄ松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增 Ｅ质粒并非其宿主细胞生长所必需 011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】 Ａ穿梭质粒 Ｂ表达质粒 Ｃ探针质粒 Ｄ整合质粒 Ｅ多拷贝质粒
生物选修3专题一基因工程习题 一．单选题： 1．下列有关基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．DNA 连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 B ．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C ．目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外 D ．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 2．下列关于基因工程的叙述，正确的是：（ ） A ．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B ．细菌质粒是基因工程常用的运载体 C ．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA ，用另一种处理运载体DNA D ．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 3．下列四条DNA 分子，彼此间具有粘性末端的一组 （ ） ① ② ③ ④ A ．①② B ．②③ C ．③④ D ．②④ 4．下面图中a 、b 、c 、d 代表的结构正确的是：（ ） A ．a —质粒RNA B ．b —限制性外切酶 C ．c —RNA 聚合酶 D ．d —外源基因 5．目的基因与运载体结合所需的条件是：（ ） ①同一种限制酶 ②具有标记基因的质粒 ③RNA 聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA 连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A ．①②③④⑤⑥⑦ B ．①②④⑤⑥⑦ C ．①②③④⑤⑦ D ．①②④⑤⑦ 6．科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA 分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用的方式进入细胞内，DNA 被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA 整合到细胞染色体中的过程，属于( ) A ．基因突变 B ．基因重组 C ．基因互换 D ．染色体变异 7．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 A . 提高受体细胞在自然环境中的耐药性 ( ) B. 有利于对目的基因是否导入进行检测 C. 增加质粒分子的分子量 D ．便于与外源基因连接 8．下列不可作为基因工程中的标记基因的是：（ ） A ．抗性基因 B ．发光基因 C ．产物具有颜色反应的基因 D ．贮藏蛋白的基因 9．如果科学家通过转基因工程，成功地把一名女性血友病患者的造血干细胞进行改造，使其凝血功能恢复正常。那么，她后来所生的儿子中：（ ） A ．全部正常 B ．一半正常 C ．全部有病 D ．不能确定 10．下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是：（ ） 11．1987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明：（ ） ①萤火虫与烟草植物的DNA 结构基本相同 ②萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 ③烟草植物体内合成了萤光素 ④萤火虫和烟草植物合成蛋白质的方式基本相同 A ．①和③ B ．②和③ C ．①和④ D ．①②③④ 12．人们常用DNA 进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA ，用限制性内切酶将DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA 小片段分离，再使用特别的DNA “探针”去寻找特定的目的基因。DNA “探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X 光下，便会显示由DNA 探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA 的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA “探针”是指：（ ） A ．某一个完整的目的基因 B ．目的基因片段的特定DNA C ．与目的基因相同的特定双链DNA D ．与目的基因互补的特定单链DNA 13．2003年我国科学工作者用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用及机理是：（ ） A ．治疗“非典”,利用的是抗原抗体反应 B ．诊断“非典”,利用的是DNA 分子杂交原理 C ．诊断“非典”，利用的是抗原抗体反应 D ．治疗“非典”，利用的是DNA 分子杂交原理 T A G G C C A T T A C C G G T A
1.2基因工程的基本 操作
1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 知识与技能： 1.简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 2.简述基因工程的原理和基本步骤 能力目标
1.学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 2.尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 情感态度与价值观 1.关注基因工程的发展 2.认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学过程： 第1课时 （一）、目的基因获取： 1.目的基因 (1)主要是指编码蛋白质的基因。(2)也可以是一些具有调控作用的因子。2．获取方法 (1)从基因文库中获取： ①基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。 ②
重组子(recon):两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。 重组子(recombinant), 含有重组DNA分子的转化细胞。 穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析. Spi筛选:野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coil的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。（这种生长抑制作用是受λ噬菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coil中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组λ噬菌体。 1、外源基因导入植物细胞方法及原理？ 以载体为媒介的基因转移和基因或DNA的直接转移。所谓以载体为媒介的基因转移就是将目的基因连于某一载体DNA上，然后通过寄主感染受体植物等途径将外源基因转入植物细胞的技术。DNA的直接转移是指利用植物细胞生物学特性，通过物理、化学和生物学方法将外源基因转入植物细胞的技术。 叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。 农杆菌介导的遗传转化是大多数双子叶植物转化中常采用的方法，但由于农杆菌具有宿主局限性，极少能感染单子叶植物，特别是一些重要的农作物如水稻、小麦、玉米等对农杆菌不敏感，难于应用此法进行遗传转化。 基因枪法基因枪法又称粒子轰击技术（particle bombardment）。这一方法是用粒子枪把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速地射进植物细胞或组织。由于此法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，转化率又高，被转化的细胞或组织容易再生成植株，因而颇受关注。 微注射法微注射法（microinjection）是利用显微注射仪等，通过机械的方法将外源基因或DNA直接注入细胞核或细胞质。与其他方法相比，这个方法对外源遗传物质的导入更为直接和有效。 电激和电注射法电脉冲能改变细胞膜的透性。通过高压电脉冲的电激穿孔作用把外源DNA 引入植物原生质体的方法就称为电激法（electroporation）。这种方法现已较广泛地应用于单子叶和双子叶植物以及动物的基因转移，如20世纪80年代末用此法将新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因转入玉米自交系的原生质体，已再生成植株。 2、真核基因在大肠杆菌表达的困难及解决办法？ 真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白，其原因是：第一，大肠杆菌细胞内不具备真核生物的蛋白质复性系统，许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成出无特异性空间结构的多肽链；第二，与其它原核细菌一样，大肠杆菌缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性恰恰依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用；第三，大肠杆菌内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；第
扬州大学附属中学东部分校2015 寒假高二生物选修 《基因工程》专题测试题 班级学号姓名 一、选择题 1．有关蛋白质合成的叙述，不正确的是 A．终止密码子不编码氨基酸 B．每种 tRNA 只运转一种氨基酸 C． tRNA 的反密码子携带了氨基酸序列的遗传信息 D．核糖体可在mRNA上移动 2．酶 A、 B、 C 是大肠杆菌的三种酶，每种酶只能催化下列反应链中的一个步骤，其中任意一种酶的缺失均能导致该菌因缺少化合物丁而不能在基本培养基上生长。 现有三种营养缺陷型突变体，在添加不同化合物的基本培养基上的生长情况如下表： 由上可知：酶A、 B、 C 在该反应链中的作用顺序依次是 A．酶 A、酶 B、酶 C B．酶C．酶 B、酶 C、酶 A D．酶A、酶C、 酶 C、酶B、 酶 B A 3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的 基因完成了在受体细胞中表达的是 A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 4．已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有 3 个酶切位点，如图中箭头所指，如果该 线性 DNA分子在 3 个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、 c、 d 四种不同长度的 DNA 片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA 分子上至少有 1 个酶切位点被该酶切断，则从理论 上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生 长度不同的 DNA片段种类数是 线性 DNA分子的酶切示意A． 3B． 4C．9D． 12 5．现有一长度为 1000 碱基对（ bp）的 DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI 酶切后得到的DNA分子仍是 1000bp，用 KpnI 单独酶切得到 400bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子，用 EcoRI 、KpnI 同时酶切后得到 200bp 和 600bp 两种长度的 DNA分子。该 DNA分子的酶切图谱正确的 是 6．已知基因表达载体中的复制原点处比较容易打开双链，可以推断该处 A． A+T的比例较高B．C+G的比例较高 C．位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位 D．位于基因的尾端，是转录停止的信号 7．下列有关基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是 A．在特定的切点上切割B．活性受温度的影响 C．能识别和切割RNA D．可从原核生物中提取 8．下列有关基因结构的叙述，正确的是 A． . 真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的序列 B．原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的 C．非编码区是两个基因之间没有遗传效应的区段 D．终止密码子的作用是阻碍RNA聚合酶的移动