《分子生物学实验》
实验报告
实验名称：蛋白印迹技术
姓名：陈杰
学号：3140104666
序号：25
同组同学：唐陈曦
带教教师：刘伟俞萍
实验日期：2015年9月29日
目录
1.原理 (3)
1.1 Westen印迹技术 (3)
1.2 RT-PCR (5)
1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE） (6)
2.操作步骤 (6)
2.1 安装垂直板型电泳装置 (6)
2.2 凝胶的制备 (6)
2.3 转膜 (8)
2.4 封闭 (8)
2.5 一抗反应 (8)
2.6 洗涤 (9)
2.7 二抗反应 (9)
2.8 洗膜 (9)
2.9 检测 (9)
3.实验结果 (10)
3.1 照片记录 (10)
3.2 数据处理 (11)
4.讨论 (12)
1.原理
1.1 Westen印迹技术
蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术和Western印迹技术(Western blotting)，是鉴别蛋白质的分子杂交技术。Western blotting的原理是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变（转膜装置和预染的标准相对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-5～5-2-7）。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影，可以检测电泳分离的某种特定蛋白成分的存在和含量。该技术也广泛应用于检测某种蛋白的表达水平。
Western blotting实验过程主要有以下几个步骤：
1、SDS-PAGE分离待检测的蛋白质；
2、转膜：将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到膜上；
3、封闭：即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域；
4、抗体结合：即利用相应蛋白质的抗体（一抗）与待测蛋白质进行免疫结合，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应；
5、底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否和含量。Western blotting的转膜方式以电转移最为常用，固相载体主要有：硝酸纤维素薄膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ug／cm2，综合性能较好，以往使用的人较多；尼龙膜结合蛋白质的能力较强(480ug/cm2)，有很高的灵敏度，但结合背景较高；PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力（200ug/cm2），且能较牢固地结合蛋白质，该膜的机械性能和化学特性强，不易卷曲或撕裂，在90%甲醇的脱色条件下也不会影响膜的结构，结合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分析，具有较好的染色和检测的兼容性。
常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，辣根过氧化物酶最敏感的底物是3，3’-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸／氮蓝四唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物。这是利用二抗标记物进行的显色反应．是最早的Western blotting检测方法，现在主要用于免疫组化，在显微镜下观察。该方法的灵敏度相对较低，可以检测ng水平的目标蛋白。ECL化学发光检测试剂是基于Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂，它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反应，发出荧光，结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现，或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂，溶液B
主要成分为H2O2及特殊稳定剂。发光液A 和B 在HRP 的催化作用下Luminol 与H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在激发过程中不需要消耗HRP ，HRP 只是起催化作用，所以只要HRP 没有降解失活，是可以重复加发光液进行观察的。ECL 化学发光检测灵敏度高，可以检测pg 水平的目标蛋白。
Western blotting 示意图
1.2 RT-PCR
RT-PCR 是一种在转录水平上检测基因的方法。首先提取组织或细胞中的总RNA ，然后以RNA （主要是mRNA ）为模板，以与RNA 3‘端互补的引物或Oligo-dT 在逆转录酶的作用下进行逆转录，生成cDNA 的第一条链。然后以cDNA 3’端互补的引物以及与RNA 3‘端互补的引物组成引物对进行PCR 扩增，最后通过电泳来检测是否产生PCR 的扩增区带，判别目的基因是否表达。
为了避免由于RNA 的降解而导致阴性的实验结果，在进行RT-PCR 时要设立一个内参照（管家基因的表达），以避免出现假阴性结果。同时内参照可以对基因表达的变化起到半定量的作用。RT-PCR 技术灵敏性高，常用于检测细胞中是否表达了某种RNA ，是基因表达检测的方法之一。
抗原 一抗 生物素标记
的二抗 ECL 发光试剂
1.3 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2D-PAGE）
利用蛋白质的等电点和分子量的差异，通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质分离开。
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的双重优点。
第一向电泳是等电聚焦，在细管中进行，蛋白质根据其等电点不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行第二向电泳。在第二向电泳过程中，蛋白质依据其分子量大小进行分离。由于双向电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。
2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术，是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离。接着被转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离。用适当的染色技术显示被分离的蛋白。
2.操作步骤
2.1 安装垂直板型电泳装置
将玻璃板用蒸馏水洗净晾干。把玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2.2 凝胶的制备
1. 分离胶的制备：在一个干净的小烧杯中，按下表所列的试剂用量配置。根据室温来调节TEMED的加入量。
12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表
3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）1.25m L
10% SDS 0.1mL ddH2O 4.0mL
10% Ammonium persulfate 0.07m L
2% TEMED 0.6mL
将所配置的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用1000uL取液枪加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约1cm。沿玻璃片内壁加一层异丙醇（用于隔绝空气，使胶面平整）。凝胶配置过程要迅速，加速剂TEMED要在注胶前再加入，否则会提前凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。
2. 浓缩胶的制备：在另一干净的小烧杯中，按表配置浓缩胶，应根据室温来调节TEMED的加入量。混匀后用细长头的滴管或1000uL取液枪将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至加满，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30 min后凝胶聚合，再放置30min。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。
4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶配制用量表
L
3mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8（分离胶缓冲液）0.83m L
10% SDS 0.1mL ddH2O 3.0mL
10% Ammonium persulfate 0.05m L
2% TEMED 0.3mL
2.3 转膜
戴上手套，取下电泳好的凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，立即放在3张转膜缓冲液浸湿的Whatman 3MM滤纸上，将电泳完毕的凝胶放放在滤纸上面。盖上1张经甲醛激活的PVDF膜（用刀片切除多余的滤纸和滤膜，使其大小均与凝胶完全吻合）排除气泡后，盖上另3张同样处理的滤纸，排除气泡。按照顺序：负极3层滤纸-凝胶-膜-3层滤纸-正极。用塑料夹夹紧后放入转移电泳装置，将电泳槽搁置冰上。90V 电压1h。取下膜放入培养皿中加入立春红预染1min初步观察转膜结果．TBST淋洗保存。(转膜后的PVDF膜晾干后可在4℃冰箱中保存1周。）
2.4 封闭
电泳结束后取下PVDF膜，用TBST淋洗后加入封闭液，室温摇床轻摇1-3h，2.5 一抗反应
取出PVDF膜，用TBST淋洗，放入含1：10000稀释的一抗溶液中（用TBST稀释）室温至少1h或者4℃过夜。
2.6 洗涤
回收一抗放置4℃保存（必要时加入叠氮钠防霉）．用l×TBST漂洗PVDF膜3次，每次10min．
2.7 二抗反应
PVDF膜放入1：3000倍稀释的HRP标记的第二抗体溶液中（用TBST稀释），置温室摇床1h。
2.8 洗膜
1×TBST洗涤3次，每次10min．
2.9 检测
将PVDF膜上加ECL化学发光液（A、B准备0.5mL等量混合，可直接加在PVDF 膜上），反应5min后在化学发光检测仪上观察并记录实验结果。
3.实验结果3.1 照片记录
3.2数据处理
最后加ECL化学发光液（这一步是老师操作，为节约时间三组一起进行），其中第一组是我们组的可以观察到我们组（25号26号）的二号框中，左侧部分约为右侧部分粗细的1.5倍，与浓度比1.5：1相符合。
4.讨论
根据实验结果，可以看到一号框与二号框内总体结果较好，条带粗细的比例与加样浓度比例相符，其中三号框（别的组的条带）几乎没有条带，分析应该有这几种可能性：1、一抗和二抗失效；2、一抗与二抗不匹配；3、ECL液失效；4、抗体染色不充分；5、被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低；6、溶液中有二抗标记物的抑制剂；7、抗体活力降低；8、转膜时未充分接触。由于实验的材料三号框他们组和我们组所用材料是一样的，所以排除了可能性1、2、3，又由于在实验二（本次是实验三）中他们组没有出问题，所以排除了可能性5，则根据具体情况，我想可能性7和8的概率更大，应该是抗体拿出来之后离开冰浴时间太久。可以更换抗体重新再做一次，判断实验结果。或者直接不变条件重新操作，看是否是因为转膜的问题。
而四号框的情况，明显有气泡，另外就是条带特别粗，又连在了一起，我想可能是
加样量很多或者是发光液加的过多。可是试一试用PBST洗膜20min，期间换2次液。再看是否变正常一点。
而为了避免有气泡，玻璃板一定要洗干净，用酒精洗干净之后再用双蒸水冲，再晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。同时配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。特别是枪打到底的时候非常容易产生气泡。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。
还有一个可能制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在4℃存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。
虽然这次的条带相对不错，但是在日后做Western的时候，还是要特别注意以上几点易错的地方。
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
【实验目的】 了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系
统和125I标记系统。 【实验操作】 ⒈.蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。 分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。 ⒉.电转移 ⑴准备PVDF膜
蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；
万方数据
万方数据
万方数据
蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者：张燕婉， 叶珏， 时那， 孟宪敏， 王来元， ZHANG Yan-wan， YE Jue， SHI Na， MENG Xian-min， WANG Lai-yuan 作者单位：中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名： 实验技术与管理 英文刊名：EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年，卷(期)：2008,25(10) 被引用次数：21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式：张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)
Western blot实验报告 摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文 结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂（所有试剂均供两组用） 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml
蛋白印迹法（Western-blot） 一、基本原理 细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。 本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。 Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和?-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。
分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱. Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。 二、器材 电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml） 三、试剂配制： 1）、1.5M Tris—Hcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4℃保存。 2）、1.0M Tris—Hcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4℃保存。 3)、10％SDS：10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
免疫印迹 免疫印迹 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。 免疫印迹法的基本原理 将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。 免疫印迹法的基本步骤 免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。 免疫印迹法的优点 免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点： 1、湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作； 2 、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔； 3、免疫印迹分析只需少量试剂； 4、孵育、洗涤的时间明显减短； 5、可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定； 6、结果以图谱形式可长期保存； 7、免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。 免疫印迹 免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。而Western blot却没有这些缺点。因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
蛋白免疫印迹（western blot）实验 实验步骤： 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】 二、蛋白样品制备 1.单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷） （7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
蛋白质印迹（Western blot）实验方案 溶液和试剂 裂解缓冲液 这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液 150 mM NaCl 1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液） 150 mM NaCl 1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100 0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS（十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 Tris-HCl 缓冲液 20 mM Tris-HCl pH 7.5 蛋白酶抑制剂 电泳、转膜、封闭缓冲液 Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液 4% SDS 10% 2-巯基乙醇 20% 甘油 0.004% 溴酚蓝 0.125 M Tris-HCl 测定 pH 并调节至 pH 6.8。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 0.1% SDS 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 转膜缓冲液（湿转） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 20% 甲醇 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。 转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris 39 mM 甘氨酸 20% 甲醇 0.04% SDS 封闭缓冲液 5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白） 加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。 实验步骤 样品裂解 1. 制备细胞培养物裂解物 .将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。 .吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。 .用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。 .在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。 .在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。 .轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。 2. 制备组织裂解物 .用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。 .将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5 mg 的 组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆， 用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回 旋振荡器上）2 小时。 . 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。 样品制备 .取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 已有2975 次阅读2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴 蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 抽滤 抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。 点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。 另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。 当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面： 去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。 样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。 含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。 Western印迹 Western印迹含一系列步骤，包括： ?? 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。 ?? 将胶上的蛋白转移到膜上。 ?? 鉴定膜上特定蛋白。 下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。 用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物 印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。 二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。 分子量标准 在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。 聚丙烯酰胺浓度 凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤 一、组织的研磨 准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。 ②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织 呈干粉状。 ③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋， 于-80℃保存。 注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。 2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。 二、裂解提蛋白 准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1 若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂） 步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。 ②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃ 保存。 注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。 三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒） 准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床 步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA 工作液。 ④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。 ⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度 可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。 注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl] 3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。 4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。 四、SDS-PAGE蛋白质电泳 (一)、配胶 准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 ②首先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。 ③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。 ④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。 注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。 (3)电泳
i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。 两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。 ii.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。） （2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。） （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 （4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
蛋白印迹实验报告 篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法； 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。 实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位
素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。 试剂与器材 试剂 1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL； 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中； 3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL； 洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20； 5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。 6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,
用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。 7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。 器材 电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床 操作方法 〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。 2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。 4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤
实验三：免疫印迹 1 原理 免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。 2 试剂与仪器 2.1 试剂（所有试剂均供两组用） 2.1.1 转移缓冲液 Tris 3.025g 甘氨酸14.413g 甲醇20mL 加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL 2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明 一、试剂和溶液 转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色 二、实验步骤 1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟； 2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿， 半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟； 3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带； 4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗 涤3 次； 5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h； 6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说 明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜； 7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行 稀释）中，室温混摇2h； 9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min； 10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在
有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好； 11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝 光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干； 12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。