(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910206785.0
(22)申请日 2019.03.19
(71)申请人 华南农业大学
地址 510642 广东省广州市天河区五山路
483号
(72)发明人 罗永文 毕水莲 梁嘉琪 曾小玲
龙家慧 潘雨晴 郭霄峰
(74)专利代理机构 广东广信君达律师事务所
44329
代理人 杨晓松
(51)Int.Cl.
C12N 7/01(2006.01)
C12N 15/65(2006.01)
G01N 33/569(2006.01)
(54)发明名称一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用(57)摘要本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP及其应用。所述重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。利用该重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP建立的狂犬病病毒中和抗体水平检测方法具备以下优点：一、该病毒不能在细胞和活体中传代繁殖，因此更安全；二、该检测方法以直接荧光显微镜下观察，更加经济便捷；三、该检测方法的测定结
果相对于利用弱毒株的方法更加可靠。
权利要求书1页 说明书8页序列表1页 附图4页CN 110042087 A 2019.07.23
C N 110042087
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110042087 A
1.一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP，其特征在于，所述重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：
a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；
b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；
c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
2.一种制备重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP的方法，其特征在于，利用基因工程技术在稳定表达狂犬病病毒CVS-11毒株糖蛋白的BHK-21细胞上构建并拯救出一种将糖蛋白基因替换成绿色荧光蛋白基因的狂犬病病毒重组毒株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：筛选稳定表达CVS-11糖蛋白的BHK-21细胞系；
S2：构建重组质粒pHEP-△G-EGFP；
S3：拯救及筛选重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括：
S21：PCR扩增EGFP和载体pHEP-△G(缺失糖蛋白基因)片段；
S22：将质粒进行无缝连接，将连接产物转化至感受态细胞后进行筛选得到阳性克隆菌；
S23：提取阳性克隆菌的质粒后进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S21包括：
S211：以质粒pEGFP-N1为模板，利用引物EGFP-F和引物EGFP-R进行PCR扩增，所述引物EGFP-F和引物EGFP-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和SEQ NO：2所示；
S212：以质粒pHEP-3.0为模板，利用引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R进行PCR扩增；所述引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：3和SEQ NO：4所示。
6.根据权利要求2-5所述的方法得到的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
7.根据权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP在检测抗体水平中的应用。
8.一种利用权利要求1或者6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP检测血清中的中和抗体水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将待测血清进行灭活处理；
S2：加入重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP进行孵育中和反应；
S3：加入BHK-21细胞悬液，培养24-48小时后直接在荧光显微镜下观察统计。
9.根据权利要求8所述的方法在评价疫苗免疫效果中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
2
伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析 黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13 (11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095; 21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005) 摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491 bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG 具有膜蛋白的结构特点。 关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列 中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704 Cloning ,sequence analysis of the gG gene of Pseudorabies virus SH strain HUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1, ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13 (1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture , Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Science and Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China ) Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1 K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence 伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @ njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity
V IROLOGICA S INICA, August 2007, 22 (4):316-325 Received: 2007-04-04, Accepted: 2007-05-18 * Foundation item: Key technologies R&D program (2006BAD06A01) from the Ministry of Science and Technology of China. ** Corresponding author. Tel: +86-27-87199239, E-mail: wanghz@https://www.doczj.com/doc/558173602.html,
ZHUAN et al. Rapid Construction of Recombinant Viruses of PRV Genome 317 functional domains within the proteins (9). Such studies often require establishment of large numbers of recombinant viruses which are usually created by homologous recombination in infected cells relying on the cellular recombination and repair machinery. However, this can be a laborious and sometimes impossible task, especially if the mutant has a severe growth disadvantage compared to the wild-type virus. Bacterial artificial chromosomes (BACs), single copy F-factor-based plasmid vectors of intermediate insert capacity (15), have now enabled the cloning of complete herpesvirus genomes and infectious virus genomes can be shuttled between Escherichia coli (E. coli) and eukaryotic cells. While herpesvirus BAC DNA engineering in E. coli requires neither restriction sites nor cloning steps and allows the introduction of a wide variety of DNA modif- cations, the large size of these bacmids precludes the use of rapid in vitro methods of manipulation commonly employed for construction of small plasmids. Tn7, a site-specific transposon, transposes almost exclusively to a distinct attachment site named attTn7 within the E. coli genome (1). By introducing this attTn7 sequence into a BAC, Tn7 can serve as an insertion vehicle (4). This is particularly useful if numerous genes and constructs need to be tested for their expression in the context of viral genome. Tn7-mediated transposition has been well exploited for research on functional genomics of baculoviruses (4). Recently, this technology has been applied to bacmid-cloned cytomegalovirus (CMV), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, for rapid recombinant virus construction (2). In this paper, we report the development of a technology employing Tn7-mediated transposition as a rapid and reliable method for recombinant PRV construction. A lacZα-mini-attTn7 region was inserted into the intergenic region between the gG and gD genes in an attempt to maintain every gene and element of the parental virus. Then green fluorescent protein (GFP) gene was introduced to test the utility of this transposition system and the stability of mini-Tn7 insertions in cell culture. The technology should greatly facilitate the detailed mutagenic studies of PRV. MATERIALS AND METHODS Plasmids, strains, and reagents Plasmids pGS284 and pBecker3, strains GS500 and S17λπ were provided by Lynn W. Enquist, Princeton University, USA. The pGEM-T Easy was purchased from Promega Co. (Maddison, USA), and plasmid pEGFP-N1 from Clonetech Laboratories, Inc. (Mountain View, USA). DNA restriction enzymes, T4 DNA ligase, alkaline phosphatase, exTaq hot start DNA polymerase and 2×GC buffer I were the products of TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, China). Plasmids pFBCMV-GFP and pZFBΔtk were constructed and stored in our lab. Strains DH5α and DH10B were stored in our lab. Lipofectin reagent and Delbecco’s Modified Essential Medium (DMEM) were purchased from Invitrogen Co. (Carlsbad, USA), and fetal bovine serum (FBS) from Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. (Hangzhou, China). Virus and cells The wild-type PRV used was vBecker3, generated by transfection of pBecker3 into Vero cells (18). Mutant PRVs (vBeckerZF1 and vBeckerZF2) were
实验三伪狂犬病的诊断 一．实验目的： ⒈熟悉伪狂犬病的临诊特点。 ⒉熟悉伪狂犬病的诊断方法。 二．实验原理： 利用分离的伪狂犬病毒注射实验兔，病毒在动物机体繁殖一段时间后，会影响实验动物的神经系统，实验兔会出现强烈的痒觉，根据这些症状来判断是否含有伪狂犬病毒。 三．内容及方法 1. 伪狂犬病的临床特点 本病发生于牛、绵羊，犬、猫、鼠及猪。野生动物亦可发生。牛、绵羊、犬及猫感染本病后症状很特殊而明显。主要表现为某部皮肤的强烈痒觉。常使劲地于墙柱上摩擦，直到皮肤撕碎，仍不断摩擦，病畜像疯狂一样，用力制止亦无效果。体温可达40℃以上。常发病后48小时内死亡。成猪一般为隐性感染，怀孕母猪可发生流产、死胎、木乃伊胎儿。仔猪，尤于新生仔猪病情极严重，常可发生大批死亡。主要侵害神经系统，表现为神经症状。 2. 实验室诊断 2.1 病料的采集与处理 分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病总部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1:10组织悬浮液。 2.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。但这种症状只维持几小时，一般常于夜间死亡，可见死兔口内有接种部位咬下的被毛。亦可脑内接种小鼠，症状可维持12小时，但其敏感性不如兔。亦可用细胞培养来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。 2.3 兔、猪及牛肾原代细胞培养。病料接种细胞后最早经18小时出现病变(病毒量大)，一般经48小时，病毒量很低时要到96小时。其典型的病变是出现巨细
狂犬病防治手册 1．为何要停止生产含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗？ 研究发现，含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗较无佐剂狂犬病疫苗免疫人体后中和抗体的产生晚7天左右。狂犬病疫苗的暴露后免疫是一种应急使用，抗体的产生越早越好。因此，氢氧化铝佐剂对狂犬病的暴露后治疗十分不利。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。狂犬病疫苗中的的氢氧化铝佐剂同样可以导致不良反应增多。因此，2004年12月的人用狂犬病疫苗质量工作会议上，国家食品药品管理局已要求各生产企业在2005年6月30日前停止氢氧化铝佐剂人用狂犬病疫苗的生产。 2．为什么人用纯化狂犬病疫苗禁止臂部肌肉注射？ 因为臂部脂肪较多，疫苗注射后不易扩散，可能会影响免疫效果。因此，要求成人在上臂三角肌注射，儿童最好选择大腿前外侧区肌肉注射。 3．正在接种其它疫苗，是否可以注射狂犬病疫苗？ 正在接种其它疫苗，仍可注射狂犬病疫苗，但接种部位应远离前一种疫苗的接种部位。 4．使用疫苗的同时使用抗生素，会影响疫苗的效果？ 二者同时应用不会影响疫苗的效果。 5．年幼儿童注射疫苗为什么选择大腿前外侧？ 因为臂部肌肉脂肪较多，疫苗注射后不易扩散。上臂三角肌不发达，会影响疫苗的吸收。大腿前内侧因有大血管和神经经过，在此接种易发生危险。所以，年幼儿童应在大腿前外侧区肌肉注射，这里肌肉丰厚，易接种。
6．狂犬病病毒从感染至发病有哪些步骤？ 狂犬病病毒从感染到发病的步骤为：①病毒感染；②病毒在肌肉内复制；③病毒在神经肌肉结合处，与乙酰胆碱受体结合；④病毒通过快速轴突传递方式在周围神经的轴突内传播；⑤在脊髓的神经元与局部的周围感觉（背根）神经节内复制并快速上行到脑；⑥脑部神经元感染伴发神经功能障碍；⑦沿神经离心扩散到唾液腺、皮肤、角膜以及其他器官。 7．狂犬病病毒是如何与神经细胞相互作用的？ 狂犬病病毒与神经细胞的相互作用分四个阶段：①吸附：狂犬病病毒吸附于健康的神经细胞；②侵入：病毒被细胞吸入，进入细胞内；③复制：在细胞内，病毒迅速繁殖；④出芽：新的狂犬病病毒离开宿主细胞，吸附于其他神经细胞。然后，病毒从脑通过神经扩散到身体的其他器官。 8．狂犬病病毒的特性有哪些？ 狂犬病病毒是嗜神经性病毒，对神经组织有特殊亲和力。病毒不能穿透健康皮肤，主要通过损伤皮肤和粘膜入侵，少数由呼吸道吸入感染。病毒侵入后，沿传入神经到达中枢神经，侵害中枢神经细胞，然后再由中枢沿传出神经侵入各脏器组织，如唾液腺、眼、舌、皮肤、心脏等。因唾液腺最适狂犬病病毒繁殖，故唾液中含病毒最多，早在症状出现前14天即有病毒出现。因此唾液为主要传染源，既可通过舔咬感染人和畜，又可通过流涎污染环境，引起吸入性感染。 9．狂犬病的病原体是什么？ 狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。 10．曾经注射过狂犬疫苗的人又被犬咬伤还用再打针吗？ 全程接种符合效价标准的疫苗后1年内再次被动物致伤者，应于0和3天各接种一剂疫苗；在1-3年内再次被动物致伤，且已进行过上述处置者，应于0、3、7天各接种一剂疫苗；超过3年者应接种全程疫苗。此外，对暴露前后所用的疫苗效价无法证实者及免疫回忆应答无法确认者仍应进行全程免疫。
十一、伪狂犬病检测方法 伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。 2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。 2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。 伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’， 下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910244928.7 (22)申请日 2019.03.28 (71)申请人 中国科学院武汉物理与数学研究所 地址 430071 湖北省武汉市武昌区小洪山 西30号 (72)发明人 贾凡 徐富强 李莉 缪欢 吕培 施祥玮 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 35/76(2015.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环 路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种高亮表达红色荧光蛋白 的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备 方法和应用，包括（1）制备表达红色荧光蛋白的 重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用， 该平台成功制备高亮表达红色荧光蛋白的重组 伪狂犬病毒。本发明成功获得高亮表达红色荧光 蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在 神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制 病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动 物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方 面具有广泛的应用价值。 权利要求书1页 说明书5页序列表8页 附图2页CN 109943539 A 2019.06.28 C N 109943539 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109943539 A 1.一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤： 1)具备高亮表达红色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA； 2)构建高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA-right arm；将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。 2.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。 3.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。 4.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。 5.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。 6.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。 2
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。 1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？ 狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。 （一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。 （二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。 （三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治 核心提示：本文详细阐述猪伪狂犬病的临床表现、发病过程及诊断要点。 猪伪狂犬病病（PPV）是由疱疹病毒属的伪狂犬病毒引起的疾病。在猪群中该病毒能够通过妊娠从上一代传递到下一代的垂直传播，还能够通过猪只之间互相接吻以及蚊蝇叮咬而水平传播，属于乙型传播疫病。主要经呼吸道传播，病毒感染后首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，再经神经侵袭脑、脊髓的同时，也可由鼻腔粘膜经呼吸道侵入肺泡。这是临床初生仔猪无其他明显症状，但若发生抽搐后迅速死亡的主要原因。 一、临床表现 感染早期体重25kg以上的商品猪，病毒侵袭导致猪的肝脏的胆汁分泌机能亢进，突然增多的大量胆汁刺激十二指肠和幽门壶腹部，病猪表现胃肠痉挛和粪便发黑，阵发性腹痛，频频排粪，采食量下降；体温39-41℃。进入4-10天的感染中期，由于十二指肠和幽门壶腹的持续痉挛，幽门突红肿，溃疡，形成胆汁排泄障碍和向胃部的逆流；同时，由于持续增值的病毒对外周淋巴的侵袭引起的全身发热，水排泄的增强，继发胆汁粘稠，胆囊内壁充血、出血和胆囊壁增厚等炎症变化。与此同时，大量胆汁进入胃部，打破胃内容物的酸碱平衡，使pH值上升，直接引发病猪发生呕吐。pH值偏高的胃液长时间的浸润，一方面使得胃神经反射机能麻痹，呕吐很快停止，病猪出现采食量下降，这是饲养密度过大或观察不及时，个体发病后不易被发现的主要原因；另一方面，贴近胃壁的高pH值胃液直接损伤胃底粘膜，引起胃底充血、出血和穿孔、胃痛，形成病猪有食欲，但采食量下降或呈间断性采食（即添加饲料时猪反映明显，但采食数口后停顿下来，稍后继续采食，并再次发生采食停顿）、粪便发黑的现象。到了10-15天（部分单一性病例可达20天）的感染中后期，由于胃底损伤严重，病猪采食量下降至正常采食量的1/5-1/8，甚至
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/558173602.html, 伪狂犬病概述 作者：潘余乐 来源：《国外畜牧学·猪与禽》2015年第08期 伪狂犬病是一种急性、高致死性疾病，广泛分布在世界各地，主要感染猪和其他家畜，偶尔会感染野生动物。自20世纪60年代以来，伪狂犬病毒在美国已经成为一个重要的病原体，可能是因为在分娩猪舍的发病增加，或因为有毒力更强的毒株出现。猪以外动物的临床症状类似于狂犬病的症状，因此得名“疯痒”（但猪不表现出这种症状）。伪狂犬病是一种需向政府相关部门报告的疾病，并已成功地从美国绝大多数地区根除。 1 病因 伪狂犬病毒是一类DNA疱疹病毒。猪是该病毒的唯一宿主，但病毒可以感染牛、羊、猫、狗和山羊，以及野生动物，包括浣熊、负鼠、臭鼬和啮齿动物。在灵长类动物上进行的实验研究表明，恒河猴和狨猴易感染，但黑猩猩不易感染。人感染伪狂犬病毒的报告很有限，且基于血清转化而不是病毒分离得出的结果。马感染狂犬病毒的病例很罕见。目前伪狂犬病毒只有一个血清型，但使用单克隆抗体制备物、限制性内切酶测定法以及胰蛋白酶灭活标记法可以鉴别出毒株的差异。 2 流行病学 伪狂犬病毒可通过鼻-鼻或粪-口途径传播。间接传染一般通过吸入雾化的病毒后发生传播。传染性病毒可在相对湿度≥55 %的空气中存活长达7 h。来自英国的研究数据表明，在特定的气候条件下病毒可以通过气溶剂传播到2 km以外的地方。其他研究证明，该病毒可在无氯井水中生存长达7 h；在厌氧的湖泊水、青草、土壤、粪便和去皮的玉米中生存2 d，在塑料瓶中的鼻腔洗涤液和猪颗粒饲料中存活3 d，在稻草类垫料中存活 4 d。伪狂犬病毒外有包膜，因此干燥、阳光和高温[≥37 ℃（98.6 ℉）]可使其失活。濒死宿主，如狗、猫、野生动物，可以在农场之间传播病毒，但这些动物在感染后只能存活2 d～3 d。昆虫作为病毒传播载体的潜在作用正在调查中。鸟类在病毒的传播中似乎并无作用。 3 临床症状和发病机理 猪的临床症状取决于受感染猪的年龄。幼龄的猪高度易感，且日龄低于7 d的仔猪死亡会达到100 %。一般情况下，幼龄猪感染后中枢神经系统症状（例如颤动和摇晃）很容易出现。如果断奶仔猪受到感染，呼吸系统疾病是主要的临床症状，特别是并发感染致病性细菌后症状将复杂化。据报道，伪狂犬病毒能够抑制肺泡巨噬细胞的功能，因此病毒会降低这些细胞处理和破坏病毒的能力。全身性发热[41 ℃～42 ℃（105.8 ℉～107.6 ℉）]、厌食和体重减轻可见于各年龄段受感染的猪上。生长和肥育猪的死亡率非常低（1 %～2 %），但保育猪的死亡率 可能达到50 %。打喷嚏和呼吸困难很常见，偶尔有报道可见到中枢神经系统疾病。在非猪的
狂犬病题目及答案标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
狂犬病暴露处置技术培训试题 姓名：单位：分数： 一.填空题（每题4分，共20分） 1.狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2.狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____和____狂犬病的病原体. 3.人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。彻底冲洗后用涂擦伤口。 4.狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。二．单选题（每题5分，共50分） 1.关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A.狂犬病毒为弹状病毒科 B.狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D.在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(NegriBodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2.Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（）
A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3.狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D.A＋B＋C E.B＋C. 4.狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5.暴露前的免疫程序是（） A. 0、7、21 天各 1 剂的程序 B. 0、3、7、14 和28天各接种 1 剂 C. 0天两剂，7、21 天各1剂的程序 D.直接注射免疫球蛋白 6.狂犬病临床表现有：（） A.有怕水、怕光、怕声的“三怕”症状
猪伪狂犬病净化方案 （见农业部《伪狂犬病防治技术规范》） 我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。 一、材料准备 疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。 抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。 待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。 二、净化方案 1、调查阶段 如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考
虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段 使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪） 每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。 公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪 分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估 仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估 主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段
课程论文 题目：狂犬病毒ABLV编码核蛋白（N）的生物信息学分析 课程名称：生物信息学 姓名：秦鸽鸽 学号：Y132140504 学院：生命科学与工程学院 专业：基础兽医学
狂犬病毒ABLV编码核蛋白（N）的生物信息学分析 摘要：狂犬病病毒（rabies virus，ＲＶ）是引起中枢神经系统感染的急性人畜共患传染病。狂犬病病毒基因组是由单股负链、不分节段的RNA组成。基因组编码病毒的核蛋白（N）、磷酸化蛋白（NS）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和依赖RNA 的RNA 多聚酶（L）5 个主要结构蛋白。N蛋白是组成病毒粒子的主要核蛋白，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究。本文就核蛋白（N）的理化性质、蛋白质结构、系统进化关系等进行了预测和分析，预测结果表明核蛋白的一级结构稳定，为亲水性蛋白，有两个跨膜区，ABLV病毒与其它6个基因型的病毒亲缘关系较其他病毒近，但之间又有明显的距离。 关键字狂犬病毒；核蛋白；理化性质；蛋白质结构预测；系统进化分析狂犬病病毒在野生动物（狼、狐狸、鼬鼠、蝙蝠等）及家养动物（狗、猫、牛等）与人之间构成狂犬病的传播环节。人主要被病兽或带毒动物咬伤后感染。一旦受染，如不及时采取有效防治措施，可导致严重的中枢神经系统急性传染病，病死率高。 狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，ＲＶ）引起的中枢神经系统感染的急性人畜共患传染病。所有温血动物都可感染，狂犬病一旦发病，病死率几乎100％［1］，是人类病死率最高的急性传染病之一。该病流行于100 多个国家和地区, 中国的狂犬病发病率占世界第二位, 仅次于印度[2]。 狂犬病病毒基因组是由11 928 或11 932 个核苷酸组成的单股负链、不分节段的RNA，分子量约4.6×106。基因组从3′端至5′端的排列依次为N、NS、M、G、L 5 个结构基因，各基因的序列长度分别为1 421、991/804/805、1