基因敲除技术的原理、方法和应用
2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条
1．基因敲除概述
2．实现基因敲除的多种原理和方法：
2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲
除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。
3．基因敲除技术的应用及前景
4．基因敲除技术的缺陷
关键词：基因敲除
1．基因敲除概述：
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：
2．1．利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：
a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3]
ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。[4,5]
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS 法。[6]
ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。[2，3,7]
f．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[8]（见图2）
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤
图2. 由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠
2.1.2条件性基因敲除法
条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[2]。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
条件性敲除的原理（图2，3）：
利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cre 转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表达为前提的。Cre 的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
所以只要控制Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
图3，利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
图4. 条件性基因敲除的基因重组及切除步骤
2.1.2.2 诱导性基因敲除法
诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre 表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类
型如下：四环素诱导型(图4)；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
图5.四环素诱导的基因敲除过程示例图
诱导性基因敲除优点：
①诱导基因突变的时间可人为控制；
②可避免因基因突变而致死胎的问题
③在2 个loxP 位点之间的重组率较高；
④如用病毒或配体／DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre 的转基因动物的过程。[10]
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞（原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。
．需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白
插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中
．需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白
图6：基因捕获法的基本原理图
2.2.2基因捕获法
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，其原理可见图6。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息
可以通过筛选标记基因侧翼cDNA 或染色体组序列分析来获得[13]
2.2.3基因捕获法的优缺点
用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体以及筛选中靶ES 细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的 ES 细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。
此方法的缺点是只能剔除在Es 细胞中表达的基因．单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES 细胞表达的基因，因此，在ES 细胞中进行基因捕获还是大有可为的。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，
2.3.RNAi 引起的基因敲除。
由于少量的双链RNA 就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi 的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi 这种更为简单方便的方法。[13-15]
2.3.1 RNAi 阻断基因表达的机理
双链RNA 进入细胞后，能够在Dicer 酶的作用下被裂解成siRNA ，而另一方面双链RNA 还能在RdRP （以RNA 为模板指导RNA 合成的聚合酶RNA-directed RNA polym 的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA 互补的mRNA 结合，一方面使mRNA 被RNA 酶裂解，另一方面以SiRNA 作为引物，以mRNA 为模板，在RdRP 作用下合成出mRNA 的互补链。结果mRNA 也变成了双链RNA ，它在Dicer 酶的作用下也被裂解成siRNA 。这些新生成的siRNA 也具有诱发RNAi 的作用，通过这个erase ，RdRP ）的作用下自身扩增后，再被Dicer 酶裂解成siRNA 。SiRNA 聚合酶链式反应，细胞内的siRNA 大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA 到几百个核苷酸的双链RNA 都能诱发RNAi ，但长
的双链RNA 阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA[13]。
2.3.2 RNAi 基因敲除的优点及应用
①.比用同源②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后外培养的细胞中利用RNAi 技术研究它的功能。
③.由于RNAi 能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。
④.RNAi 还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi 来阻断某些基因的表达，2.4实现基因敲除的其他原理。
除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和oligonucleotides ）引导的基因敲除术[16]以及反义技术在基因敲除技术中的运用等[17]。随着遗传学，分子生物学理论的发展，新的基因敲除原理也在不断的发现和发掘中。
重组法更加简便，周期大大缩短。
小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。
完善过程中，如TFOs （Triple helix forming 术的应用及前景：
．建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。
特定基因缺失的生物模型，
从而进行相关的研找基因生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为3．基因敲除技①基因敲除技术就常常用于建立某种究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。
②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻治疗的靶目标都有重大的意义。
③. 提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体
细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a １－３半乳糖基的基因的２个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生[10]。
④. 免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。
⑤改造生物、培育新的生物品种。细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。
转移酶如果将动物免疫破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基性， 国外医学 1999
26-5 Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector MIN HALLMANN*, ANNETTE RAPPEL, AND MANFRED SUMPER ent by homologous recombination in the multicellular green 4．基因敲除技术的缺陷
随除技术始终存在着一个难因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个 在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
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第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基
第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。
第二章生物芯片的基本原理 § 2.1 生物芯片的基本概念 一般而言，我们所指的芯片是以硅晶体为材料制造的用来存储信息、进行科学计算等用途的半导体器件，如各种计算机芯片。硅芯片是通过电路高低电平来表示逻辑1或逻辑0，不同的0，1组合可以代表自然界的一切信息，从而方便存储。生物电子芯片与硅芯片有很大的相似之处。20世纪70年代，人们发现脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid）处于不同的状态可以代表信息的存在或没有信息。这一发现引起科学家们的极大兴趣，科学家们立即投身到生物电子元件这一研究领域[1]。 80年代初，国际上提出了“生物芯片”这一概念，形象地把微电子集成电路技术与生物活性分子功能结合，提出构建具有生物活性的能够获取存储信息并进行处理和传输的微生物构件（微功能单元），以达到仿生信息处理的目的。在此基础上诞生了“分子电子学”。 90年代以来，在美国硅谷又兴起了研究和开发“生物芯片”的热潮[1][2]。这一“生物芯片”的概念是指运用大规模集成电路的光刻技术以及生物分子的自组装技术，在一微小芯片上组装成千上万个不同生物分子（DNA，蛋白质，多肽，细胞等）微阵列，实现生物分子信息的快速、并行、大规模检测[1][3]。 芯片分析的实质是在面积不大的基片表面上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子。结合或反应在相同条件下进行。反应结果用同位素、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录。通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息[3][4][5]。 芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片点阵中的每一个单元微点都是一个传感器的探头[6]。所以传感器技术的精髓往往都被应用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性。所以芯片技术也是传感器技术的发展。 生物芯片的概念来自计算机芯片，但是到90年代初以后，在人类基因组计划的推动下，才得以迅速发展起来。
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
基因芯片技术及其应用简介 生物科学学院杨汝琪 摘要:随着基因芯片技术的发展,基因芯片越来越多的被人们利用,它可应用于生活中的方方面面,如:它可以应用于医学、环境科学、微生物学和农业等多个方面,基因技术的发展将有利于社会进一步的发展。 关键词:基因芯片;技术;应用 基因(gene是载有生物体遗传信息的基本单位,存在于细胞的染色体(chromosome上。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上,称之为基因芯片(又称DNA 芯片、生物芯片。在一块1 平方厘米大小的基因芯片上,根据需要可固定数以千计甚至万计的基因片段,以此形成一个密集的基因方阵,实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术,把数以万计的基因片段以显微点阵的方式排列在固体介质表面,可以实现基因检测的快速、高通量、敏感和高效率检测,将可能为临床疾病诊断和健康监测等领域,带来全新的技术并开拓广阔的市场。 1 基因芯片技术原理及其分类 1.1基因芯片的原理: 基因芯片属于生物芯片的一种"其工作原理是:经过标记的待测样本通过与芯片上特定位置的探针杂交,可根据碱基互补配对的原则确定靶序列[1],经激光共聚集显微镜扫描,以计算机系统对荧光信号进行比较和检测,并迅速得出所需的信息"基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍,可在一次试验中间平行分析成千上万个基因,是一种进行序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。 1.2基因芯片分类: 1.2.1根据其制造方法可分原位合成法和合成后点样法;
1.2.2根据所用载体材料不同分为玻璃芯片!硅芯片等; 1.2.3根据载体上所固定的种类可分为和寡核苷酸芯片两种; 1.2.4根据其用途可分测序芯片!表达谱芯片!诊断芯片等 2 基因芯片技术常规流程 2.1 芯片设计根据需要解决的问题设计拟采用的芯片,包括探针种类、点阵数目、片基种类等。 2.2 芯片制备将DNA, cDNA或寡核昔酸探针固定在片基上的过程。从本质上可分为两大类fz} ,一类是在片基上直接原位合成,有光蚀刻法、压电印刷法和分子印章多次压印法三种;另一类是将预先合成的探针固定于片基表面即合成点样法。 2.3 样品制备常规方法提取样品总RNA,质检控制。再逆转录为。DNAo 2.4 样品标记在逆转录过程中标记荧光素等。 2.5 芯片杂交标记的cDNA溶于杂交液中,与芯片杂交。 2.6 芯片扫描一用激光扫描仪扫描芯片。 2.7 图像采集和数据分析专用软件分析芯片图像,然后对数据进行归一化,最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。 2.8 验证用定量PCR或原位杂交验证芯片结果的可信性。 3基因芯片合成的主要方法 目前已有多种方法可以将基因片段(寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种: 3.1原位合成:
基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因操作原理
《基因操作原理》课程教学大纲 课程编码：13019课程名称：基因操作原理 课程英文名 称： Princeples of Gene Manipulation 先修课程：生物化学、遗传 学、分子生物学 等 适用专业：生物技术生物科学 总学时：56 讲课学时 56 实验学时 0 实习学时 0 总学分：3.5 一、课程性质、地位和任务 “基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。 二、课程基本要求 能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。 本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。 三、教学内容及安排 绪论：基因操作的理论基础（2学时） 本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念 0.1基因的概念 0.1.1 什么是基因 0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性 0.1.3 基因的重叠与可变性
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
基因芯片技术及其应用 李家兴1001080728 园艺107 基因芯片( gene chip, DNA chip, DNA microarray 又被称为DNA芯片、DNA微阵列和生物芯片, 是指以大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针, 按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、载玻片或塑料片上, 一个指甲盖大小的芯片上排列的探针可以多达上万个[1- 3]。在使用时,先将所研究的样品标记, 然后与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交,再用激光共聚焦显微镜等设备对芯片进行扫描, 配合计算机软件系统检测杂交信号的强弱, 从而高效且大规模地获得相关的生物信息。此项技术将大量的核酸分子同时固定在载体上, 一次可检测分析大量的DNA和RNA, 解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目标分子数量少、成本高、效率低等的缺点[4]。此外, 通过设计不同的探针阵列( array , 利用杂交谱重建DNA序列, 还可实现杂交测序( sequencing by hybridization,SBH [5]。目前, 该技术在基因表达研究、基因组研究、序列分析及基因诊断等领域已显示出重要的理论和应用价值[6]。 1 基因芯片技术的产生和发展 21 世纪将是生命科学的世纪, 基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术, 它将像计算机一样成为21 世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石[7,8]。基因芯片技术的产生与发展与人类基因组计划(Human Genome Project, HGP 的研究密不可分[9]。人类基因组的大量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码, 基因的功能研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下, 以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了, 它被誉为是20 世纪90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。基因芯片技术充分结合灵活运用了寡核苷酸合成、固相合成、PCR 技术、探针标记、分子杂交、大规模集成电路制造技术、荧光显微检测、生物传感器及计算机控制和图像处理等多种技术, 体现了生物技术与其他学科相结合的巨大潜力。基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论, Southern 印迹可以看作是生物芯片的雏形; 其后, 人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描
第一节基因操作原理 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。另一个特征是繁殖。 这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。 本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。 基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？ 20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。 分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平，在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。 在这种情况下，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说 DNA（核酸）的静态和动态化学本质。目前的分子生物学，朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。 在以上这些研究中，均涉及在DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。
基因芯片技术及其应用摘要： DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。 关键词 DNA芯片制备检测应用 随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组测序得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。DNA芯片的出现是科学发展的必然产物。本文就DNA芯片的制备及其在医学领域的应用予以阐述。 1 基因芯片的制备及检测技术[1-4] 1.1 基因芯片的制备方法 1.1.1 原位合成法其中最具代表的是原位光刻合成法。该法是利用分子生物学、微电光刻技术及计算机技术等直接在基片上合成所需的DNA探针。除原位光刻合成法外，原位合成法还包括原位喷印合成和分子印章在片合成法。 1.1.2 直接点样法该法是将制备好的DNA（cDNA）片段直接点在芯片上。近来有人提出用电定位捕获法和选择性沉淀法制备芯片。 1.1.3 电定位捕获法是将生物素标记的探针在电场的作用下快速地固定在含有链霉素亲和素的琼脂糖凝胶膜上。由于生物素与链霉素亲和素的强亲合力，使得探针的固定更加容易和牢固。在电场的作用下，靶基因能快速地在杂交部位积聚，大大缩短了杂交时间，提高了杂交的效率，且改变电场电极的方向可以除去未杂交或低效率杂交的靶基因。 1.1.4 选择性沉淀法该技术是用金属纳米粒标记探针的方法来制备微阵列，靶基因在芯片上与探针杂交后发生选择性沉淀，通过检测沉淀物的电化学值等来获取相应的生物信息。
Chapter I Introduction 1)什么是基因基因有哪些主要特点 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存 在对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程简述基因工程的基本过程p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同为什么 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母 Chapter Ⅱ The tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶简述其主要类型和特点 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基 础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生 以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等 常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管 如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基 因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi 和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的
（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考） 第一章 编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include: 1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame) 2.保证转录所必须的调控序列(S-D) 3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer) 4.内含子(intron) Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。 两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。 Development of gene engineering： 第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程 第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程 第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程 第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程 第二章 目的基因的获得（DNA的准备） 1.从基因组直接获得 2.RT-PCR 方法获得 3.人工合成法 DNA抽提的基本原理 ?1 获得细胞，裂解细胞 三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。 2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离） 3 纯化（去除RNA） ?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。 3 纯化（去除蛋白） ?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。 PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制 PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右
医学分子生物学杂志,2007,4(1):862 90 J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290 通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1 co m ) Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603, E 2mail: htang2002@yahoo 1co m ) 基因敲除技术现状及应用 万海英 综述 汤华 审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室 天津市,300070 【摘要】 功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 【关键词】 基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】 R34918 St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene Knockout WAN Haiying,T ANG Hua Tianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China 【Abstract 】 Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made in the vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】 gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础[1] 。基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细 胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。 基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,
第一章 1. Gene manipulation 基因操作。将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 2. Interrupted genes 间断基因。序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。 3 .Promotor 启动子。DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。4. Subcloning 亚克隆。当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。 第二章 1.Restriction and modification 限制和修饰。宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。 2. Matched ends 匹配末端。识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。 3. Blunt ends 平末端。在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。 4. Isoschizomer ：同裂酶。识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 5. Isocaudiners ：同尾酶。来源不同、识别序列不同，?但产生相同粘性末端的酶。 6.Site preferences ：位点偏爱。某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。 7.Star activity 星星活性。在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 8. Nicking enzyme 切口酶。有些限制酶只切割双链DNA 中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。 9. Klenow fragment Klenow 片段。Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。 10 .Sequenase 测序酶。是改造的T7 噬菌体DNA 聚合酶，切除了99% 以上的3'--5' 外切活性。Sequenase Version2 切除了所有的3'--5' 外切活性，用于双脱氧链终止法对长片段进行测序。 11.Reverse transcriptase 反转录酶。即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。它来自AMV （禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。 12. Terminal transferase 末端转移酶。来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA 聚合酶，在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP 加于DNA 分子的3' 羟基端。若dNTP 为T 或C ，此二价阳离子首选钴离子；若dNTP 为A 或G，此二价阳离子首选镁离子。 13. Ligase 连接酶。催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。 14. T4 polynucleotide kinase T4 多核苷酸激酶。催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。 15. Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶。主要来源于牛小肠（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称CIP 或CIAP，也有来自细菌（BAP）。催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸。 16. S1 nuclease Sl 核酸酶。来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。