植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.doczj.com/doc/4c15402495.html,
收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004)
* 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n
.技术方法.
果实蛋白质组学研究的实验方法
王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1*
1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039
摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。
关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取
王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116.
果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理
对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研
究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗
氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian
et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非
生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质
组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要
的手段。
蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、
胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白
质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研
究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物
生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et
al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多
次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化
(Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织
中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量
相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、
多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
108植物学报 44(1) 2009
州市。果实采摘后直接运回实验室, 剔除伤果和病果,挑选出大小均一的果实, 用1%的次氯酸钠溶液消毒,清洗后晾干。
1.2蛋白质提取
以下所有步骤均在4°C条件下进行。
TCA法(TCA)参照Sarry等(2004)的方法并稍加改进。用取样器从10个果实中分别取4 g果肉, 用液氮在研钵中将其研磨成粉。然后加入4倍体积冰冷的10% TCA(含0.07% β-巯基乙醇), 匀浆液于－20°C下过夜培养, 纱布过滤。滤液以20 000×g离心30分钟, 收集沉淀。沉淀用冷丙酮冲洗3次, 并在4°C下干燥, 之后溶于裂解缓冲液中(表1), 保存于－80°C备用。
匀浆法(Homo)参照Chan等(2007)的方法。称取4 g果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。加入4 mL的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mmol
.L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol
.L-1 sucrose, 10 mmol.L-1 EGTA, 1 mmol. L-1 PMSF, 1 mmol
.L-1 DTT, 以及1% Triton X-100)继续研磨。匀浆液以20 000×g离心30分钟。将上清液转移到新的离心管中, 加入终浓度为10%的TCA溶液, 4°C下放置2小时。20 000×g离心40分钟, 收集沉淀。用冷丙酮冲洗3次, 4°C下干燥后溶于250 μL裂解缓冲液中(表1), 保存于－80°C备用。
酚提取法(Phe)根据Saravanan和Rose(2004)的方法并加以改进。称取4 g果肉, 用液氮在研钵中研磨成粉。然后加入4 mL的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mmol
.L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 1.05 mol.L-1 sucrose, 10 mmol
.L-1 EGTA, 1 mmol.L-1 PMSF, 1 mmol.L-1DTT 以及1% Triton X-100)继续研磨。匀浆液以20 000×g 离心30分钟。上清液中加入等体积的pH为7.8的Tris-饱和酚, 充分摇荡, 混匀, 10 000×g, 4°C下离心30分钟, 上层为酚相, 中间白色物质为杂质, 下层为水相。回收酚相, 加入5倍体积含0.1 mol
.L-1乙酸铵的预冷甲醇,充分混匀, －20°C下过夜培养, 沉淀蛋白。沉淀分别用预冷的含0.1 mol
.L-1乙酸铵的甲醇和丙酮冲洗2次, 4°C下干燥后溶于250 μL裂解缓冲液中(表1), －80°C 保存备用。
1.3蛋白质的溶解和上样
向蛋白干粉中加入225 μL裂解缓冲液1或2(表1), 振荡30分钟, 溶解后用超声波破碎仪处理。23 755×g离心30分钟, 取上清。采用Bradford(1976)的方法进行定量, 每个处理上样为600 μg蛋白。
1.4 双向电泳
载体两性电解质梯度双向电泳(CA-IEF): 第一向等电聚焦在长13 cm、直径3 cm的玻璃管中进行(Komatsu et al., 1999)。用Parafilm封口膜封好干净的玻璃管(Daiichi pure Chemicals, Tokyo, Japan)底部, 在13 cm 处做好标记, 垂直放置于置胶器上。用注射器吸取胶液(10% (v/v) NP-40, 30% (w/v) acrylamide, 9.5 mol
.L-1 urea, 10% ammonium persulfate, 1% (v/v) ampholine (pH 5－8), 1%(v/v) ampholine (pH 3.5－10)), 灌胶。待胶条聚合后, 除去Parafilm膜。然后加入600 μg蛋白样品, 并于其上覆盖30 μL的50%裂解缓冲液。最后加入上槽电极缓冲液(20 mmol
.L-1 NaOH)及下槽电极缓冲液(20 mmol
.L-1 H
3
PO4), 依照200 V ×30分钟, 400 V × 16小时, 800 V × 1小时的程序进行等电聚焦。聚焦完毕后, 从凝胶管中取出胶条, 放入平衡缓冲液I (62.5 mmol
.L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% (w/v) SDS, 10% (v/v)
表1裂解缓冲液的配方
Table 1 Lysis buff er rec ipes f or selected steps in 2D elec-tr ophores is
Recipes Chemicals Concentrations
1Ur ea8 mol
.L-1
NP-402% (v/v)
CA (pH 3.5－10)1% (v/v)
CA (pH 5－8)1% (v/v)
2-mer captoethanol5% (v/v)
P V P5% (w/v)
2Ur ea7 mol
.L-1
Thiour ea 2 mol
.L-1
CHA P S4% (w/v)
DTT1% (w/v)
CA (pH 3.5－10)1% (v/v)
CA (pH 5－8)1% (v/v)
NP-400.2% (v/v)
109王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
glycerol, 5% (v/v) 2-mercaptoethanol)中, 振荡平衡2次, 每次15分钟, 然后转移胶条至分离胶浓度为15%,浓缩胶浓度为5%的 SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。
固相pH梯度双向电泳(IPG-IEF): 等电聚焦用预制的13 cm固相(pH 4－7)梯度胶条(GE Healthcare)进行。分别取蛋白质样品600 μg及水化液(7m ol
.L-1 urea, 2 mol
.L-1 thiourea, 2% (w/v) CHAPS, 0.5% IPG buffer 4－7, 0.002% (w/v) bromophenol blue) 混合后过夜以水化上样, 上样总体积为250 μL。然后进行等电聚焦电泳,升压程序依次为500 V快速升压1小时, 1 000 V线性升压1 小时, 8 000 V线性升压2.3小时, 8 000 V快速升压2小时。等电聚焦结束后将第一向胶条分别置于含1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡液II (6 mol
.L-1 urea, 75 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.8, 29.3% (v/ v) glycerol, 2% (w/v) SDS, 0.002% (w/v) bromophe-nol blue)中各平衡20分钟, 然后再转移至分离胶浓度为15%, 浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。除特别注明外, 等电聚焦均使用1PG胶条。
1.5凝胶染色方法
本文所用的凝胶染色方法见表2, 包括: (1)考马斯亮蓝R-250(CBB R-250) (Shen et al., 2003); (2)胶体考马斯亮蓝染色(Blue silver)(Candiano et al., 2004); (3)银染(Silver staining)(Blum et al., 1987)。
1.6 图像采集及分析
凝胶脱色后立即用ImageScanner (GE Healthcare)扫描仪扫描。凝胶图像采用Im ag e Ma ste r 2D E li te software (GE Healthcare)软件进行分析。蛋白点的检定参数设置如下: saliency, 2.0; smooth, 5; minimum area, 50。
2结果与讨论
2.1匀浆法和酚抽提法与TCA法的比较
要获得高质量且重复性好的2D凝胶图像, 蛋白质的提取表2 双向电泳凝胶染色方法
Table 2 Gel staining protocols for fr uit 2D-P A GE Steps Concentr ation Time
CBB R-250
Fix 1 h
E thanol50% (v/v)
Ac etic ac id10% (v/v)
Stain> 2 h
CBB R-2500.1% (w/v)
E thanol24% (v/v)
Ac etic ac id8% (v/v)
Destain Until desired intensity
E thanol30% (v/v)
Ac etic ac id8% (v/v)
Blue s ilv er
Fix 1 h
E thanol50% (v/v)
Ac etic ac id10% (v/v)
Wash15 min, four times
Distilled w ater
Stain Ov ernight CBB G-2500.12% (w/v)
Ammonium10% (w/v)
sulfate
P hosphoric ac id10% (v/v)
Methanol20% (v/v)
Destain Until desired intensity Distilled w ater
Silver s taining
Fix 2 h
E thanol50% (v/v)
Ac etic ac id10% (v/v)
Rinse
E thanol30% (v/v)20 min, tw ice
Then deioniz ed20 min
H2O
Sensitiz ation 1 min
Sodium thiosulfate0.20% (w/v)
Rinse 2 min
Deioniz ed H2O20 s, thr ee times
Then deioniz ed H2O 1 min
Silv er30 min at 4°C
Silver nitrate0.20% (w/v)
(Chilled)
Formaldehy de0.02%
Rinse 2 min
Deioniz ed H2O20 s, thr ee times
Then deioniz ed H2O 1 min
Development Until desired intensity Sodium carbonate3% (w/v)
35% formaldehyde0.05% (v/v)
Rinse20 s
Deioniz ed H2O
Stop 5 min
Ac etic ac id5% (v/v)
110植物学报 44(1) 2009
至关重要。在蛋白质提取过程中,应尽量使细胞破碎,释放出蛋白质, 并尽可能多地使蛋白质溶解于裂解缓冲液中。提取过程中应尽量减少蛋白质的降解和丢失, 尤其是低丰度的蛋白质。对于蛋白质含量低、糖类和酚类干扰大且成分复杂的果实来说, 提取高质量的蛋白质尤为困难。本研究应用TCA法、匀浆法和酚抽提法提取果实蛋白质并进行2-DE, 获得的凝胶图谱显示, 匀浆法和酚抽提法均可以获得质量较高的双向电泳图谱(图1)。图像分析结果表明, 用匀浆法和酚抽提法提取的蛋白质图谱中的蛋白质点明显多于用TCA法获得的图谱(表3)。对于甜樱桃, 用酚抽提法提取蛋白质所获得的图谱质量好、背景干净且纵横纹较少(图1C), 而TCA法和匀浆法则效果较差(图1A, B; 表3)。对于桃、苹果和芒果, 利用匀浆法提取蛋白质均得到了质量较好的电泳图谱(图1E, H, J), 用酚抽提法提取桃的蛋白质也获得了较好的结果(图1F), 且匀浆法和酚抽提法得到的蛋白质的点数也基本一致(表3)。因此对于桃来说, 这2种提取蛋白质的方法差异不显著, 都能得到较为满意的结果。而采用TC A法得到的图谱则质量不高(图1D,G, I)。用TCA
法提取果实蛋白质得到的电泳图谱中蛋白
图1不同果实材料分别采用
TCA法、匀浆法和酚抽提法提
取蛋白质后获得的双向电泳图谱
(第一向等电聚焦采用CA-IE F)
(A)－(C)甜樱桃; (D)－(F)桃;
(G), (H)苹果; (I), (J)芒果
Figur e 1 Typical examples
of 2-DE patter n of f ruits using
TCA, Homo, and Phe pr otein
extraction protocols described
in the paper
(A)－(C)Pr unus avivum; (D)－
(F)Prunus pers i ca; (G), (H)
Mal us do mes ti c a; (I),(J)
Mangi fer a i ndi ca
111王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法
质点数较少, 在甜樱桃上表现得尤为突出(表3)。
此外, 我们对Phe法的提取缓冲液配方进行了改进,增加了缓冲液中蔗糖的浓度, 由原先的250 mmol
.L-1变为 1.05 mol
.L-1。改进后的配方使得酚相由原先在下层变为上层,因而回收酚相更加简便。
除了考虑增加蛋白质的溶解度之外, 排除组织中其它干扰蛋白质溶解的物质, 尤其是核酸的影响也至关重要。在水果样品中,糖类、酚类、单宁及其它物质的影响也相当明显。在蛋白质变性之前可利用超声破碎和核酸内切酶去除核酸等干扰物质。此外, 添加一些蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解, 保持蛋白质的完整性。
2.2固相pH梯度的应用提高双向电泳图谱质量无论是应用IPG胶条还是CA胶条进行等电聚焦都需要溶解较好的蛋白质(Garfin, 2000)。本研究将酚抽提法提取的蛋白质分别用CA-IEF和IPG-IEF进行等电聚焦,结果表明, CA-IEF等电聚焦得到的图谱有一些横纹和纵纹(图2A, C, E)。而IPG-IEF等电聚焦获得的图谱则蛋白质点多(表3)、聚焦充分且蛋白分离效果好(图2)。甜樱桃、桃和冬枣果实蛋白质样品应用IPG-IEF获得的图谱质量都很好。
对于蛋白质组学研究来说, 将复杂的蛋白质样品进行高质量的分离是先决条件, 同时也是科研人员面临的一个挑战(G?rg et al., 2004); 稳定的、线性的且重复性好的pH梯度同样至关重要。载体两性电解质梯度双向电泳技术(CA-IEF)是分离蛋白质的一种有效方法。但两性电解质在电泳过程中由于凝胶pH梯度在电场作用下随时间的延长而改变,会使p H梯度向阴极漂移(G?rg et al., 2004)。另外, CA-IEF由自己制作灌注,重复性较差。IPG胶条则是在凝胶灌制时, 将酸性和碱性的缓冲基团按梯度共价结合进入聚丙烯酰胺凝胶, 形成固相pH梯度(Righetti, 1983)。IPG-IEF相对CA-IEF 方法具有重复性好、操作简便且稳定的特点, 可以更好地分离酸性端或碱性端的蛋白质。对于这2种方法, 也有不同的评价观点, Klose(1999)和Lopez(1999)则认为CA-IEF有很多优点。本研究结果显示, CA-IEF和IPG-IEF 2种等电聚焦方法均获得了较好的图谱, 并且分离的蛋白质点均在500个以上(表3)。
2.3裂解缓冲液2提高蛋白质的溶解性
为了获得质量较高的2DE图谱, 蛋白质样品必须进行变性、解聚和增溶等处理, 破坏分子间的相互作用, 使蛋白质复合物解聚、变性为单体形式(Molloy, 2000)。一般情况下, 溶解缓冲液包含离液剂(如硫脲和尿素)、非离子去污剂或兼性离子去污剂(如Tr i t o n X-100或C H A P S)、还原剂、两性电解质以及蛋白酶抑制剂(G?rg et al., 2004)。在本研究中我们发现用裂解缓冲液2溶解蛋白质可以获得较高质量的双向电泳图谱(图3B, D)。而用裂解缓冲液1溶解樱桃和桃果实蛋白质样品, 得到的凝胶图谱蛋白点则很少(图3A, C)。
为了提高2DE中蛋白质的分离效果, 一些新的试剂被应用到2-DE中(Molloy, 2000)。Sulfobetaines可促进蛋白质溶解, 其效果优于NP-40和Tr it on X-100 (Mo l lo y,2000;Sa nt o ni et al., 2000)。TB P (tributylphosphine) 可以作为DTT的替代试剂, 而TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine)也可应用于DIGE的标记中(Herbert et al., 1998)。
表3采用不同蛋白质提取方法提取的蛋白质在2DE凝胶图谱上的统计分析
Table 3 Numbers of f ruit samples protein spot using 3 protein extr action protocols (TCA, Homo, and P he methods as described in the paper)
Fruit CA-IEF a IPG-IEF a
TCA b Homo b P he b P he b
Pr unus avivum279443591617
Pr unus persi ca499685692682 Malus domesti ca586720ND c ND c Mangi fer a i ndi ca447546ND c ND c
Zi ziphus j ujuba ND c ND c582655
CA-IEF a表示等电聚焦在毛细玻璃管中进行, IP G-IEF a表示等电聚焦采用IP G胶条(pH 4－7)。TCA b、Homo b和Phe b表示蛋白质的提取方法。ND c: 没有检测
CA-IE F a w as c arr ied out w ith glas s c apillar y tube gel and IPG-IE F a w as run w ith 13 cm IPG s trips (pH 4－7) as des cr ibed in the paper. TCA b, Homo b, and P he b w ere pr otein ex traction pr otocols desc ribed in the paper. ND c: Not deter mined
112植物学报 44(1) 2009
图 2 甜樱桃、
桃和冬枣果实材
料采用不同的等
电聚焦(CA-IEF 和
IP G-IE F)系统获得
的双向电泳图谱
(果实蛋白质提取
方法采用酚提取
法, 凝胶染色应用
的是CBB R-250
染色法。)
(A), (B) 甜樱桃;
(C), (D) 桃; (E ),
(F) 冬枣
Figur e 2 Tw o-
DE patter ns of
f ruits us in
g CA -
IEF and IPG-IEF
f or the f ir s t di-
mens ion (Pr ot-
eins w er e ex -
tr acted f rom frui-
ts by P he pr oto-
c ol des cr ibe
d in
the paper. The
gels w ere stain-
ed w ith CBB R-
250.)
(A), (B) Pr unus
avivum ; (C), (D)
Pr unus per si ca ;
(E), (F) Zi ziphus
jujuba
2.4 染色方法比较
目前, 双向电泳的染色方法较多, 分辨率也不同。考马
斯亮蓝R-250染色法最为普遍, 也最简单。Meyer 和
Lamberts(1965)首次采用了这种方法, 检测灵敏度为
10－100 ng 。银染技术也是一种很常用的染色技术, 它
的检测灵敏度比考马斯亮蓝高100倍(Switzer et al.,
1979; Rabilloud et al., 1990), 但是与质谱的兼容性较
低。胶体考马斯亮蓝染色法最早由Neuhoff 等(1988)报
道。后来, Candiano 等(2004)报道了改进的胶体考染
法, 其优点是背景低, 灵敏度高, 可达1 ng 左右。
在本实验中(图4C), 银染法效果最好, 得到的蛋白点清晰且与背景的反差大, 容易识别。这一点与Rabi ll-oud 等(1990)、Switzer 等(1979)和Shevchenko 等(1996a)的研究结果相一致。 而其它两种染色方法差别不大(图4A, B)。对于染色方法的选择, 需要考虑的因素主要包括: 较高的灵敏度(即较低的检测极限), 较高的线性动态范围(定量精确), 重复性好, 高的质谱兼容性(G ?rg et al., 2004)。由于不同的染色方法中染料所结合的蛋白质不同, 因此没有一种染色方法可以适合所有的蛋白质染色。考虑到后续的蛋白质质谱鉴定, C BB 染色是较为合适的染色方法。但也有报道称银染可以与质谱鉴定兼容, 质谱结果理想(Shevchenko et al.,
113
王清等: 果实蛋白质组学研究的实验方法1996b; Rabilloud et al., 1998)。
3 结论
以上实验结果表明, 采用匀浆法和酚抽提法提取蛋白质
并用改进的裂解缓冲液2进行溶解, 能够成功地分离甜
樱桃、桃、苹果、芒果和冬枣果实的蛋白质。匀浆
法和酚抽提法提取蛋白质得到的图谱质量差异不显著。
固相pH 梯度双向电泳(IPG-IEF)与载体两性电解质梯度
图 3 桃和甜樱桃果实蛋
白质分别采用不同的裂解
缓冲液溶解蛋白质获得的
双向电泳图谱(第一向等电
聚焦采用CA-IEF, 凝胶染
色采用的是CBB R-250染
色法。)
(A), (B) 桃; (C), (D) 甜樱
桃
Figur e 3 Ty pic al ex -
amples of 2-DE of Prunus
per s i ca and P. avi vum
fruit s amples us ing diff er-
ent ly sis buf f er r ecipes
de s c r ibe d in Ta ble 1
(Tw o-DE pat ter ns of
fruits used CA-IE F for the
firs t dimension. The gels
w er e stained w ith CBB R-
250.)
(A), (B) Pr unus pers ic a ;
(C), (D) Pr unus avivum
图 4 采用不同染色方法显色后的双向电泳图谱(第一向等电聚
焦采用CA -IEF)
(A) 考马斯亮蓝R-250(CBB R-250); (B) 胶体考马斯亮蓝染色; (C)
银染
Figur e 4 Typical examples of 2-DE of Pr unus pers ic a fr uit
samples us ing dif ferent staining pr otoc ols des cribed in Table 2
(Tw o-DE patterns of f ruits used CA-IE F for the fir st dimension)
(A) CBB R-250 s taining protoc ol; (B) Blue s ilver staining
pr otocol; (C) Silv er staining protoc
ol
→
114植物学报 44(1) 2009
双向电泳技术(CA-IEF)相比可以得到更好的结果, 其拖尾少, 横纹纵纹也较少。本实验中的3种染色方法都适合果实蛋白质的染色。将上述方法综合在一起就形成了一整套适用于多种果实的蛋白质组学研究方法。本实验探索的方法对其它含有较多杂质的植物材料的蛋白质组学研究也有一定的参考价值。
致谢感谢中国科学院植物研究所沈世华研究员在蛋白质组学实验方法上给予的建议。
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116植物学报 44(1) 2009
Comparison of 2-DE Techniques for Improved Proteomic
Analysis of Fruit Tissues
Qing Wang 1, 2, Zhulong Chan1, Guozheng Qin1, Shiping Tian1*
1Ke y L abo rato ry of Pho tosynth esi s a nd Enviro nm en tal Mo lecula r Ph ysi olo gy, In stit ute of Bo tan y, Chin ese Acade m y of S cie nce s, Be iji ng 100093, Chi na;2Gradu ate Sch ool of Chi nese A cad em y of Sci ences, Bei jin g 100039, Chi na
Abstr act Fruit tiss ues are considered recalcitr ant plant tiss ue for proteomic analysis. In this study, several 2-D electr ophores is (2-DE) protoc ols w ere ev aluated to establis h a ref erence map for the fruit proteome. Three protein ex trac tion pr ocedures for 2-DE and differ ent elec trophoresis systems of isoelectr ic f ocus ing (IE F), as w ell as staining protocols, w ere c ompared w ith sev eral fruit pr otein s amples. We achieved satis factory 2-DE patterns w ith w ell-r esolved polypeptide s pots throughout the gel by homogeniz a-
.L－1 urea, 2 mol.L－1 thiourea, tion (Homo) and phenol (P he) protein extrac tion protocols in c ombination w ith a lysis buff er of 7 mol
4% (v/v) CHA P S, 1% (w/v) DTT, 0.2% (v/v) Nonidet P40, and 2% (v/v) c arr ier ampholytes. A s w ell, immobilized pH gradient (IP G)-IEF produced high-quality 2-DE gels that w ere free of smear ing and s treaking, and all s taining protocols w ere suitable for pr otein vis ualization. Thes e results suggest that the Homo and Phe protocols are highly effec tive w ith fr uit tissues and that the combination IP G-IE F provides satisf ac tory 2-DE-based pr oteomic analys is of fr uit tiss ues, w hich is very useful for deep inv es tigation of biochemical changes in harv ested fruit by a proteomic appr oac h.
Ke y w ords f ruit, g el sta inin g, iso ele ctri c f ocu sin g, l ysi s b uff er, pro tei n e xtra cti on
Wa ng Q, Chan ZL, Q in GZ, Tia n S P (2009). Co mpariso n o f 2-DE tech niq ues for im proved pro teom ic ana lysi s o f fruit ti ssue s. Chin Bull Bo t44, 107?116.
* Author for c orr espondenc e. E-mail: tsp@ibc https://www.doczj.com/doc/4c15402495.html,
(责任编辑: 孙冬花)
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
生理学教学方法的应用体会 1讲授法 讲授法是通过语言向学生系统地传授知识的方法，是课堂教学最常用的方法之一，其优点是能在有限的教学时间内系统地传授知识，把教师本人的学习心得和治学经验传授给学生，并能在教学内容上抓住要领，突出重点，使讲课内容少而精，做到深入浅出、系统连贯、层次分明、条理清楚。在相同的时间内，学生从教师讲授中获得的信息量远远大于自己看书获得的信息量。教科书中“绪论”及“细胞的基本功能”章节可以说是生理学课程的总论部分，许多内容贯穿全书，是生理学课程讲述最基础的部分，因其内容枯燥，名词概念繁多，再加上学生初次接触生理学，需要教师精心讲授，学生才能理解接受。如靠学生自学，不但会影响教学进度，还会影响学生对最基本概念的理解和把握，因此宜以“讲授法”为主，同时辅以其它方法。 正确运用讲授法，要求教师必须认真组织教学，使教学环节紧密相连，同时要保证内容的科学性、正确性。首先教师要深刻理解教学大纲的精神，认真钻研教材，然后对教材内容进行“剖析”，明确哪些是重点，哪些是难点，哪些地方可以设疑，哪些内容枯燥乏味，在此基础上对教学内容进行独特的自我设计，使教学内容从平面转向立体，重点突出，难点易解。在讲授过程中，必须与板书、教具紧密结合，使讲授内容清晰、系统、形象、生动。尤其是多媒体课件的涌现，使教学中用语言难以描述清楚的生理过程通过课件而形象、生动、具体地呈
现在学生面前，加深学生对这些知识点的理解。 2启发式、问题式教学法生理学的内容是经过实验验证和在此基础上形成的理论组成的，根据生理学的特点，采用启发式、问题式教学方法可取得事半功倍的效果。在这一教学过程中，要求教师潜心钻研教材，在把握学生知识水平和对知识的理解能力的基础上，对本堂课要提出哪些问题，如何和何时提出问题进行精心设计。例如，讲述脊髓对躯体运动调节时，可以设问，脊髓正常情况下总是与更高位中枢保持联系，如何才能了解其单独作用能对躯体运动功能做出何种调节？脊休克产生的原因有创伤和失去高位中枢的调节作用，如何验证其产生的原因？脊休克后，部分反射还能恢复，说明了什么问题？这样既调动了学生学习的积极性，又启发了实验设计的思路。又如讲授完骨骼肌的结构、肌丝的滑行学说、兴奋- 收缩耦联及神经- 肌肉接头后，可以布置这样的问题：坐骨神经兴奋后，如何引起腓肠肌收缩？甚至可以在讲述完神经系统之后，提出人是如何将收缩某一部位肌肉这一意识转化为肌肉收缩这一过程的？总之，在生理教学中灵活运用启发式教学方法，对于提高生理教学质量具有不可忽视的积极作用。 3对比和总结 对同一章节的并列内容采用对比的方式讲授，比单独分别讲 授效果好。如：动作电位与局部电位的讲解，可以把两者不同的特性进行对比；心肌细胞生物电的讲解，把窦房结、P 细胞、浦肯野细胞和心室肌细胞的动作电位波形画在黑板上，学生很快就能区分哪是自律细胞，哪是工作细胞，哪是快反应细胞，哪是慢反应细胞。每一章的内容讲完后，可进行概括性的总结，使学生对所学内容有一个总的轮廓，形成一个整体概念。在总结中要重视图表、表格的作用，图表和表格能使人一目了然，把知识系统化、条理化，加强知识间纵横联系。分类比较
植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.doczj.com/doc/4c15402495.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨
生理学教学方法的探讨与研究 生理学是医学科学的一门关于人体正常机能的学科，实验性较强，内容抽象、较难理解，记得慢、忘得快，与医学其它各学科联系密切。作为一名医学生，扎实掌握生理学知识并能灵活应用于临床实践是必需的。经过十余年的探索与研究，笔者积累了一些经验，在教学实践中不断地验证并提高，取得良好的效果，受到学生的欢迎。 1、抽象的问题具体化、形象化，庞杂的问题系统化 要想解决这一问题，教师必须备课充分。例如：“细胞的生物电”现象一章，有一个概念——阈电位：当细胞受到刺激，使细胞膜去极化达到阈电位，就引发钠离子快速大量内流，从而爆发动作电位。笔者把阈电位比喻象扣动扳机，这样讲解，学生容易领会、记忆深刻，课堂反馈的效果良好。 2、充分应用教学手段，多方位、多角度拓宽学生接受知识的渠道 生理学知识来源于科学实践，在教学中应紧抓住实践这一环节，多角度开展生理学实验来加深对知识的理解。首先，在课堂上传授理论知识的同时，笔者善于应用示意图、模拟图展示讲解各种生理现象，使学生加深对课堂知识的领会；再者，通过电视教学片观察各种生理现象的发生、发展过程，使学生加深对课堂知识的领会；第三，通过学生亲自动手操作相关的生理学实验，更直观地观察生理学现象，加深对理论的理解。通过这样“耳闻”、“亲自操作”、“目视”等多方位验证理论，达到了掌握相关知识的目的，既便于记忆，又便于运用，同时对培养学生的求知欲、操作技能的提高都大有益处。 3、驾驭课堂，开展课堂讨论 重视学生课堂讲座是有多方面益处的，无论是理论课，还是实践课，针对知识点进行的讨论，既能反映出学生对知识的理解程度，又能找出漏洞和不足，从而使教师在对知识的传授中更有重点、把握程度更为准确，亦相应地提高了教学水平。另外，问题点的提出能使学生产生兴趣，具有启发性，促使学生进行积极的思考，在讨论的过程中加深对理论知识的理解，达到举一反三的效果，既锻炼了学生的思维，又增强了解决实际问题的能力。 以上是笔者在教学过程中积累的一点经验。积极探索适合现今学生实际水平和能力的教学方法，是每个有责任感的教师孜孜探求的问题。通过多年的探索与实践，运用这些方法增强了学生的信心，激发了学习的兴趣，培养了实践操作技能，拓宽了学生的思维，为掌握生理学知识和医学其他各学科知识打下坚实牢固的基础，从而达到了提高教学质量、培养学生素质的目的。
蛋白质组学研究的完整解决方案 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白质，这大概需要10年时间进行识别。 为了加快蛋白质组学研究进程，以专业生产蛋白质组学研究设备而著称的美国Genomic Solution Inc.公司开发了完整的蛋白质组学解决方案，由一系列机械手臂与软件，并结合了二维电泳实验设备与质谱仪，可以进行高效、自动化且具重复性的试验分析。在Genomic solution值得信赖的技术平台上，你的研究工作将更富成效，重复性更好。在这一整套Investigator平台上，各仪器之间配合无隙，由于它的整合性及标准性，使得研究进程大大加快，原来需要9—12个月才能获得数据结果发表的时间减少到9—12周。这套完整的系统具备蛋白质组研究所需的众多功能：2-D电泳、图像获取、2-D胶分析、蛋白样品切割、蛋白消化、MALDI样品准备、消化及点样、数据分析整合，再加上制备好的胶、试剂及附件，使研究工作可以立即展开。此套设备为进行蛋白质组学研究的利器,大大加速了蛋白质分离和鉴定的速度。该系统主要由以下几部分组成： 一、2-D电泳系统（Investigator? 2-D Electophoresis System） 该系统主要进行2D PAGE第一向等电聚焦凝胶电泳和第二向SDS-PAGE电泳，设备包括2-D电泳系统所需的各种设备，如pHaser?（IPG胶条电泳）、管状制胶设备、二维电泳装置、电源设备、半导体冷却器及各种相关的蛋白纯化试剂盒。 产品特征： * 提供2D PAGE电泳所需的各种设备，使电泳更加简便，大大节约研究时间 * 高分辨率：有效的第一向等电聚焦凝胶电泳和23cm X 23cm第二向SDS-PAGE大面积板胶提供清晰的电泳图像，有效提高单体、磷酸化和糖基化蛋白的分离 * 大容量：可同时容纳15块1mm一维管状胶，或8块2-3mm管状胶；10块IPG胶条和10块二维电泳板胶 * 灵活性：该系统用于管状胶、IPG 胶条、预制胶、自制胶和SDS PAGE胶使用 * 恒温：高效的半导体制冷装置保证电泳体系温度恒定，温度变化< 0.5℃ * 专门为高分辨率2D PAGE而设计的电源系统 * 提供超纯的相关化学试剂和药品
高师院校生理学教学方法初探 3肖玲远 (毕节学院生物系,贵州毕节 551700)摘 要:按照素质教育的要求,针对生理学教学的特点和高师院校学生具体情况,对生理学教学改革的措施和方法进行了初步探讨。 关键词:高师院校;素质教育;生理学;教学方法 中图分类号:Q4-42 文献标识码:B 文章编号:1005-6769(2005)03-0084-02 The Ele m en t ary D iscuss About Physi ology Teach i n g M ethod of Teacher ’s College Xiao L ing -yuan (Depart m ent of B i ol ogy,B ijie Teachers College,B ijie 551700,China ) Abstract:The paper according t o de mand of quality educati on,characteristic of physi ol ogy teaching and student ’s trait of teacher ’s college,discusses the measure and method about physi ol ogy teaching ref or mati on . Key words:teacher ’s college;quality educati on;physi ol ogy;teaching method 生理学是综合性大学、师范院校生物专业及医学各专业的一门理论及实验性很强的基础、重点的主干课程之一,伴随知识剧增及课堂授课课时减少的矛盾的出现,生理教学中如何将素质教育贯穿于教学活动中始终是摆在每个教师面前的必须解决的问题。 1 高师院校生理学教学的特点和要求 1.1素质教育观下的生理学教学特点和要求 生理学是研究生命现象特别是从机能整合角度来探讨生命活动规律及调节的基础理论学科,其知识是生命科学领域高素质人才必备的基本理论,而生理学与其他学科相比,理论性强,内容比较抽象,概念较多,再加上其具有的基础性、发展性及较强的实践性,这就为当今素质教育观下的生理学教学提出了极大的艰巨性与挑战性。传授知识主要是总结过去,而传授知识的方法才真正是为了未来。素质教育注重培养学生的态度、能力,其核心是培养学生的创新精神和创造能力,最终目的是使学生得到全面发展。近几年入学的大学生,自理及独立能力普遍较差,学习上大多缺乏积极主动性,动手及实际操作能力更弱。为此,必须改变传统的教学方法,根据每个学生具体情况(影响学生学习的智力与非智力因素、学习能力、创新及创造能力),制定出一套完整有效切实可行的教学方法。 1.2高师学生学习生理学的特点和要求 高等师范院校的培养目标是为中学培养合格的中学教师。与医学院校不同,师范院校学生在生理学的学习中不仅要了解人体及动物基本生理机能、机制等基础理论,还应学会将来如何指导学生学习生理学的相关知识。根据这一明确目标,生理学教师在教学实施过程中,在以不同方式方法加强和提高自身素质能力的同时,要结合本专业课的特征及所具有的现实条件,有针对性地组织、安排教学,有意识的 ? 48? 黔南民族师范学院学报2005年第3期 3收稿日期:2005-01-20 作者简介:肖玲远(1964-),女,贵州毕节人,毕节学院生物系讲师,研究方向:生理学教学。
进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206) 摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新 男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。 3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.doczj.com/doc/4c15402495.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受
教案
讲稿 第一章绪论 课堂导入：大家好，今天我们开始学习一门新的课程：生理学。当我们接触一个新事物，首当其冲要明白3个W，what，why, how ,这3个W就是我们今天的主题。 第一节生理学的任务和研究方法 1、what，什么是生理学，他是干什么的？ 引入概念生理学（physiology）——研究生物体正常功能活动规律的科学，重点是正常功能，根据研究对象不同可分为细菌生理学、植物生理学、动物生理学和人体生理学。 我们要学习的人体生理学，又称医学生理学，通常简称为生理学，是研究正常人体功能活动规律的科学。具体的说，它研究我们的新陈代谢、生长发育、神经活动、躯体活动、腺体分泌、血液循环、呼吸和消化等功能活动，研究它们是怎样发生发展，需要什么条件，相互间有无影响，与内外环境变化的关系等等。 2. why 我们总是对这个世界充满好奇，而自我是世界中无可替代的唯一，我们对自己的好奇心也往往更明显，为何危急时能爆发惊人潜力，为何心跳过快反而危险，，为何呼气比吸气更轻松，为何寒战过后会更温暖？这些都是生理学的内容。 从职业的角度看，一种药物如何起效，为何出现副作用，疾病是如何发生发展，都需要足够的生理学知识，所以在生理学成为了重要的医学基础课，他是我们认识和干预纠正疾病异常的定心丸。 3. how 生理学研究方法 生理学是一门实验性科学，实验是它的重要基础，生理学的学习研究的最基本过程是：实验－推理判断－再实验－验证修正推理判断－再实验－再验证修正，这是一个长期反复循环的严谨的过程。由于实验的损伤性及伦理等原因，目前，大多数生理实验是以动物为对象。为什么能用动物做实验来研究人体的功能活动呢？我们都知道，根据进化论的观点，人类和生物界其他动物具有同源性，在结构和功能上具有相似之处，这就为我们提供了这种可能性，而且，动物实验还有些特别的优势。举例：枪乌贼的巨大神经纤维（其直径最大可达1毫米左右，人的各种神经纤维直径为1—20微米，长度人几分之一毫米到1米左右，比如已知人体最粗的神经是坐骨神经，它的直径可以达到1厘米，但是坐骨神经是神经纤维束，内含大概20W根神经纤维，可想而知每根纤维的直径有多微小。），猫的防御反射，等等等等。当然，凡事都有利有弊。首先，动物和人类只是相似，所以并不能将动物实验的结果简单直接对应到人体，尤其人类的情感情绪思考等高级意识活动基本无法以动物实验来进行研究。其次，一些人对动物实验的滥用，既丧失了对生命的关爱和基本的尊重。随着无损伤检测技术的不断发展，越来越多的实验直接以人体作为研究对象。 生理学研究包括三个层面。 * 第一.细胞、分子水平研究细胞生命现象的基本物理化学过程，如研究神经细胞的动作电位及其产生的离子机制。 * 第二器官、系统水平研究各器官及系统的功能，如研究心脏的泵血功能、呼吸节律的形成机制。 * 第三整体水平研究器官系统之间的功能联系以及机体与环境之间的相互关系, 如研究环境温度对人体的影响，应激状态下人体功能的改变。。。。
运用多种教学方法，提高学生学习生理学兴趣 生理学是一门重要的医学基础学科，教学过程中运用多种教学方法，提高学生学习生理学兴趣，调动学生学习的主动性和探究欲。 标签：生理学；教学方法；学习兴趣 生理学是研究机体功能活动及其活动规律的科学。它是一门十分重要的医学基础课程，在整个医学课程中起到了承上启下的作用，它以人体解剖学和组织胚胎学为基础，并为后续课程如病理学、药理学和临床课程等奠定基础。对于初学者来说，生理学的理论性较强，内容抽象，枯燥无味致使其产生抵触心理。兴趣是最好的教师。因此在生理学的教学过程中，如何提高学习兴趣成为广大师生共同努力的目标。 对于教师来说，在授课过程中要善于运用多种教学方法，提高学生对生理学的学习兴趣，使学生掌握生理学的基本知识、基本理论和基本技能，能理解正常人体的功能活动规律。教学方法如下 1 医学史 在整个医学课程中，学生潜意识认为生理学是一门很难的学习课程，引起学生的学习兴趣和激发学生的学习动机就起到了至关重要的作用[1]。这样可以减少生理学的神秘感。在后续的教学过程中，激发学习动机，同时凝结科学家智慧的结晶无形中对于学生探索及创新能力的培养也具有极其重要的作用。 2 动画演示教学 传统的生理学教学以讲授法为主，学生对深奥的理论感到难以想像、枯燥难懂。生理学是一门功能学科，讲述的是一个动态过程，大部分内容比较抽象，因此对于抽象的内容采用动画演示教学，通过此法的运用使抽象的内容变得具体、直观和清晰，有助于学生对知识的理解并激发学生的学习兴趣。采用动画演示法是我们生理学经常采用的教学方法，它不仅可以缓解学生的听课疲劳，活跃课堂气氛，更重要的是使静态知识变为动态的过程、抽象概念更加直观、复杂问题变得容易理解、枯燥的理论变的有趣，从而提高学生的学习兴趣和主动性，提高教学效果。 3 联系式教学 在整个医学课程的学习中，生理学是一门基础必修课程，为后续课程奠定基础。因此在整个生理学教学过程中要联系临床案例和生活，使学生充分认识到生理学和临床课程、生活息息相关、密不可分。通过临床典型病例的穿插，突出生理学的临床实用性，加深学生对理论知识的理解[2]，使课堂更加具有趣味性和生动性。理论知识与临床实践结合让学生充分意识到只有掌握正常人体功能的基
中职生理学教学方法的探索 摘要】在医学专业中，生理学是一门重要的医学基础课程，是学生学习其他专 业课的启蒙课程，然而其教材内容理论性较强，内容抽象，难以理解和记忆，因此，做好生理学教学显得尤为重要。本文针对中职院校学生的特点，就提高并恰 当应用生理学的教学方法进行了探索，以期激发学生的学习兴趣，提高学生理解 思维能力，实现运用生理学知识有效解决实际问题，为以后的学习、工作打下坚 实的基础。 【关键词】生理学；教学方法；探索；提高 中图分类号：G623.5 文献标识码：A 文章编号：ISSN1672-2051 （2019）08-096-02 在医学专业的课程学习中，生理学是一门重要的医学基础课程，它是研究正常人体生命 活动及其规律的科学，是学习其他专业课程的启蒙，也是连接基础医学和临床医学的纽带。 虽然生理学教材对人体各部分机体功能进行了详尽清晰的阐述，然而，教材的内容繁杂，理 论性较强，内容抽象，因此，教师要改进教学方法，激发学生的学习兴趣，培养学生学习积 极性，提高学生理解思维能力，真正实现运用生理学知识解决学习、工作中的实际问题。中 职生理学教学面向中职学生，教学层次相对较低，笔者结合多年的生理学教学实践经验，探 索了一些有益教学的方法，提出几点对生理学教学方法的思考，以期对教师和学生有所帮助。 1、经典讲授，抓住教学重点 生理学这门课程是医学专业最重要的基础课程之一，它是研究机体正常生命活动规律的 科学，它的内容包括基本理论、基础知识、基本技能等。经典讲授是课堂教学最常用的方法 之一，它是在教学内容上抓住教学重点，使课程深入浅出、条理清楚、层次分明[1]。首先， 教师应该对教学内容建立一个整体的概念，确定出教学的重点和难点；其次，运用对比法、 推理法，根据人体各部分机能的特点，找出各章节、各系统之间的内在联系；再者，教师将 各章节知识融会贯通，从而帮助学生对课程有一个全面的了解，进而进行理解性记忆，最终 提高教学效率和质量。例如，教材中《绪论》章节是课程最基础的部分，概念繁多，而且内 容枯燥，教师宜采用经典讲授法，对内容进行剖析，确立重点和难点，掌握课程的规律特点后，通过身边的例子，生动形象地进行教学，使学生的学习也轻松自在，也加深学生对知识 点的理解。 2、启发、问题式教学，调动积极性 生理学的理论知识是通过常年科学家的科学实验验证形成的知识理论体系，根据其本质 特点，可采用启发、问题式教学，充分调动学生的主动性和积极性，激发学生独立思考、分 析和解决问题的能力，使课堂充满活力。所谓启发、问题式教学，就是根据教学大纲要求， 结合学生的知识水平，潜心专研教材，运用各种教学手段，在学生的理解能力范围之内，精 心设计，启发诱导，在恰当的时机提出问题，传授知识[2]。例如，讲授完骨骼肌的结构、肌 丝的滑行学说、兴奋-收缩偶联及神经-肌肉接头后，可以设问：坐骨神经兴奋后，如何引起 腓肠肌收缩？又如，讲授动脉血压调节时，可以设问：通过稳压反射，可以使生理状态下的 动脉血压维持相对恒定，又为何有成千上万的老年人患有高血压疾病呢？这些问题的提出， 使学生感到生理学知识和生活、自身密切相关，启发学生思维积极性。教师在讲课中也要多 加总结，学生的总结能力有限，所以，课时结束时要将知识汇总，便于学生理解性记忆。总之，在生理学教学中，合理灵活应用启发、问题式教学，对于提高生理学教学质量，调动学 生学习积极性有着不可忽视的作用。 3、兴趣教学，引发学习动机 所谓兴趣教学，就是利用学生的好奇心、求知欲，创造出一个温和的教学氛围，使学生 在学习中愉快，在愉快中学习的一种教学方法。针对中职医学学生年龄较小、文化基础薄弱、理解能力不强的特点，教师在教学过程中应该由浅入深，由简入繁，通过通俗的语言、简单 易懂的例子，把抽象的理论具体化，引导学生结合自身生理特征，提出问题，让学生带着好 奇去学习，激发对自身的关切去猜想、讨论，去寻找答案，从而增强理解，便于记忆，真正
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
生理学教学方法探讨 摘要教给学生什么，让学生学会什么，是每个教师应该思考的问题。生理学教学应结合生活和临床实际，运用启发式教学，激发学生的学习兴趣，培养学生的独立思考能力和动手能力。恰当地运用多媒体教学方式能有效地提高生理学教学效果。 [关键词]生理学；教学方法；探讨 生理学是医学教育中的一门重要基础课程，其主要特点是理论性强、名词繁多且抽象复杂。正是这些特点，给学生们学习生理学带来了一定的难度，因此，我们的医学教育，既要让学生掌握现有的知识，更要训练和教会学生不断获取知识的方法。我国古代思想家老子也曾说过：“授人以鱼，不如授人以渔”，“授人以鱼，三餐之需；授人以渔，终生之用”。所以，教给学生什么，让学生学会什么，是每个教师应该思考的问题。本文拟结合教学实践，探讨生理学教学中的教与学。 一、生理学与生活、临床的结合 生理学是一门重要的医学基础课，是每个医学生必须掌握的学科，其内容逻辑性强，知识点多，既有局部微观的生理机制，又有整体宏观的整合原理，学生较难理解和接受，但学好生理学，对后续课程的学习及从事临床医疗工作又有很大的帮助。在当前医学基础学科的学时明显缩减的情况下，在短时间内掌握微妙复杂的人体正常活动机理，教学难度可想而知。因此，如果能在基础阶段的学习中引入生活、临床事件，无疑可以使学生在学习生理学知识时变得容易、记忆深刻。 （一）生理与生活、临床教学结合的优势 在医学教学中，生理学知识丰富繁杂，而这些知识往往又很抽象，学生要深刻理解并掌握这些知识往往存在一定的难度。如果能在教学中根据一些普通的生活事件或临床事件，让学生结合生活体会、观看临床视频探讨生理学问题，教师通过启发、引导，让学生掌握生活、临床事件中所蕴含的生理学知识，往往会事半功倍。 （二）生理与生活、临床教学结合的效果 教学实践证明，结合生活事件和临床的教学是开发学生潜能的一种教学方式，它能最大限度地调动每一个学生学习的积极性和创造性，激发学生的学习兴趣，有助于学生知识的获得和能力的培养，而学生学习兴趣越浓厚，学习主动性越强，其学习效果也就越好，从而提高了教学质量。 二、恰当运用多媒体提高教学质量