实验十一 PEG诱导细胞融合
一、实验目的
1．了解聚乙二醇诱导细胞融合的原理与技术。
2．学会鉴别融合细胞。
二、实验原理
细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的现象。细胞融合技术是细胞工程骨干技术，除了用于一些基础性研究外，在植物方面主要用于合成新种；动物方面主要用于生产单克隆抗体。
细胞融合的诱导因素主要有以下三种：
1、生物融合因子：如病毒。
2、物理因素：如电融合仪,主要用于植物细胞。
3、化学因素：如聚乙二醇（PEG），分子量200－6000都可用，以1000较好。聚乙二醇最早用于诱导植物原生质体的融合，现已普遍用于多种细胞。其优点是:材料易得、操作方法简单、效果稳定。
病毒介导的细胞融合常用灭活的仙台病毒，主要用于动物细胞融合。其优点是融合率高，对各种动物细胞都适宜；缺点是不稳定，在保存过程中融合活性降低，并且制备过程繁琐。
细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合：细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料及用品
实验材料：鸡红细胞、鸡白细胞
实验器材：普通离心机，水浴锅：50oC，37oC，细胞计数板
四、实验步骤
1、配50％PEG：称取10gPEG，加入带盖离心管中；将带盖离心管放入电炉上的沸水中，加
热使PEG熔化；待冷却至50oC时，加入等体积预热至50oC的HanKs液或不加血清的培养液混匀，保存于37oC水浴中。
2、准备鸡血：加2ml肝素抗凝鸡血于10ml带盖离心管中，800rpm离心5min，去血浆；再
加5ml Hanks液洗红细胞一次，800rpm离心，去上清；配制成2%鸡血。
3、分离鸡白细胞：1ml淋巴细胞分离液+1ml鸡血，2000rpm离心20分钟，吸出白细胞放入
另一个离心管中加入5ml Hanks液1000rpm离心5min,弃上清。
4、混合细胞：取0.5ml鸡红细胞加入白细胞沉淀，用手轻弹离心管底部，使沉淀松散。
5、PEG介导融合：吸取1ml 50％PEG，在37oC水浴中1分钟内加入细胞沉淀中，边加边振
摇离心管，使PEG与细胞混匀；
6、终止PEG作用：向试管中加入8－10ml Hanks液轻轻吹打混匀，在37oC水浴中静置5min
（稀释PEG终止其作用，并降低介质密度，便于离心）；
7、离心除PEG：1500rpm离心5min，去上清；
8、加培养液培养：加入1640完全培养液37oC水浴培养30min。
9、观察：分别温浴10、20、30分钟取细胞悬液临时制片观察，直到观察到细胞融合为止
（可用0.2%次甲基蓝染色）。
五、实验结果：
六、实验注意事项：
1. 由于离心时白细胞的数量很少，吸取的时候要小心，尽量把吸附在管壁上的白细胞都吸出来。此外吸取的动作不能太大，否则会破坏离心形成的分层。
2. PEG处理时间不宜过长，最多不能超过90s，否则会有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体，或者细胞膜破裂导致细胞质外泄。
3. 经PEG处理后加液混匀时应轻轻洗打，以免刚刚融合的细胞分开。
4. 加PEG应该在37oC水浴加，这样可以防止PEG凝固，导致离心失败。
5. 注意每次离心的时间和速度，否则得不到想要的白细胞。
七、实验拓展：
细胞融合技术的发展及应用
细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20 世纪70 年代末至80 年代初, 是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段, 而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学, 特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入, 细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。本文就其发展历史及研究进展, 主要应用及发展前景做一简要回顾及展望。
一、细胞融合及其意义
（1）细胞融合的概念
所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂) 作用下,两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为
细胞融合( cell fusion) 或细胞杂交( cell hybridization) 。如取材为体细胞则称体细胞杂交( somatic hybridization)。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞, 由此形成的杂交
细胞,其特性会有很大的变化。
（2）细胞融合的意义
细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限, 扩大了遗传物质的重组范围。但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现, 直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少, 有利于广泛开展研究和推广, 有着重大的实践意义[1] ,正得到科学界的日益重视。
二、细胞融合技术发展的历史回顾
人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后, 人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合, 从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后, 才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。然而, 由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG, 作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的“无声革命”。但在PEG 诱导细胞融合的有效浓度范围内( 50 % ～55 % ) 对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG 介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。总之, 细胞融合技术在实践中不断发展和完善, 细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物不断提高的方向发展。理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便，便于量化研究。同时又能使融合率得到。
（1）自然发生的细胞融合
早在19 世纪,人们就发现在自然条件下生物界中有“自发”的细胞融合现象。Muller ( 1838 年) 在肿瘤中观察到了多核细胞,此后在由病毒感染的病料组织中如天花脓疱的周围、受水痘损害的皮肤、在麻疹病人的扁桃体中陆续发现多核细胞,这些多核细胞可能是病毒作用的结果：但当时还没有人认识到这一点。1875 年Lange 首先观察到脊椎动物(蛙类)血液细胞合并，继之又有一些研究者在无脊椎动物中也发现了融合细胞。
（2）组织培养中发生的细胞融合
自从Harrison (1907 年) 进行组织培养以后, 人们便开始注意组织培养中多核细胞的形成。第一个报告组织培养中细胞合并的是Lambert ( 1912 年) 。到了1960 年,法国Barski 首先实现了异种动物体细胞的融合。但细胞在体外培养时, 自发融合的频率是极低的。
（3）病毒介导的癌细胞融合
1958-1960 年日本学者冈田善雄(Okada)首先观察到流感病毒可杀死患欧利希癌的小白鼠腹腔中的腹水癌细胞( ETC) , 随后的研究中发现在取出的腹水中有无数巨大球形细胞。进一步在电镜下观察发现巨大细胞是呈车轮状排列的几个以至几十个核的多核细胞。这种多核细胞是由ETC 融合形成的, 并且发现这种巨大细胞形成的频率与接种病毒的量成一定比例。此
后一系列的试验表明病毒能引起细胞融合的现象。此后, 冈田善雄又发现流感病毒HVJ 株在体外也可促进ETC 的融合反应。添加病毒后发现ETC 立即凝集,在37 ℃下5 min 后细胞开始相互融合。他又对影响细胞融合现象的因子,如温度、氧气、钙离子、pH 值等对细胞融合的影响进行了比较深入的探讨，做了大量开创性工作,这些发现使得病毒类成为研究的最早的促融剂，并在此基础上开展了一系列的改进研究工作。
（4）灭活病毒诱导的异种动物细胞融合
一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合, 但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物, 并且以异种细胞作为融合对象。1965 年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价, 认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在定的条下融合一件动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合, 融合的细胞可以存活。同时Littlefield ( 1964 年)又设计出有效筛选杂种细胞的一系列方法,从而进一步推动了融合细胞的实验工作。1967 年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。同年Watkins 和Koprowski等又分别证明融合细胞能使缺陷型病毒复原。1970 年Ruddle 等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。1970 年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验, 开始了各种细胞重组的研究工作。
从发现病毒能够诱导细胞融合之后, 动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ 诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因, 人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。
（5）植物细胞融合
植物细胞融合技术的发展可追溯到1937 年,Michel用0.5 mol/L 硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体, 使实验受到原生质体数量的限制, 因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960 年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972 年美国科学家Carlson 等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。20世纪70 年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。（6）微生物细胞融合1975 年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy 首先报道PEG促使真菌融合, 以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。
（7）PEG作为促融剂引起的革命
由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,科学家们又尝试寻找比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物PEG。加拿大华裔科学家高国楠等( 1974 年) 的研究取得重大突破,他发现高分子量的聚乙二醇( PEG) 在Ca2 +存在时能促使植物原生质体融合,显著提高融合率, 从而迅速推动了原生质体技术的基础研究和应用研究。至此,应用原生质体和发展操纵它们的方法,已引起实验生物学的“无声革命”。同时, Pontecorvo ( 1975 年)发现PEG能诱导哺乳动物细胞融合并产生杂交细胞。1976 年Davidson等对此作了进一步证实。以后的研究工作表明, PEG 不仅可以促使植物、动物、微生物的细胞融合,而且还能促使动物细胞与植物的原生质体发生融合,促使微生物原生质体与动物细胞融合, 使植物原生质体摄入微生物。1975 年Ahkono 报道用PEG将母鸡的红血球细胞和酵母菌的原生质体融合成功。1976 年Dudus等报道人的细胞能和胡萝卜的原生质体发生融合。Davey ( 1972 年)和Vasil( 1977 年)用植物原生质体摄取了细菌细胞。
1975 年，在动物体细胞杂交技术的基础上又创立了淋巴细胞杂交瘤技术。同体细胞融合一样, 杂交瘤工作早期使用的促融剂——灭活的仙台病毒, 已逐渐为化学促融剂PEG 所取代。Davidson 等于1976年建立的以PEG诱发哺乳类细胞融合的方法, 也同样适用于淋巴细胞同瘤细胞的融合。由于淋巴细胞杂交瘤技术能制备纯度高、专一性强的抗体,适于由未纯化的抗原大量制备,因而在短短几年时间里,即已被广泛用于制备各种单克隆抗体。
（8）细胞拆合工程的诞生
20 世纪70 年代初,细胞融合技术进入了一个崭新的阶段,诞生了细胞拆合工程。Carter 于1967 年发现细胞松弛素B (cytochalasin B,简称CB )能诱发体外培养的小鼠L 细胞的排核作用。Prescott等于1972 年首先应用离心术结合CB 分离哺乳类细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。由细胞核、质分离与细胞融合这两项技术汇合起来而建立的细胞重组技术,可使胞质体与完整细胞融合,构成胞质杂种细胞;胞质体与核体融合, 构成重组细胞; 把微核化细胞导入完整细胞, 构成微细胞异核体。1982 年, Ferenczy 在真菌中应用这些技术,使核与原生质体的融合取得成功。这项技术对于研究核与核、核与胞质之间的相互作用及微生物代谢产物的调控过程有重大意义,也已成为育种工作的一条新途径。
（9）新的细胞融合方法
细胞融合技术在生物科学各领域取得进展的同时,从事细胞融合研究的科学工作者一直没有放弃寻找具有更高融合效率的方法。虽然用PEG 作介质诱导细胞融合具有上述优点,但PEG 诱导细胞融合也存在一些内在的问题,如PEG 在有效的浓度范围内( 50 % ～55 % )对细胞毒性很大,因此人们又试图寻找新的方法来替代PEG 介导细胞融合法。
①电脉冲诱导细胞融合技术
20 世纪80 年代产生了一种新的方法即电脉冲诱导细胞融合技术。德国的Halfman 和Zimmermann 等( 1982 年、1983 年) 发明的电融合法,以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为基础,对哺乳动物细胞、植物和酵母原生质体的融合都有成功的结果。电融合技术的优点在于: 融合频率高, 是PEG 的100 倍; 操作简便, 快速;对细胞无毒; 可在镜下观察融合过程。目前, 电融合技术已成为细胞融合的有效手段之一。
②激光融合技术
20 世纪80 年代中期又发明了激光融合器,迅速崛起的激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动) ,可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触, 然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。1987 年和1989 年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活。激光微束融合法与以前的病毒法、PEG 法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小, 定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程, 实验重复性好, 无菌,无毒性。但它只能逐一处理细胞,不能像其他方法一样同时处理大量细胞。细胞间相互接触是实现细胞融合的前提,目前,最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触,即光镊( potical tweezers) 利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间,在光斑直径与光波波长尺度相比拟时,指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力, 该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处, 从而实现对细胞的操作。
③空间细胞融合技术
植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在,有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大, 异源细胞融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,
在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20 世纪80 年代以来,德国细胞电融合技术发明家Zimmermann 等人在空间材料科学的启发下, 试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明,在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故,杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。在取得这些成功实验的基础上,进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经开始。
④离子束细胞融合技术
雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体, 20 世纪80 年代中期,中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在, 建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中, 粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀, 引起细胞膜透性和跨膜电场的改变,据此原理,发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外, 离子种类、电荷、质量皆可调,因此,离子束的可操纵性高, 可以用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量, 将是细胞融合研究的一大进步。
⑤非对称细胞融合技术
即利用某种外界因素(常为γ射线, 即γ融合) 辐照某一细胞原生质体, 选择性地破坏其细胞核。并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体, 选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这两个原生质体品系的细胞, 从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合, 或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内,实现有限基因的转移,从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。
实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线和X射线等照射,为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性。值得注意的是, 此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移, 通过辐照胞质不育的原生质体,破坏其染色体,与其具有优良性状品种的原生质体融合, 从而获得实用的新的胞质不育系。这些都是常规育种所做不到的。
纵观细胞融合技术的发展历史, 细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上, 另一方面体现在新方法上, 再者体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒,灭活病毒生物阶段到PEG 化学物质阶段; 新方法不断涌现, 从生物学, 化学方法,物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物,植物到微生物,从种内扩展到种间, 从近缘扩展到远缘。每一次技术上的更新和改进都会带来应用上的巨大革命和创新, 达到为人类服务的目的。
三、细胞融合技术的应用及发展前景
从细胞融合技术发展的历程可以看到, 伴随着细胞融合技术的每一次革新和改进, 都会迅速在各个领域得到充分的应用, 然后在实际应用中又不断发现新的问题,在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶, 使其日臻完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药物单克隆抗体和疫苗等有用物质的生产。并且细胞融合技术和基因工程的汇合, 使生物工程进入了崭新的发展阶段。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合 【实验目的】 1.了解动物细胞融合的常用方法。 2.学习化学融合的基本操作过程。 3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。 【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。 2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG 是广泛使用的化学融合剂。 3、电激诱导融合
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下： 1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】 2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ②1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； ③1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】 3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液； 4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个； 5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为①②③号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。 【实验结果】 1、实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： ①两细胞的细胞膜相互接触、粘连； ②接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； ③通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； ④细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图：
食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术
原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用
山东大学细胞生物学实验报告 聚乙二醇（PEG ）法诱导的动物细胞融合实验 2012/9/11 实验目的： 了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。 实验原理： 1. 细胞融合的概念 两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。 2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理 细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物 理诱导。1953年，M. Kuroya 在临床中第一次分离到仙台 病毒（HVJ ）[1]。1958年，日本学者Okada 发现仙台病毒 （HVJ ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒 的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细 胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。 1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇 （Polyethyleneglycol ，PEG ）化学融合法，由于该方法对 实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛 的细胞融合方法。化学诱导细胞融合的基本原理是PEG 等化 学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重 排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲和作用和表面张力实现融合。比之于仙台病毒诱导法，PEG 诱导法的效率提高了几百倍。 80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5] ，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。 图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie 等，1982 )。 图1. 仙台病毒示意图。a 和b 是病毒套膜，c 为糖蛋白，d 为类染色体。
#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。 关键词:细胞融合技术;发展;应用 中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合 第15卷第2期2006年4月 激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m
题目：PEG促细胞融合 一．实验目的: 1.掌握细胞融合的方法 2.学习使用PEG促进细胞融合的方法和步骤 二．实验原理 1.细胞融合：在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上 的细胞合并形成一个细胞的过程。由于体外培养的细胞很少会发生自发融合融合频率大约在10?4-10?6之间，因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。 2.促进细胞融合的方法 a)生物方法：病毒（Sendai virus，Newcastle disease virus，Vaceine virus） b)化学方法：聚乙二醇、盐类融合剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。PEG相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。普遍认为 聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏 散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒 更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。 c)物理方法：电融合:电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，是 融合率大为提高。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂 双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大， 处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆 形的大球状细胞。与ⅣG法比较，电融合法融合率高：重复性强：诱导仅发生在 质膜接触部位，对细胞或原生质体伤害小：融合是在同步状态下进行，活细胞数目 多；装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录象融合过程：免去PEG诱导后的 洗涤过程，诱导过程可控制性强。 三．实验材料及设备 1.实验材料： a)50%PEG混合液
河北科技师范学院学报 第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19 No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。 关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定 中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。 自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1 原生质体的分离和培养 1.1 起始材料 起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2 基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有 收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12
细胞融合技术的应用与前景 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的 台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的 方向发展。 1．细胞融合的意义 所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 2．动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
无缝克隆与基因融合 基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法 前言 随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。 无缝基因融合及其应用 无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。 启动子和外显子研究 基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。 蛋白质功能研究和蛋白质工程 蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。 蛋白质表达 标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定，通常是这种情况。然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。 在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如
细胞融合技术研究进展 年级专业 课程 学生姓名 学号 指导教师
摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。 关键词：细胞融合;机理;方法;应用 细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法 自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
08检二陈勇0803010049 PCR技术综述 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。PCR技术的展简史 1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。 20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR 技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。 PCR技术的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法,反应原理与细胞内的DNA 半保留复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3 ’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以待扩增的DNA片段为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链碱基互补配对结合；最后在引物、四种dNTP、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍，即靶DNA数目以
摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。 关键词：方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展
中国海洋大学实验报告 姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学 科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006 PEG 介导的动物细胞融合技术 一、实验目的 （１）、通过实验，对体细胞融合有一个清醒的认识 （２）、通过ＰＥＧ介导鸡血细胞融合，初步掌握利用ＰＥＧ介导动物细胞融合的实验技术。 二、实验原理 真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核的细胞的过程称为细胞融合，通过此技术可以实现不同种类的细胞的融合。基因型相同的细胞融合称为同核体（ｈｏｍｏｋａｒｙｏｎ），基因型不同的细胞融合称为异核体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ） 目前，诱导细胞融合的技术主要有三种：病毒，聚乙二醇（ＰＥＧ），电激。第一种方法是通过生物病毒的方式，诱导细胞与细胞之间的融合。后两种方法通过化学物理的手段使得细胞膜的膜脂类分子的排列发生变化，去掉作用因素后，质膜分子的排列恢复原有的形态，
在恢复的过程中，可以诱导相接触的细胞发生融合。 ＰＥＧ介导的细胞融合，其融合效果受到以下几个因素的影响 ①、ＰＥＧ的分子量与浓度 ＰＥＧ的分子量及其浓度越大，细胞融合效果越明显，但对细胞的毒性也越大。本实验使用的ＰＥＧ分子量为４０００Ｄ，浓度为５０％ ②、ＰＥＧ的ｐｈ值 经验证，ＰＥＧ的浓度在８.０～８.２时，融合效果最好 ③、ＰＥＧ处理时间 处理实验越长，融合效果越好，但对细胞的毒性也越大。故一般将处理时间限制在１分钟以内。本实验不涉及后续的细胞培养，所以处理时间可适当放宽至数分钟 ④、融合时的温度 温度越高，细胞膜脂质的流动性越好，故在细胞可以承受的范围内，适当的提高温度有利于细胞的融合 三、实验材料 新鲜鸡血 ０.８５％生理盐水 ＧＫＮ液 ５０％ＰＥＧ液
实验报告 课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩： 实验名称： 利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合 实验类型： 细胞结构观察 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 ⒈掌握小鼠脾脏细胞的提取方法。 ⒉学习细胞融合技术，观察不同处理条件获得的融合细胞的形态及变化，计算融合率 。 二、实验内容和原理 细胞融合是两个或以上保持完整的细胞在特殊条件的作用下，相互接触进而发生膜融合， 最终使细胞融合成双核或多核细胞的现象。细胞融合得以发生，是基于细胞质膜的流动性以 及至双分子层自组装的特点。 细胞融合是细胞工程试验技术之一，对于动、植物细胞均取得了重要的研究和应用成果。 例如，能够产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞间的细胞融合是制备单克隆抗体的基础。早熟染 色体凝集的研究与有丝分裂促进因子的发现也是基于细胞融合技术。植物细胞原生质体融合 是植物细胞工程的一种技术手段，在植物育种等方面有着较为广泛的应用。 实现细胞融合的方法主要有化学诱导融合、电刺激诱导融合以及灭活病毒诱导融合，本 实验采用化学诱导融合，用 PEG 处理小鼠脾脏细胞。
在使用PEG 溶液处理提取的小鼠脾脏细胞后，再以GKN 液清洗，细胞的融合效果较好。 PEG 是一种高分子化合物，相对分子质量在200~6000 之间的均可用作细胞融合剂，常用质量 浓度是200~500g/L。PEG 能诱导细胞融合的机制是由于PEG 能够吸收大量水分，当两个相邻 的细胞间的水分被PEG 大量吸收时，细胞质膜磷脂分子的排列发生改变；为了使细胞处于较 为稳定的状态，相邻的细胞由于接口处双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质 流通。这种方法稳定性好，但对细胞有一定的毒性。 电刺激融合的基本原理为：在瞬时的强电场的作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，可 诱导相互接触的细胞膜的融合，从而发生细胞融合。这种方法无化学毒性，对细胞损伤小。 灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋 白发生作用，是细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开， 细胞发生融合。 在本实验中，细胞融合的效率可以用融合率来衡量。取一视野，融合率=发生融合的细胞 数/视野中的所有细胞数。其中，判断细胞是否融合的依据是两个细胞核是否有部分重合。影 响效率的因素包括细胞密度、融合剂的浓度和处理时间。为研究这些因素对实验的影响，可 以设置多组对照（时间梯度、浓度梯度对照，空白对照）。 三、主要仪器设备 ⒈材料 小白鼠 ⒉器材 冷冻离心机、解剖盘、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、滴管、小烧杯、显微镜、离心管、移液枪。 ⒊试剂 装 生理盐水、固定液（甲醇-冰醋酸3:1）、75mmol/L KCl溶液、GKN 液、PEG 溶液、90%乙醇、吉姆萨染订 线
细胞融合技术及其研究进展 摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。 关键词：细胞；细胞融合；细胞工程 1 引言 在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。 随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。 2 细胞融合技术 2.1仙台病毒(HVJ)诱导法 2.1.1仙台病毒诱导法原理 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质