2013—2014学年第一学期主备人：康志意审核人：高二生物学科组教务领导：编号：sw201503012
动物细胞与组织培养
班级：学习小组：姓名：小组评价：教师评价：
【学习目标】1、能说出动物细胞与组织培养的概念
2、详细叙述动物细胞与组织培养的过程
【学习重难点】动物细胞与组织培养的过程
【自主学习】认真阅读教材P53-P54的知识完成自主学习和自学效果检测内容
知识点一：动物细胞工程的概念
概念：
说出动物细胞工程的依据、技术手段、基础、应用。
知识点二：动物细胞与组织培养的概念
1、概念：
2、你认为选取怎样的材料适合培养？为什么？
3、请你概括出动物细胞与组织培养的条件。
4、从培养基的物理性质看，动物细胞培养使用的培养基属于什么？添加了哪些主要的成分？添加了哪些特殊的
成分？
知识点三：动物细胞与组织培养的过程
1、写出动物细胞培养过程
思考：①为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？怎样处理？
②动物细胞培养时的分裂方式是什么？会一直分裂下去吗？
2、写出动物组织培养的过程
思考：动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？为什么？
3、归纳出不同的动物组织或细胞的培养难易度
4、什么是原代培养和传代培养？
思考：原代培养的细胞有什么应用？为什么？
【合作探究】请你完成下列表格植物组织培养和动物细胞培养的比较
A．培养基不同 B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行
C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D．动物细胞能大量培养，而植物细胞不能2．下列有关细胞工程的叙述，不．正确的是( )
A．在细胞整体水平上定向改变遗传物质 B．在细胞器水平上定向改变遗传物质
C．在细胞器水平上定向改变细胞核的遗传物质 D．在细胞整体水平上获得细胞产品
3．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞( )
A．容易产生各种变异 B．具有更强的全能性 C．取材十分方便 D．分裂增殖的能力强4．下列是动物细胞培养的工具酶的是( )
A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．胰蛋白酶 D．果胶酶
5、用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是( )
A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基
C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性
6、.下列关于动物细胞培养的叙述正确的是( )
A．培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体
B．培养中的人B细胞能够无限地增殖
C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株
D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞
7．(2008年高考宁夏卷)回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面____________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是____________。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是__________。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现__________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成__________细胞，该种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是__________。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到__________期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在____________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中____________的活性降低，细胞____________的速率降低。
(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作__________进行攻击。
【课后反思】你还有什么疑问吗？请写下来或提交小组再进行讨论。
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
动物细胞 编辑 动物细胞立体结构图组成动物体的细胞称为动物细胞，植物细胞和动物细胞大体上相同，都有细胞核、细胞质和细胞膜。但是也有不同的地方：这就是植物细胞在细胞膜外面，有一层厚而坚硬的细胞壁，而动物细胞是没有细胞壁的；植物细胞中有扁球状的叶绿体．而动物细胞里没有这种结构，植物细胞中有囊状的液泡，而动物细胞里的液泡却不明显。 目录 1简介 2结构特征 3培养 4培养液的成分 5培养液的特点 6培养 7基本过程 8动植物组织培养区别 9动物细胞培养的应用 10相关词条 1简介 动物细胞立体结构图组成动物体的细胞称为动物细胞，人体或动物体的各种细胞虽然形态不同，基本结构却是一样的，都有细胞膜、细胞质和细胞核。 2结构特征
中心粒 核糖体 滑面内质网 高尔基小泡 高尔基体 微绒毛 核仁 细胞核 核被 粗面内质网 溶酶体 线粒体 质膜 滑面内质网 动物细胞有细胞核、细胞质和细胞膜，没有细胞壁，液泡不明显，含有溶酶体,动物细胞的结构有细胞膜、细胞质、细胞器、细胞核；它们的主要作用是控制细胞的进出、进行物质转换、生命活动的主要场所、控制细胞的生命活动。细胞内部有细胞器：细胞核，双层膜，包含有由DNA和蛋白质构成的染色体。内质网分为粗面的与滑面的，粗面内质网表面附有核糖体，参与蛋白质的合成和加工；光面内质网，表面没有核糖体，参与脂类合成。
3培养 细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在培养的过程中不再形成组织。 概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 4培养液的成分 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。 5培养液的特点 液体培养基、含动物血清。 6培养 .动物细胞培养液的成分：体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。 2.动物细胞培养液的特点：液体培养基、通常含动物血清。 3.动物细胞培养的条件： ①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。 ②营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）。 ③血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份) 。 ④温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）。 ⑤气体环境（95%的空气+5%CO 2的混合气体）。 其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定。
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005 Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology 文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07 动物细胞大规模培养技术研究进展 吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3 (1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院; 3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100) 摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景. 关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体 中图分类号:Q251文献标识码:A Research advance in large-scale culture of animal cells W U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3 (1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering, Northwest A&F University,Yangling712100,China) Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells. Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上. 在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化. 收稿日期:2005-04-18 基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目. 作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择 3 米力陈志南 33 (第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地西安710032 摘要目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。动物细胞 规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。当前被FDA 批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解C O 2浓度累积的控制等。关键词动物细胞大规模培养生产蛋白收稿日期:2003204210 3国家重大科技专项(2002AA2Z 3441 33通讯作者,电子信箱:chcerc2@https://www.doczj.com/doc/5615585861.html, 动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求 已远远超过目前全世界的生产能力[1] 。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜 的进展[2] 。目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动 化控制等[3] 。以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg 的超大规模需求量生产。 目前被美国FDA 批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。 以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。 1目前美国FDA 批准的产品与生产工艺 1996年1月至2002年12月美国获得成功批 准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种(美国FDA 网页http :ΠΠw w w.fda.g ov 。蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin ,免疫球蛋白肿瘤坏死因子(T NF 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta 等。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。按技术应用专利的分类,我
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
固定化动物细胞大规模培养技术研究进展 石 凯1 熊晓辉1 许建生 2 (1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008) 摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化 中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。 1 动物细胞的特点及生长特性 动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用 抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。 动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。 2 固定化培养方法 在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,培养细胞的目的不仅仅要求催化活 力,更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白,因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性,上述这些固定化方法会对动物细胞 产生毒性,另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷 KC.Biologicals (USA )公司开发了一种完全自 动化的细胞培养系统[2]。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm ,截面积是长方形,约为1mm 2,壁厚0.12mm ,可提供4.25m 2的生长表面积。这种结 构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又可用于培养贴壁依赖性细胞。 该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中,给分离纯化带来方便。而且细胞不用从培养基中分离,所以不必考虑梯度问题;当培养基高速循环时,可以保持相对恒定的营养物和氧浓度。增加套数即可实现放大。2.1.2 微载体 微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术,由Van Wezel [3]于1967年首创。这种培养技术是在生物反应器内加入培养 液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体),使细胞在微载体表面附着和生长,并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的 收稿日期 2001-12-07;修改稿日期 2002-03-05。 第一作者简介 石凯(1977—),男,硕士研究生。电话025-*******-3716。 ? 655? 2002年第21卷第8期 化 工 进 展 CHEMICAL INDUSTR Y AND EN GIN EERIN G PRO GRESS
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动植物细胞的大规模培养 动物细胞培养简介 所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增值过程。在此过程中，细胞不再形成组织。动物细胞培养是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种必不可少的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，既推动了生物学和医学的发展，又带来了巨大的社会效益和经济效益。目前, 动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。 动物细胞培养的环境 影响动物细胞培养的主要因素有温度、pH值、CO2 、DO、葡萄糖、乳酸、氨、甲基乙二醛、培养基成分等。一般情况下，人和哺乳动物细胞的最适温度为37℃，pH值在7.2-7.4之间，CO2 水平为4-10%, DO维持在20-50%，葡萄糖是细胞培养过程中的能量的主要来源，需要维持在一定水平。乳酸、氨、甲基乙二醛等是动物细胞培养中的主要限制因素。在实际应用中，降低甲基乙二醛的浓度是通过降低葡萄糖用量来实现的。 培养基 用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。 天然培养基的优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类很多，包括血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白等。其中血清是最常用的天然培养基。 合成培养基的优点是既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。然而合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。 培养方法 动物细胞的体外培养有两种类型：贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。 悬浮培养： 悬浮培养主要用于非贴壁依赖性细胞，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。对于小规模培养可采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养则可采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养对设备的要求也比较简单。 贴壁培养： 贴壁培养是动物培养的一种重要方法，是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和许多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。 优点： 1.细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液，容易更换培养液； 2.因细胞固定载体表面，不需过滤系统，容易采用灌注方式培养，从而达到提高细胞密度的目的； 3.当细胞壁贴于生长基质时，细胞将更有效的表达一种产品； 4.同一设备可培养多种细胞，并根据需要采用不同的培养液和细胞的比例； 缺点： 1.细胞繁殖贴壁后不易消化下来，培养的扩大比较困难； 2.培养设施占地面积大，设备投资大；
2013—2014学年第一学期主备人：康志意审核人：高二生物学科组教务领导：编号：sw201503012 动物细胞与组织培养 班级：学习小组：姓名：小组评价：教师评价： 【学习目标】1、能说出动物细胞与组织培养的概念 2、详细叙述动物细胞与组织培养的过程 【学习重难点】动物细胞与组织培养的过程 【自主学习】认真阅读教材P53-P54的知识完成自主学习和自学效果检测内容 知识点一：动物细胞工程的概念 概念： 说出动物细胞工程的依据、技术手段、基础、应用。 知识点二：动物细胞与组织培养的概念 1、概念： 2、你认为选取怎样的材料适合培养？为什么？ 3、请你概括出动物细胞与组织培养的条件。 4、从培养基的物理性质看，动物细胞培养使用的培养基属于什么？添加了哪些主要的成分？添加了哪些特殊的 成分？ 知识点三：动物细胞与组织培养的过程 1、写出动物细胞培养过程 思考：①为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？怎样处理？ ②动物细胞培养时的分裂方式是什么？会一直分裂下去吗？ 2、写出动物组织培养的过程 思考：动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？为什么？ 3、归纳出不同的动物组织或细胞的培养难易度 4、什么是原代培养和传代培养？ 思考：原代培养的细胞有什么应用？为什么？
【合作探究】请你完成下列表格植物组织培养和动物细胞培养的比较 A．培养基不同 B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D．动物细胞能大量培养，而植物细胞不能2．下列有关细胞工程的叙述，不．正确的是( ) A．在细胞整体水平上定向改变遗传物质 B．在细胞器水平上定向改变遗传物质 C．在细胞器水平上定向改变细胞核的遗传物质 D．在细胞整体水平上获得细胞产品 3．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞( ) A．容易产生各种变异 B．具有更强的全能性 C．取材十分方便 D．分裂增殖的能力强4．下列是动物细胞培养的工具酶的是( ) A．限制性核酸内切酶 B．DNA连接酶 C．胰蛋白酶 D．果胶酶 5、用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是( ) A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性 6、.下列关于动物细胞培养的叙述正确的是( ) A．培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养中的人B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 7．(2008年高考宁夏卷)回答下列有关动物细胞培养的问题： (1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面____________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是____________。要使贴壁细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是__________。 (2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现__________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成__________细胞，该种细胞的黏着性__________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量__________。 (3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是__________。 (4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到__________期的细胞用显微镜进行观察。 (5)在细胞培养过程中，通常在____________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中____________的活性降低，细胞____________的速率降低。 (6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作__________进行攻击。 【课后反思】你还有什么疑问吗？请写下来或提交小组再进行讨论。
动物细胞与组织培养---指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术 组织培养--细胞培养、组织培养和器官培养。 细胞培养的现实意义 生物技术上：生产各种生物技术产品 科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某疾病的治疗等 细胞培养技术的优点 1.研究的对象是活细胞:在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。 2. 研究条件可以人为控制 3. 研究的样本可以达到比较的均一 4. 研究内容便于观察、检测和记录 5.研究的范围比较广泛 6.研究的费用相对较经济 细胞培养的缺点 现在人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中, 时间久了，必然发生变化 体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一， 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化 培养细胞的分化 1．不适应 2．脱分化或去分化 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式: 2种类型 粘附型(贴壁型)细胞: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。大多数细胞 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 贴附生长型细胞在体内、外粘附方式存在差异
动物细胞工程教学设计 【学习目标】 1、理解动物细胞培养的过程及条件 2、了解动物细胞核移植技术的原理 3、理解动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 【课前知识点背诵】 一、动物细胞培养 1.流程： 2.条件： (1)无菌、无毒：对培养液和所有培养用具无菌处理，添加一定量的抗生素，定期更换培养液以清除代谢产物。 (2)营养：除有机物糖、氨基酸、促生长因子和无机营养无机盐、微量元素外，加动物血清。 (3)适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2-7.4。 (4)气体环境：含95% 的空气加5% CO2 的混合气体。CO2的作用是维持培养液的PH 3.应用：生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。 4.细胞遗传特性： ①10代以内：原代培养不变②10~50代：细胞株一般不变③50代后：细胞系改变 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物核移植概念 是将动物的一个体细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体。 2.过程 3.应用 ①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；②保护濒危物种；③生产医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植。 【课堂探究】 考点一：动物细胞培养 例1：实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。下列叙述错误的是( ) A．甲过程需要对实验小鼠进行消毒 B．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化 C．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型D．丁过程得到的细胞具有异质性 探究讨论一：
1.为什么选择动物胚胎或幼龄动物的器官或组织进行动物细胞培养？ 2.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？ 3.两次使用胰蛋白酶的作用分别是什么？ 4.多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中。你认为体外培养细胞时需要提供哪些物质和什么样的环境条件？ 5.培养动物细胞的培养基是液体培养基还是固体培养基？培养基中为什么要加入动物血清？ 6.植物组织培养和动物细胞培养的比较 变式训练1：下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养 实战演练1：（2014年浙江卷）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是 A.连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型 B.某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞 C.由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆 D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状 巩固训练：如图表示动物细胞培养程序图，请据图回答下列问题： (1)过程②表示________________。 (2)过程③和⑥用________处理组织或贴壁细胞分散成单个细胞，这样做的目的是______________。 (3)④和⑥的过程都要把分散的细胞制成_________________。 (4)过程⑤进行的细胞培养是________，细胞适于________生长增殖。
细胞生物学在生物制药方面的应用及实例 —————动物细胞培养技术 【摘要】现代生物制药产业中有着众多核心技术，其中哺乳动物细胞培养技术作为生物制药产业的下游通用性核心技术之一，发挥着重要作用。动物细胞培养开始于本世纪初，到1962 年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。 【关键词】生物制药动物细胞技术发展历史应用前景 动物细胞技术用于生物制药的历史 早期疫苗产业: 往往利用动物来生产疫苗，譬如用奶牛来生产天花疫苗。 天花是继瘟疫之后世界上传播最广、最可怕的疾病。1555年，墨西哥天花大流行，全国1500万人口中，死了200万人。16-18世纪，欧洲每年死于天花病的人数为50万，亚洲达80万人。有人估计，18世纪内有1.5亿人死于天花。 18世纪后期，一位英国乡村医生E. Jenner发现，一种挤奶女工容易得的、比较温和的疾病的人，对天花也有免疫力。在1798年发表自己的发现 . 到1975年，天花全世界范围内初步消灭了。 1920～1950，开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗等。 1950 ～ 1985期间，细胞工程及其他技术的进步，利用细胞培养技术，生产多种人用疫苗：预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等，并用于生产多种兽用疫苗。用类似的细胞培养技术还可生产酶、细胞因子、抗体等生物制品。而先决条件是能够获得可分泌目的蛋白的细胞系。但这在基因工程技术出现之前，细胞表达蛋白的水平很低，成本高。
大规模动物细胞培养 动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。 1.细胞培养环境 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。 乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换
动物细胞培养技术研究进展 （张云生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100） [摘要]:动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，可分为原代和传代培养，有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。 [关键词]:细胞培养；微载体；中空纤维；微囊；生物反应器 1885年，W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽； 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养(Animal cell culture)的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合(Cell fusion) 、细胞杂交(Cell hybridization)以及转基因(Transgene)技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分[1]。 1 基本概念[1, 2 ] 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养( Primary Culture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养( Subculture)。根据原代培物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系( Cell line)或细胞株(Cell Strain)。这些细胞一般可顺利传40～50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株；在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。 2 体外培养动物细胞的生物学特性 动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染；对生长环境和培养环境要求苛刻[3]。 2. 1 细胞生命周期性变化[1] 体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。 1. 潜伏期(Latent phase) 细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。 2. 指数生长期(Logarthmic growth phase)指数生长期是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛。在接种细胞数量适宜的情况下。指数生长期持续3～5 d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少,营养环境恶化，呈现接触抑制(Contact inhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑