Ⅰ生物化学基本实验技术
一、分光光度法
（一）原理
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400—760nm。短于400nm的光线称为紫外线（200—400nm为紫外光区），短于200nm 的叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长于760nm的光线称为红外线（760—500000nm为红外区），再长的就是无线电波了。
可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称为单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。
当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少。例如，可见光通过有色溶液后，或红外线通过多种气体后，部分光波被吸收。不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。
在可见光范围内，利用溶液的颜色深浅来测定溶液中物质含量的方法，称为比色法。采用适当的光源、棱镜和适当的光源接受器，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。这就是分光光度法。
分光光度法是生物化学中最有价值的测定方法之一。通过测定紫外、可见或红外的特征吸收光谱可以鉴定未知化合物；通过测量在某一波长的光吸收可以测定溶液中未知化合物的浓度。
分光光度法所依据的原理是Lambert和Beer定律。
1．Lambert定律一束单色光通过透明溶液时，一部分波长的光波被吸收，被吸收光波的量与溶液厚度有一定的比例关系。
即：
e-al (1)
I=I
为入射光强度
式中I
I为通过溶液后的光强度
l为溶液的厚度
e为自然对数的底2.718
a为溶液的吸光率
（1）式可改写为：
/I= al (2)
ln I
将（2）式换算成常用对数式，即：
/I = 0.4343.al
lg I
令 k=0.4343.a
则
/I = kl (3)
lg I
此处以k为吸光率。
2．Beer定律以溶液中溶质浓度变化代替溶液厚度的改变，光波的吸收与溶质浓度的改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液时，光波被溶液吸收一部分，
吸收多少与溶液中溶质浓度有一定比例关系。依据Lambert定律中同样的推导，可得出下式：
/I = kc (4)
lg I
式中c为溶液中溶质的浓度。
Lambert定律和Beer定律合并，即（3）和（4）式合并为（5）式：
则 A=kcl (6)
A=-lgT
式中A为吸光度（光密度、消光度），T为透光度。其中k为常数，又称为消光系数（extinction coefficient），表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。
（6）式为Lambert-Beer定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过透明溶液后，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液的厚度成正比。此式为分光光度法的基本计算式。
（二）计算
利用分光光度法对物质进行定量测定的方法，主要有以下三种：
1．利用标准管计算测定物含量（直接比较法）实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据（6）式计算，即
2．利用标准曲线换算（标准曲线法）先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，读取各管光密度。然后以各管光密度为纵轴，浓度为横轴，在坐标纸上作图得标准曲线。再以测定管光密度从标准曲线上查得测定物的浓度。
标准曲线的制作与测定管的测定，应在同一仪器上进行，在配制样品时，一般选择其浓度相当于标准曲线中部的浓度较好。
3．吸收系数法利用克分子消光系数ε求取测定物浓度。当溶液浓度c为1mol/L，
溶液厚度l为1cm时的消光系数既为克分子消光系数，以ε表示，此时ε与A相等。实际应用中测定物常以g/ml作浓度单位。ε值在λmax时，可在一定实验条件下测得或由手册药典中查出。
在已知ε的的情况下，可将样品在同样条件下测定其A值，再根据下式求得样品的浓度。
C = A/ε
（三）分光光度计的结构
分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似，一般都包括下列几个部件，如下图所示。
1．光源
一个良好的光源要求具备发光强度高，光亮，稳定，光谱范围较宽和使用寿命长等特点。分光光度计上常用的光源有钨灯和氢灯（或氘灯），前者适用于340-900nm范围的光源，后者适宜于200-360nm的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的供电需要由稳压电源供给。
2．单色器
单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，通过此色散系统可根据需要选择一定波长范围的单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的敏感性愈高，测量的结果愈可靠。
3．狭缝
狭缝是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要，分光光度计的缝隙大小是可调节的。
4．吸收池（或称比色杯、比色皿、比色池）
一般由玻璃或石英制成。
在可见光范围内测量时，选用光学玻璃吸收池；在紫外线范围内测量时必须用石英池。注意保护比色杯的质量是取得良好分析结果的重要条件之一，吸收池上的指纹、油污或壁上的一些沉积物，都会显著地影响其透光性，因此务必注意仔细操作和及时清洗并保持清洁。
5．检测系统
主要由受光器和测量器两部分组成，常用的受光器有光电池、真空光电管或光电倍增管等。它们可将接收到的光能转变为电能，并应用高灵敏度放大装置，将弱电流放大，提高敏感度。通过测量所产生的电能，由电流计显示出电流的大小，在仪表上可直接读得A值、T值。较高级的现代仪器，还常附有电子计算机及自动记录器，可自动描出吸收曲线。
（四）用于Lambert-Beer定律的名词和符号：
（王鲁华）
二、层析法
层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个为固定的，称固定相，另一个相则流过此固定相，称流动相，从而各组分以不同速度移动而达到分离。无论哪种层析均由固定相和流动相组成，固定相可以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体，同样流动相可以是液体也可以是气体。
层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有多种类型，根据所用两组分不同分为以下几类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；根据操作方式不同分为：柱层析、薄层层析和纸层析等。
（一）吸附层析
1.原理
利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。
2.吸附剂
吸附剂是具有较大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。常用的吸附剂有活性炭、硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等，硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降，常用于分离非极性的和极性不强的有机物，如甘油脂、磷脂、胆固醇等。
3.方式吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析与薄层层析两种。
（1）柱层析法：柱层析法是用一根玻璃管柱，下端铺垫棉花或玻璃棉，管内加吸附剂粉末，用一种溶剂润湿后，即成为吸附柱，如图1中的①。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，如图1中的②。假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸附在柱上端，形成色圈，如图1中的③。样品溶液全部溶入吸附柱中之后，接着就加入合适的溶剂洗脱，如图1中的④。A与B就随着溶剂的向下流动而移动。最后分离情况如图1中的⑤所示。在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附后的A粒子被溶解（解吸作用）随溶剂下移，但遇到新的吸附剂，又将A粒子吸附，随后，新溶剂又使A粒子溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力
图 1 二元混合物的柱层析示意图
与吸附力不完全相同，A与B移动的速率也不同，经一定时间，如此反复地溶解与吸附，而形成两个环带，每一环带是一种纯物质。如A与B有颜色可看到色层；如样品无色，可用其它方法使之显色，为进一步鉴定，可将吸附柱从管中顶出来，用刀将各色层切开，然后分别洗脱，现在多采用溶剂洗脱法，即连续加入溶剂，连续分段收集洗脱剂，直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。
（2）薄层层析法：薄层层析是利用玻璃板、塑料板、铝板、聚酰胺膜等作为固定相的载体，在板上涂上一薄层不溶性物质为固定相，再把样品涂铺在薄层的一端，然后用合适的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易；层析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；分离效率高。
薄板的制备：所用玻璃板表面必须光滑、清洁。
根据制薄板的方法不同薄板可以分为软板和硬板两种。软板即不加粘合剂，将吸附剂干粉直接均匀铺在玻板上；制作简单方便，但易被吹散。硬板即用粘合剂如水或其他液体，将吸附剂调成糊状再铺板，经干燥后才能使用；制备虽然较繁琐，但易于保存。具体制备方法如下：
①软板：选用一根直径约为1～1.2cm的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端缠几圈胶布，胶布的厚度按需要的薄层厚度而定。常用的厚度约为0.4～1mm左右。把干的吸附剂倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管时玻板移动，然后将玻璃管压
在玻板上，把吸附剂由一端推向另一端，即成薄板。要求：光滑、平整、厚度均匀。 ②硬板：将适当调好的吸附剂倒在两块3mm 玻板中间所夹的一块2mm 厚度的玻板上，然后用一块边缘光滑的玻片把吸附剂刮向一边，即成厚度一定的薄板。薄层层析的操作步骤是：点样、展开、显色。 （二）分配层析： 1.原理
利用混合物在两种或两种以上不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。 分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数（K ）。
分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。
载体在分配层析中只起负担固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，还有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。纸层析是最广泛应用的一种分配层析。
纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含20%—22%）是经常用的固定相，此类有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把欲分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此移动，这样就在两相间发生分配现象。由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成份，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度就快。物质在纸上移动的速度可以用R f 表示：
物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（R f 值）也恒定，因此，可以
根据R f 值来鉴定被分离的物质。
2.分类
纸层析法按操作方法分成两类，即：垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬起，使
）
（溶质在流动相中的浓度）
（溶质在固定相中的浓度Cm Cs K =
距离
溶剂前缘至原点中心的距离色斑中心至原点中心的=
f R
流动相向上或向下扩散；水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。垂直型使用较广，按分配物质的多寡，将滤纸截成长条，在某一端距边缘2~4cm处点样，待干后，将点样端边缘与溶液接触，在密盖的玻璃缸内进行展开
上述方法只用一种溶剂系统进行一次展开，称为单向层析。如果样品成分较多，而值相近，单向层析分离效果不佳，可用双向层析法，即在长方形或方形滤且彼此的R
f
纸的一角点样，卷成圆筒形，先用第一种溶剂系统展开，展开完毕吹干后旋转90o，再放于另一种溶剂系统中，向另一方向进行第二次展开，如此各成分分离较为清晰。
图 3 垂直型纸层析图 4 氨基酸双向纸层析色谱
（三）凝胶过滤层析（分子筛层析）
1.原理
当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。实际所制的胶粒不能绝对均一，每一型胶粒的孔径大小分布可以被控制在一定的范围，即最大极限和最小极限。而被分离的物质的分子量在许多情况下相差并不太大，渗入凝胶颗粒内部的程度则不相同。它们将以不同的速度按先后的顺序洗脱下来。
2.常用于凝胶层析的凝胶
层析用凝胶是一些具有立体网状结构的和一定网孔直径的天然或人工合成的高分子化合物。用来层析的凝胶应具有下列性质
①是惰性的，即对溶质没有物理的或化学的吸附，也不能和溶质发生化学反应，不能引起酶及蛋白质的变性。
②具有稳定的化学结构，实际上可以反复使用，达几月或几年，在实际条件下允许对pH及浓度的选择。
③所含离子基团尽可能少，避免离子交换效应，因带电可引起洗脱峰变为不对称
④具有一定的机械强度，不至因压力增加而使凝胶变形。
根据凝胶物质的来源可分为天然凝胶和人工合成凝胶两类：
（1）天然凝胶：主要是一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。淀粉凝胶应用较早，但因其理化性质不够稳定，洗脱时的阻力较大，洗脱时间长等缺点影响了它的应用。琼脂来源于一种海藻，是由D-半乳糖和L-半乳糖所组成的多聚糖，它能分离分子量较高的物质。其缺点是带有大量的电荷（主要是磺酸基，其次为羧基），层析时常需用较高离子强度的洗脱液，使洗脱物含有一定量盐分，而影响产品的纯度。琼脂糖凝胶（sepharose）应用较多，它又称生物凝胶Ａ（biogel—A），由琼脂糖溶液冷却后，通过分子间氢键，自发凝集成束，形成稳定的珠状凝胶，稳定性较差，工作pH值范围在4~9之间，40℃以上易老化，不能高压和冰冻，其机械强度取决于琼脂糖的含量。它有2B、4B、6B三个级别，含琼脂糖的浓度分别为2%、4%、6%。Sepharose结构开放，排阻极限比Sephadex大，分离范围广泛，适用于DNA大片段分离。
（2）人工合成的凝胶：常用的有葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
①葡聚糖凝胶又称交联葡聚糖凝胶，英文名称为Dextrak，商品名称为Sephadex，由许多右旋葡萄糖单位通过1,6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂1-氯-2,3-环氧丙
烷（CH
2-CH-CH
2
CL，又称氯醇）交联而形成多孔网状结构高分子化合物。这一产物是不
容于水的。在合成凝胶时，调节葡聚糖和交联剂的配比，可以获得具有不同大小网眼的葡聚糖凝胶。G表示交联度，G越大，网孔结构越紧密，吸水性差，膨胀也小，适用于分离小分子物质；G越小，网孔结构疏松，吸水量大，适用分离大分子物质。商品凝胶的型号采用“吸水量”的10倍数字表示，例如，每g凝胶吸水量为2.5g即定为G-25型。
各种型号葡聚糖凝胶的性质见下表。
由上表可见，Sephadex —G 值越大，吸水量越大，分离范围（分子量）越大。
②聚丙烯酰胺凝胶其商品名为生物凝胶P （Bio-Gel P ），是用丙稀酰胺（acrylamide ，简称Acr ）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N ，N ˊ—methylene bisacrylamide ，简称Bis ）在催化剂的作用下聚合而成。
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系：凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大至范围如表：
M r 范围与凝胶浓度的关系
聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性、透明、相对的化学稳定，对pH 和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝
胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。（四）离子交换层析
1.原理
离子交换层析法（ion exchange chromatography IEC）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。因此，在洗脱过程中，各种离子由固体柱上先、后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。这种离子交换是定量完成的，因此测定溶液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量，也可将吸附在交换剂上的样品的成分用另一洗脱液洗脱下来，进行定量测定。
离子交换层析主要用于蛋白质、多肽的分离。核酸也是强极性分子，用离子交换层析也能得到很好的分离效果。
2.离子交换剂
离子交换剂种类很多，根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂；根据惰性支持物不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶等种类。目前大多采用的离子交换剂是合成离子交换剂，即离子交换树脂，其分为两大类：分子中具有酸性基团，能交换阳离子的称为阳离子交换树脂；分子中具有碱性基团，能交换阴离子的称为阴离子交换树脂。按其解离性的大小，又可分为强弱两种：
磺酸基（－SO
H）
3
强酸性
阳离子交换树脂酚羟基（－OH）
弱酸性羧基（－COOH）
）
强碱性季胺基（－NR
4
阴离子交换树脂伯胺基（－NH
）
2
弱碱性仲胺基（－NHR）
叔胺基（－NR
2
）交换反应举例如下：
R-SO
3－H+ + M+X－R-SO
3
－M＋+ X－H+
R 4≡N＋OH－+ H＋X－ R
4
≡N＋X- + H＋OH-
目前常用的离子交换纤维素列于下表：
常用的离子交换纤维素
（五）亲和层析
1.原理
利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体； RNA和其互补的DNA等。
将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。
2.基本过程
（1）偶联：将欲分离的高分子物质X（如抗原）的配基L（如抗体）在不影响其生物功能的情况下与水不溶性的载体相结合（称为固相化或固定化），制成亲和吸咐剂或免疫吸附剂。
（2）装柱：在层析柱内装入固相化的配基—亲和吸附剂（称为亲和柱）。
（3）亲和吸附：含有高分子物质X的混合液（如粗匀浆提取液或血清等），在有利于配基和高分子之间形成复合物的条件下，进入亲和吸附剂的层析柱。混合液中只有能与配基形成复合物的高分子X被吸附，而所有不能形成复合物的杂质则直接流出。亲和柱进一步用缓冲液洗涤，以尽可能地除去非亲和吸附的物质。
（4）洗脱：改变洗脱条件，促使亲和吸附剂—高分子复合物解离而释放出高分子的物质X，便得到欲纯化的活性物质。
（5）再生：将欲分离、纯化的生物大分子从亲和吸附剂中洗脱的过程，就是再生的过程。再生后的亲和吸附剂可直接用于又一周期的纯化工作
（周晓慧）
三、电泳法
带电核的粒子在电场中的趋向运动称为电泳。自从1937年首创电泳技术后，随着电泳技术的不断进步，电泳的种类和应用在深度和广度两个方面均迅速发展，已经成为生物化学及分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。不同电泳技术的区别主要是电泳支持物的性质不同，电泳支持物不同的特性决定了它们在使用方面的不同。目前，常用的电泳方法有：薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳，以及由聚丙稀酰胺凝胶电泳衍生出来的各种不同的电泳方式。其中凝胶电泳由于操作简便、快速、灵敏等优点，使其成为分离、纯化和鉴定生物大分子的首选方法。在实验课中，我们将利用薄膜电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳分离血清蛋白；琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白和核酸。
（一）基本原理
设一带电粒子在电场中所受的力为F ，F 的大小决定于粒子所带电荷Q 和电场强度X ，即：
F=QX
而球形粒子运动时所受的阻力F ′与粒子运动的速度v 、粒子的半径r 、介质的粘度η的关系为：
F ′=6πr ηv 当F= F ′时，即达到动态平衡时： QX=6πr ηv 移项得
6v Q
X r v πη=
v
X
表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率（nobility ），也称为电泳速度，以u 表示，即
u =
6v Q X r v πη=
在电泳过程中，粒子移动的速度v 为单位时间t 内移动的距离d ，即：
v =d t
又电场强度X 为单位距离内的电势差E ，即
X = E/L 即
U = v
X
=
/
/
d t
E L
某物质在电场中移动的距离为
d = u Et L
两种物质在电场中移动的距离差为
△d = （d
A -d
B
）= （u
A
-u
B
）
Et
L
从式子中我们可以看出，两种物质只要迁移率不同即可分离开。
（二）几种影响电泳的因素
1．电泳介质的pH值：介质的pH值可以影响粒子的解离度，即决定粒子的带电量。为了保证电泳过程中溶液的pH值的稳定，必须采用缓冲溶液。当分离蛋白质混合物时，应该选择一个合适的pH值，使各种蛋白质的带电量差别较大，以利于彼此分开。
2．缓冲液的离子强度：离子强度决定缓冲溶液的缓冲容量，二者之间成正相关关系。过低则缓冲能力降低，过高则会降低蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。所以常用离子强度为0.02～0.2之间。离子强度的计算公式如下：
I = 1
2
CiZi2
I：离子强度 Ci：离子的克分子浓度 Zi：离子的价数 3．电场强度：与迁移率成正相关。
4．样品本身的性质：电量，大小和形状。
（王文勇）
四、离心分离法
一、原理
利用物质的沉降系数、质量、浮力等不同因素，应用强大的离心力使物质分离的方法称离心法。离心机所产生的离心力常用下列方程式表示：
F =
22
4v r
g
π
.（
1
60
）2
V（rpm）
式中F为离心力，单位为地心引力的倍数g（或×g）。g为重力加速度，等于980.6cm/秒2。r通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离（cm）。V为转速，即离心机每分钟的转数（rpm）。
另外，超速离心时，颗粒的沉降速度常用沉降系数表示。沉降系数使用Svedberg 单位（简称S，1S=1×10-13秒）。近代生物化学文献中经常出现沉降系数这一概念，用以描述生物高分子或亚细胞器的大小，如16SRNA、23SRNA、70S核蛋白体等。沉降系数是单位离心场强的沉降速度，与物质点的大小、形状、密度以及介质的密度和粘度等因素有关，当对某些生物大分子的化学结构、分子量还不了解时，可用沉降系数对它的物理特性进行初步描述，将它们区别开来。
二、离心机的分类：
1．根据离心速度分类（最常用的分类方法），可将离心机分为：
低速离心机：<5000 rpm；
高速离心机：6000—25000 rpm；
超速离心机：>25000 rpm。
注意：高速和超速离心机必须有低温装置。
2．根据要求不同可分为：
常温离心机
低温离心机
恒温离心机
3．根据分离目的不同可分为：
制备离心机
定性离心机
结晶离心机
4．根据离心条件不同分为：
常压离心机
真空离心机
5．根据离心机的形式不同分为：
角式离心机
水平式离心机。
三、离心机的应用：
1．分离多种物质。
2．分析亚细胞结构。
3．计算未知物质的分子量。
4．得到一些基本参数。
5．酶、疫苗、病毒等的制备。
四、离心机的使用方法及注意事项：
离心机属大型贵重仪器，使用前应了解其性能，掌握其操作规程，以防在离
心过程中发生意外，使用时应注意下面几点：
1．使用之前，应先检查离心机的放置是否水平与稳定，旋转是否平衡。
2．对称位置的离心管及套管必须用天平平衡，套管底部应用橡皮垫垫上。
3．接通电源，缓慢加速。
4．离心机转动时，如机身不稳，声音不均匀，或离心管破裂，应停止离心。
5．离心完毕，将转速开关缓慢退回起点，任其自停，切勿用手助停。
简言之要做到“平衡”：离心管及套管要在天平上平衡；“对称”：平衡后的离心管要对称放置；“慢加减速”：起动和停转时均应缓慢。
对于高速和超高速离心机的使用，须应严格按操作规程进行操作
（李素婷）
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中，常用来取用块状固体药品的仪器是（）。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后，在左盘衬纸上置氧化铜粉末，右盘衬纸上置1个5g砝码，游码标尺示数如下，此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为（）。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体，溶解后稀释到100.0 mL，所得NaOH溶液的浓度为（）。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）的摩尔质量为204.2 g/mol，用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时，如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右，每份应称取邻苯二甲酸氢钾（）g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%，下列测定结果哪个不符合标准要求？（）。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg，应选取（）的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液，常用的基准物质是（）。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是（）。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是（）。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3 10、下列物质中，可以用直接法配制标准溶液的是（）。 A. 固体NaOH B. 浓HCl C. 固体K2Cr2O7 D. 固体Na2S2O3
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
生物化学实验技能大赛活动方案 一、活动目的 通过举办生物化学实验技能大赛，使广大学生树立崇尚科学，勇于创新，开拓进取，敢于实践的精神风貌，增强专业素养。在深化教育改革，推进素质教育的要求下，不断提高学生实验设计及实验操作的能力，从而提高广大学生学习《生物化学》这门课程的兴趣，推动生物化学实践教学的改革；增加同学们的合作交流，促进相互间的学习与沟通，拓展知识的应用范围，培养创新意识及团队精神，提高综合实验设计、分析和生物化学实验操作技能，提高大学生动手能力和实践技能，促进我校良好学风的建设，营造浓厚的学习、学术氛围，特此举行此次生物化学实验技能大赛。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。 二、组织机构 主办单位：韶关学院教务处 承办单位：英东生命科学学院团委 三、参赛对象 韶关学院全日制在校学生均可参加，自行组队(可跨专业)，团队人数1至4人。 四、比赛流程： 1.初赛 各参赛队伍需上交报名表（附件1）并按照作品格式要求（附件2）独立完成实验设计，于2016年11月9日-11月20日将实验设计和报名表（放在同一文件夹压缩打包命名为：学院+实验课题+队长姓名+队长短号）发送至邮箱（）参加初赛，纸质版需上交到英东楼B309生科院辅导员办公室处。评委老师对实验设计进行评定后，筛选出约20支参赛队伍进入复赛。 2.复赛 2016年11月26日09:00—17:00为预实验阶段，实验室开放，各参赛队伍可在当天熟悉比赛场地或对所需材料、仪器、试剂等作实验前的预处理。 2016年11月27日09:00—17:00为正式复赛阶段，进入实验室按照实验设计进行操作，并当场完成实验报告，复赛分数根据实验过程及实验报告进行评定。 复赛评选出8支队伍进入决赛，决赛名单当场公布。 复赛地点：英东实验室 决赛 2016年12月3日19:00—22:30为决赛阶段，进行实验报告答辩，决赛分为四个环节：报告陈述、现场答辩、观众提问、专家点评。获奖的实验报告将在英东大厅展示15天。 决赛地点：图书馆学术报告厅 五、参赛要求 1.作品内容 （1）物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶；从果蔬中提取类胡萝卜素；从芦荟中提取碳水化合物；从鸡蛋清中提取某蛋白；从三七中提取三七皂等。 （2）物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假；检验市面上某几种食品是否含有防腐剂；检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 （3）物质含量测定类 如洗衣粉磷含量分析；测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标；比较几种饲料中某物质的含量等。
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
邻二氮菲法测定蔬菜中铁的含量 摘要 用邻二氮菲分光光度法直接测定蔬菜中的铁含量，方法简便、快速、准确，为指导人们合理食用蔬菜进行补铁及进一步开发蔬菜产品提供了可靠的理论依据[1 2]。 关键词蔬菜铁含量邻二氮菲 1.前言 铁作为必需的微量金属元素，对于人体的健康十分重要。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其它酶系统的主要组分，可协助氧的运输，还能促进脂肪的氧化。蔬菜是人们摄取微量铁的主要途径之一，缺铁可造成贫血并容易疲劳，而过多则会导致急性中毒。所以，蔬菜中铁含量的测定具有重要的营养学意义，可为指导人们合理食用蔬菜进行补铁以防治缺铁性贫血，提供可靠的理论依据。 2.实验目的 综合运用所学知识，用仪器分析法测定金属元素含量；练习灵活运用各种基本操作和查阅资料的能力。 3.实验原理 蔬菜中金属元素常与有机物结合成难溶或难于解离的物质，常采用有机物破坏法是被测的金属元素以氧化物或无机盐的形式残留下来，以便测定。本实验采用有机物破坏法（干法），即在高温下加入氧化剂，使有机物质分解。根据不同浓度的物质具有不同的吸光度，采用分光光度法来测定蔬菜中的铁含量。在pH值4～6的条件下，以盐酸羟胺将三价铁还原为二价铁，二价铁再与邻二氮菲（phen）生成桔红色络合物［3］，用分光光度计在510nm测定蔬菜中铁的含量。 盐酸羟胺还原三价铁的反应如下： 2 Fe3++2NH2OH·HCl→2 Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl- 邻二氮菲与二价铁的反应式如下： Fe2+ + 3(phen) =Fe(phen)3 4.实验器材 722型分光光度计（1台），电子天平（1台）蒸发皿（4个），100mL容量瓶(4个)，
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
生命科学学院 关于举办首届大学生生物化学实验技能竞赛的通知 一、竞赛目的 激励大学生自主学习，培养大学生创新意识和团队精神，增强综合实验设计能力，提高生化实验操作技能，营造浓厚学术创新氛围，促进良好学风的建设，选拔优秀项目和选手参加山东省第五届生物化学实验技能大赛。 二、竞赛组委会 组长：王宝山、魏成武 成员：戴美学、杨桂文、谭效忠、苗明升、张鸿雁、杜希华、王珂、原永洁三、参赛对象 生命科学学院在校本科生，不限年级和专业。参赛队伍2-3人为一队，每队一名指导教师。每个参赛队限提交一份实验设计书，每个指导教师指导的项目数一般不超过6项。 四、参赛作品内容及要求 （一）作品内容 1、物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶；从果蔬中提取类胡萝卜素；从芦荟中提取碳水化合物；从鸡蛋清中提取某蛋白；从三七中提取三七皂等。 2、物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假；检验市面上某几种食品是否含有防腐剂；检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 3、物质含量测定类
如洗衣粉磷含量的分析；测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标；比较几种饲料中某物质的含量等。 4、探索物质在某一方面的应用类 如探索蛋白酶对草菇保鲜的影响机理；探索木瓜蛋白酶在食物色氨酸测定上的应用等。 5、比较不同品牌物质的营养价值 如对不同品牌螺旋藻片营养成分测定和营养价值的评价测定；对不同品牌饲料中营养价值比较等。 6、其他参赛者感兴趣的方面 （二）作品要求 1、作品要求在保证安全性的前提下，具有一定的科学性、实用性、创造性，具有较强的实际意义，以创新及紧密联系生产生活实际为佳，同时在实验室内的可操作性强。 2、每组参赛队严格按照实验设计书设计格式要求撰写实验设计书，并提交至大赛邮箱，一经提交不得修改，违者则取消决赛资格。 3、参赛作品原则上不能与山东省大学生生物化学实验技能大赛前四届作品相同（前几届作品请参考大赛相关网站：http://202.194.131.160/G2S/ Template/View.aspx?action=view&courseType=0&courseId=282），亦不可抄袭外省比赛作品，否则取消参赛资格。 4、实验设计书设计的项目最好进行过预实验（可利用寒假在指导教师指导下利用实验室条件进行预实验），并在“生科院首届大学生生物化学实验技能竞赛报名表”中如实注明是否做过预实验。 5、实验设计内容应能在8小时内完成，便于决赛时在限定的时间内进行实验操作。
生物化学与分子生物学实验技术 实验安全与实验基本操作 2实验室安全规则 3实验室安全事故案例 ●1995年9月香港科技大学化学系大四学生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸 酐而不治身亡。 ●1997年香港科技大学物理系访问学者因未按规定使用通风橱造成他人肺部 伤害而永不被香港各大学录用。 4推行实验室安全规则的目的 1.为了达到研究所研究学习安全之目的。 2.为了满足人性安全感的基本需要。 3.为了人性的尊严─生命是无价的。 4.减少工作中产生灾害，确保全教职工和学生之安全及健康。 5. 保护大家共同的环境。 5安全事故原因分类分析 天灾 占2％ 凡不知、不顾、不理、不能、粗心、迟钝、疲劳、失检、情绪各种内在外在的行为 不安全行为 人为因素 占98% 工作场所中，工作环境、设备设施对人所产生之危险因素 不安全环境 6专业性实验室安全工作守则 ●化学药品的操作 ●放射性物质（另有专门培训） ●废料处理 ●紫外线的接触 ●化学药品溢泼的处理 7实验室常用化学试剂的使用安全 8二甲苯 ●无色液体，有芳香气味，易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低毒类， 对皮肤和黏膜有刺激作用，高浓度有麻醉作用。神经系统会受损害，还会使肾和肝受时性损伤。
●眼毒性：蒸气会刺激眼睛，液体导致严重刺激，发红肿胀和灼伤。通常影响 是暂时性的。皮肤毒性：产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢流水冲洗至少20分钟，用无摩擦性的肥皂从皮肤上洗去二甲苯。 ●易燃，有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫灭火 剂，不宜用水。 9三氯甲烷 ●无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。沸点：61.2℃，医药上用作麻醉 剂。也用作萃取剂和溶剂。 ●有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒 的光气。通常加入1—2%乙醇，使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。 ●吸入高浓度蒸汽时，开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，发生流泪、感觉麻醉、 呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事。 ●在空气、水分和光的作用下，酸度增加，因而对金属有强烈的腐蚀性 10乙醚 ●透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点：34.6℃；对人体有麻 醉性能。当吸入含量为3.5%时，30~40分钟就可失去知觉。 ●人体过量吸入，会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味，并出现呕吐、出汗、 喷嚏、咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。 ●微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶。 应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内，库温最好控制在25℃以下。远离热源、火种，避免阳光直射。 ●本品易燃。与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会 生成不稳定的过氧化物，受热能自行着火爆炸。着火时，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效，但可用水保持火场容器冷却。 11乙醇 ●无色有酒味，易挥发的澄清液体。沸点78.5℃：用于溶剂、清洗剂、分析 试剂等。属微毒类，对眼睛黏膜有轻微刺激作用。 ●乙醇可使皮肤发干，长期受大剂量作用时，可使神经系统、消化器官等发生 严重的器质性疾病。 ●易燃，手热或遇明火有燃烧爆炸危险，燃烧时，发出兰色火焰。蒸气能与空 气形成爆炸性混合物，在火场中，受热的容器有爆炸的危险。着火时，用二氧化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却火场中的容器，驱散蒸气，赶出溢出液体，使其稀释成为不燃性混合物
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
枣庄学院2016年大学生生物化学实验技能大赛 初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中，常用来取用块状固体药品的仪器是（）。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后，在左盘衬纸上置氧化铜粉末，右盘衬纸上置1个5g砝码，游码标尺示数如下，此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为（）。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体，溶解后稀释到100.0 mL，所得NaOH溶液的浓度为（）。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）的摩尔质量为204.2 g/mol，用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时，如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右，每份应称取邻苯二甲酸氢钾（）g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%，下列测定结果哪个不符合标准要求？（）。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg，应选取（）的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液，常用的基准物质是（）。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是（）。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是（）。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3
生化试验技术 绪论 1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段： (1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。 (2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。(3)材料处理及抽提方法的选择。 (4)分离纯化方法的摸索。(5)获得制备物以后，均一性的测定。 2 1 2 (1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。 (6)其他:如电子显微镜观察。 理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。 3 3．好的分析鉴定方法必须满足以下要求: 1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。5．材料的处理： 1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低； （2）未知物质：只要达到实验目的即可。 2）预处理：保证材料的纯净； 3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机 （2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点： 1）采用缓冲液。2）加入保护剂。3）抑制水解酶的破坏 4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。 第一章 1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法； 6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法； 7）生物学特性不同：如亲和层析法； 2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？ 蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验思考题
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生物化学实验考试试题
细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则
第五届生物化学实验技能大赛 实验报告 制备蝇蛹壳聚糖工艺改良 及其理化性质研究 Improved Technology of Extract Chitosan from the Pupa and Study the Physical Chemistry Character
制备蝇蛹壳聚糖工艺改良及其理化性质研究 郭诗静，金昂丹，梁剑云 华南农业大学 生命科学学院 （注：按姓名字母排序，不分先后） 摘要：利用蝇蛹作为实验原料,通过改良后的酸法脱灰分,碱法脱蛋白质和脂肪制成甲壳 素后,通过热浓碱法脱乙酰基处理提取壳聚糖。改良的工艺缩短了加工的时间，但是也保证了质量。提取过程中分别使用室温、加热、超声波三种不同的方法脱蛋白,脱色方法也一改以往用有机溶剂的方法，改用双氧水；干燥恒重法测定其水分,旋转黏度计测定其黏度,通过对成品进行这些理化性质的检测。实验得沸水的处理效果最好,超声细胞粉碎机对提取有一定点作用,双氧水的脱色效果不错,可以进行进一步研究和推广。 关键词：蝇蛹 甲壳素 壳聚糖 水分 黏度 脱乙酰度
目录 1 前言 (04) 1.1 甲壳素与壳聚糖及其研究状况 (04) 1.2 家蝇与提取工艺 (05) 1.3 超声波 (05) 2 可行性分析 (06) 3 实验目的 (06) 4 实验原理 (06) 5 实验设备 (07) 5.1 仪器 (07) 5.2 玻璃器具 (07) 6 实验材料及试剂 (07) 6.1 原材料 (07) 6.2 试剂 (08) 6.3 试剂的配制 (08) 6.4 材料的处理 (08) 7 本实验的制作流程 (11) 8 制作工艺比较 (15) 9 各种理化性质方法比较 (15) 9.1 用干燥恒重法测定其水分 (15) 9.2 用旋转黏度计测定其黏度 (16) 9.3 用酸碱滴定法测定游离氨基和脱乙酰度 (17) 10 结论 (18) 11 注意事项 (18) 12 优点 (18) 参考文献 (19) 英文摘要 (20) 附录 (21) 感想 (22)
第二章生化实验基本技术 第一节离心分离技术 离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g，即重力加速度(980.6cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速：()r 89445 =。 ? V／ g 离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动，从而产生一个强大的辐射向外的离心力场，它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度，使之受到一个外向的离心力，其定义为： F = mω2r 式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；ω为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的
临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法（理论依据） 二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。 三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度（V o ）等等。测酶初速度（V o ）只能用分光光度法。 因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点： 1 精确测定反应的动态过程； 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率； 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类