《酶工程》复习题
名词解释：
Enzyme production酶的生产（enzyme production）：通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物发酵产酶和酶的提取与分离纯化等。
Enzyme improving酶的改性(enzyme improving)：通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。
Enzyme application酶的应用(enzyme application)：通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括偶酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等
cellular activation细胞活化保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。
immobilized cell固定化细胞 固定化细胞又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。
immobilized enzyme固定化酶（immobilized enzyme）：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶
site directed mutagenesis定点突变技术（site directed mutagenesis）：在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
enzyme directed evolution酶的定向化进化：是模拟自然进化的过程，进行人工随即突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。
error-prone PCR易错PCR技术 从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变
DNA shuffling基因重排技术 从两条以上的正突变基因出发，经过酶切，不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变
gen family shuffling基因家族重排技术 从基因家族的若干同源基因出发，经过酶切和不加入引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变
microaqueous media微水介质体系
肽链有限水解修饰 在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。
填空：
1960年，Jacob和Monod提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。
1926年，Sumner首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质，后来一系列酶的研究都证实酶的化学本质是蛋白质。
1982年，Thomas R.Cech等发现四膜虫细胞的25S rRNA前体具有自我剪切功能，认为RNA具有催化活性，并将其称为核酸类酶。
1969 年日本千佃一郎首次应用固定化氨基酰化酶从混合氨基酸中大规模生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工
业化应用的新纪元。
国际酶学委员会按照酶催化作用的类型将酶分为：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶（合成酶）等六大类。
酶生物合成的模式分是 同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。影响酶生物合成模式的主要因素是酶所对应的mRNA的稳定性和培养基中阻遏物的存在与否。在酶的发酵生产中， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。
在细胞生长和发酵产酶过程中，温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。
微生物发酵产酶过程中，提高酶产量的有效措施主要有添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂、添加产酶促进剂等。
可逆抑制作用可分为竞争性，反竞争性，非竞争性，混合性；
对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。
发酵过程中，被消耗的基质主要用于细胞生长、产物生成和维持细胞的正常新陈代谢三个方面。YX/S为细胞生长得率系数，YP/S为产物生成得率系数。
一般产酶动力学方程可表达为：，对同步合成型的酶，其产酶与细胞生长偶联，可表示为；延续合成型的酶为部分生长偶联，可表示为；滞后合成型的酶其合成模式为非生长偶联型，可表示为。
酶反应器的种类很多，按照操作方式可分为分批反应(batch)、连续反应(continuous)和流加分批反应(feeding batch)三种。游离酶催化反应最常用的反应器是搅拌罐式反应器，对于有气体参与的游离酶催化反应，通常采用的反应器是鼓泡式反应器；应用固定化酶进行反应，为了提高酶的催化效率，通常采用连续反应的操作方式。
植物细胞培养方式有固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等，在次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。
植物细胞培养的一般工艺过程为：外植体 --> 细胞的获取 --> 细胞培养 --> 分离纯化 --> 产物。
大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜用贴壁培养；部分细胞如肿瘤细胞和杂交瘤细胞等可用悬浮培养。
酶提取受到温度、pH、提取液体积等外界条件的影响，这些条件的改变将影响酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度，从而影响酶的提取速度和提取效果。提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。
在蛋白质的盐析沉淀中，通常采用的中性盐以硫酸铵最为常用，这是由于它在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，
分离效果好，而且价廉易得，然而用它进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。
根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗虑、微滤、超滤、反渗透等四大类。
吸附层析的洗脱方法有溶剂洗脱法，置换洗脱法和前缘洗脱法等三种。溶剂洗脱法在洗脱出来的两个组分之间通常有一段“空白”，这是不含溶质组分的纯溶剂，故各组分能很好分离。
酶的分离纯化中，通常采用离子交换柱进行酶的连续离子交换，包括装柱、上柱、洗脱、收集和交换剂再生等步骤。
按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。在溶液pH值大于酶等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离。
层析聚焦的操作过程为：多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液选择-->形成pH梯度-->上柱聚焦-->洗脱-->再生。
凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为载体的电泳技术，它与别的电泳技术的主要区别在于同时具有电泳和分子筛的双重作用，有很高的分辨力，其载体主要有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。
超临界萃取是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
酶定向进化是一门迅速发展的新技术，具有适应面广、目的性强、效果显著等特点，其基本过程包括随机突变、构建突变基因文库、定向选择等步骤。
简述题：
1、简述优良的产酶微生物应具备的条件。
（1）发酵周期短，酶的产量高；
（2）产酶稳定性好；
（3）容易培养和管理；
（4）利于酶的分离纯化；
（5）安全可靠、无毒性等。
2、简述造成固定化酶活性损失的原因
3、简述酶反应器使用中应注意的问题
(1)保持酶反应器的操作稳定性
(2)防止酶的变性失活
(3)防止微生物的污染
4、原核生物蛋白质合成起始复合物由哪些成分组成?简述该复合物的形成过程。
5、简述发酵过程中对培养基pH值进行适当控制和调节的方法。
改变培养基的组分或其比例；
使用缓冲液来稳定pH值；
必要时通过添加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。
6、简述发酵过程中调节溶解氧的方法。
1)调节通气量：通气量是指单位时间内流经培养液的空气量（L/min）.也可以用培养液体积与每分钟通入的空气体积之比(VVM)表示。例如，1 M3 培养液，每分钟流经的空气量为0.5M3，即通气量为1：0.5；
2）提高氧的分压：可以增加氧的溶解度，从而提高溶氧速率。
3）调节气液接触时间：
气液两相的接触时间延长，可以使氧气有更多的时间溶解在培养基中，从而提高溶氧速率。
4）调节气液接触面积：
氧气溶解到培养液中是通过气液两相的界面进行的。
◇为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。
◇在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。
◇装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。
5）改变培养液的性质：培养液的性质对溶氧速率有明显影响，若培养液的黏度大，在气泡通过培养液时，尤其是在高速搅拌的条件下，会产生大量泡沫，影响氧的溶解。
◇可以通过改变培养液的组分或浓度等方法，有效地降低培养液的黏度；设置消泡装置或添加适当的消泡剂，可以减少或消除泡沫的影响，以提高溶氧速率。
7、简述固定化细胞发酵产酶特点。
①提高产酶率 细胞经过固定化后，在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，使生化反应加速，从而提高酶产率。如转基因大肠杆菌细胞生产β-酰胺酶，经过固定化后的细胞比没有选择压力时游离细胞的产酶率提高10-20倍。
②可反复使用或连续使用较长时间 固定化细胞固定在载体上，不容易脱落流失，故而可以进行半连续发酵，反复使用多次；也可以在高稀释率的条件下连续发酵很长时间 。如固定化细胞进行乙醇、乳酸等厌氧发酵，可以持续使用半年或更长时间。
③基因工程菌的治理稳定，不易丢失 由于有载体的保护作用，其质粒的结构稳定性和分裂稳定性都显著提高。
④发酵稳定性好 细胞固定化后，受到载体的保护作用，使细胞对温度、pH的适应范围变大；对蛋白酶和酶抑制剂等的耐受能力增强，故能够比较稳定地进行发酵生产。这一特点使固定化细胞发酵的操作控制变得相对容易，并有利于发酵生产的自动化。
⑤缩短发酵周期，提高设备利用率 固定化细胞经过预培养、生长好后，才转入发酵培养基进行发酵生产，很快可以发酵产酶，而且能够较长时间维持其产酶特性，因此可以缩短发酵周期，提高设备利用率；
⑥产品容易分离纯化 固定化细胞不溶于水，发酵完成后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含游离细胞很少，有利于产品的分离纯化，从而提高产品的纯度和质量。
⑦适用于胞外酶等胞外产物的生产 由于固定化细胞与载体结合在一起，所以固定化细胞一般只是用于胞外酶等胞外产物的生产。如果利用固定化细胞生产胞内产物，则将使胞内产物的分离纯化更为困难。
8、写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。（答案不一）
1）盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离
2）离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
3）过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程
9、简述三类离心机的特征及用途。
常速离心机（低速离心机）：最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在104g 以下。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，也能用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 104～105g 。主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。 为防止高速离心过程中温度升高造成酶的变性失活，一些高速离心机装设有冷冻装置，也就是所谓的高速冷冻离心机
超速离心机：最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105g甚至更高。主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化，样品纯度的检测，沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心机按照其用途可以分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种
10、、简述凝胶层析的基本原理和操作要点。
凝胶层析基本原理:小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。
凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。
装柱要注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹。注意不管使用与否，柱装好后，要有洗脱液浸过凝胶表面，防止空气混入影响分离效果。
上柱时，注意要在洗脱液的液面刚好与凝胶柱表面相平时加入欲分离的混合液，使组分能均匀进行凝胶柱。上柱的混合液体积通常为凝胶柱体积的10%，不能超过30%，混合液的黏度不能高。
洗脱时，洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时所用液体完全一致，否则会影响分离效果。洗脱液体积一般为凝胶柱体积的120%左右。
11、、简述作为萃取剂的超临界流体应具备的条件。
超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
指物体处于其临界温度和临界压力以上时的状态。这种流体兼有液体和气体的优点，密度大，粘稠度低，表面张力小，有极高的溶解能力，能深入到提取材料
的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而急剧增大。这些特性使得超临界流体成为一种好的萃取剂。而超临界流体萃取，就是利用超临界流体的这一强溶解能力特性，从动、植物中提取各种有效成份，再通过减压将其释放出来的过程。
12、简述定位突变技术进行酶分子修饰的主要过程。
* ①新的酶分子结构的设计：根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设计欲获得的新酶RNA的核苷酸排列次序或新酶蛋白的氨基酸排列顺序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。
* ②突变基因碱基序列的确定：对核酸类酶，根据欲获得的酶RNA的核苷酸顺序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基顺序，确定需要置换的碱基及其位置；对蛋白酶而言与核酶类似，根据氨基酸顺序和密码子，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，注意不同物种对同义密码子的使用差别，要充分考虑物种间的差异。
* ③突变基因的获得：普遍采用PCR技术获得基因。利用定位突变技术进行酶分子修饰，所需置换的碱基数目一般只有1-2个即能达到修饰目的。
* ④新酶的获得：突变基因进行体外重组，插入到合适的基因载体中，通过转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到合适的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达即可。
13、简述金属离子置换修饰的主要过程及其作用。
金属离子置换修饰（metal ion substitute modification）：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。
* 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。包括如下步骤：
A.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
B.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。酶此时处于无活性状态。
C.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。
* 通过金属离子置换修饰可以达到下列目的：
* (1)阐明金属离子对酶催化作用的影响。
* (2)提高酶活力：如将锌型蛋白酶的锌离子除去，加进钙离子，置换成钙型蛋白酶，其酶活力可提高20~30%。
* (3)增强酶的稳定性。
* (4)改变酶的动力学特性：如酰基
化氨基酸水解酶的活性中心含锌离子，用Co2+置换后，对N-氯-乙酰蛋氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。
14、简述酶分子修饰的概念及其意义。
* 通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。
* 通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。
* 20世纪80年代，酶分子修饰与基因工程技术结合，使酶分子的组成和结构发生改变，获得了具有新的特性和功能的酶，使酶分子修饰展现出广阔的应用前景。
15、简述固定化微生物细胞特点及其应用。
固定化微生物细胞的特点：
①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。
②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。
③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。
④固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。
⑤提高工程菌的质粒稳定性。
应用：（1）利用固定化微生物生产各种产物，酒、氨基酸、酶、抗生素等
（2）固定化微生物细胞制造微生物传感器，分为呼吸活性测定型和电极活性测定性两种
16、简述如何控制微生物发酵产酶的工艺条件
1）pH值的控制
改变培养基的组分或其比例；
使用缓冲液来稳定pH值；
必要时通过添加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。
2）温度的控制
温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。
3）溶解氧的控制
调节通气量
调节氧的分压
调节气液接触时间
调节气液接触面积
改变培养液的性质
17、简述凝胶电泳的分类及其原理
* 凝胶电泳(gel electrophoresis)或称胶体电泳是一大类技术，是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为载体的电泳技术。其与别的电泳技术的主要区别在于同时具有电泳和分子筛的双重作用，据用很高的分辨率。
* 按凝胶组成系统分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶电泳和SDS凝胶电泳。
* 连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH值和缓冲液。此法配制凝胶时较为简便，但分离效果差，适用于组分较少的样品分离。
* 浓度梯度凝胶电泳：采
用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减少的梯度凝胶进行电泳。梯度凝胶用梯度混和装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。
* 不连续凝胶电泳：采用2层或3层性质不同的凝胶（由上而下为样品胶、浓缩胶和分离胶）重叠起来使用，采用两种不同的pH值和缓冲液，使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。
* SDS凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定量的十二烷基硫酸钠即制成SDS凝胶。采用SDS凝胶进行电泳，广泛用于蛋白质相对分子质量的测定，误差不超过±10%。
18、酶在有机溶剂介质中与在水溶液中的催化特性有何改变？
?底物专一性
在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。
?对应体体选择性
酶的对映体选择性（enantioselectivity）又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。
酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。
酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。
?区域选择性
酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性, 即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。
④键选择性
酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。即在同一个底物分子中有2种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。
⑤热稳定性
许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。
⑥pH值特性
酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同。
19、举例说明酶非水相催化的应用.
手性药物拆分
手性高分子聚合物的制备
酚树脂的合成
导电有机聚合物的合成
发光有机聚合物的合成
食品添加剂的生产
生物柴油的生产
20、酶的固定化方法主要有哪些？作简单阐述。
答：制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价结合法和交联法等。①包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。常用的多孔载体有琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火胶棉等。操作简便，适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。②吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用
的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用，但酶与载体结合不太牢固易脱落。③共价结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。④交联法：利用双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。制备的固定化酶结合牢固，可长时使用，但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。