Western-Blot操作流程
试剂配制
1.RIPA裂解液：
10mM Tris（，）
1%NP40
%TritonX-100
%脱氧胆酸钠
2 mM EDTA
1 mM PMSF
20%甘油
调pH值至。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：
1.L Tris·HCl （）
Tris 12.114g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
2.L Tris·HCl（）
Tris 18.671g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
3.10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水
30%丙烯酰胺 5ml
1.5M Tris-HCl（）
10%SDS 150μl
10%AP 150μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
依次加入去离子水
30%丙烯酰胺 1ml
1M Tris-HCl（）
10%SDS 60μl
10%AP 60μl
TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7．5X电泳液缓冲液
Tris（） 15.1g
甘氨酸（） 94g
SDS 5.00g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。
8．10X转膜缓冲液
甘氨酸（）
Tris（） 30.3g
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）9．10XTBS缓冲液
Tris（） 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至 1000ml
（浓盐酸调pH至），溶解后室温保存。
10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏水 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。
步骤：
SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配12％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在7ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加
一层异丙醇醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。
3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去异丙醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。
4、等待胶凝期间可计算含10-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）
取出上样样品至EP管中，加入5×上样缓冲液至终浓度均为1×。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。
5、按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插
入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样
Marker 7μl
样本根据自己的样品决定
实验所用Thermo 26619# Marker电泳后出现9条带：10，15，25，35，55，70，100，130，250KDa（具体条带数目会因为胶的浓度不同而不同），最少4条带（6%的分离胶时出现70，100，130，250KDa）。
（3）电泳：开始恒压，电压80V，电泳跑到分离胶以后可调节电压到120V
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。
电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
（四）转膜
（1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜现在甲醇中浸泡激活，后和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-PVDF膜-2张滤纸-海绵（顺序一定注意）
将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。
（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，故放冰来降温。一般用恒流400mA转膜。
实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。转膜后，膜要分正反面，转膜时靠胶的一面为正面。
转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。如果做磷酸化抗体等，需要用血清封闭，具体情况可参考抗体说明书。
（五）免疫反应
（1）封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1-2h。
（2）一抗
. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度；加入抗体， 4度过夜，次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。（3）二抗
同上方法准备二抗稀释液，室温下孵育1-2h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量等体积混合；
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将膜正面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）
（2）将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；
在红灯下
取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X－光片放在膜上，一旦放上，便不
能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不
同时间多次压片，以达最佳效果；
曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；
显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，
从而节约定影液）。定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；
031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y H SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法 1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 36.33g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 24.22g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。 Tris-base 24.22g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml， 4℃保存 10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS 配置量：200ml 配制方法： 1.称取2g SDS。 2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。 注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。 30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide 配制量：200ml 配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。 丙烯酰胺58g N-N亚甲基双丙烯酰胺2g 2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去 杂质。 4.于棕色瓶中4℃保存。 常用试剂的配制 1．无Ca2+、Mg2+Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO 3 0.175g Na 2HPO 4 ·12H 2 O 0.076g KH 2PO 4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中, 最后补加双蒸水至500ml, 以5.6%NaHCO 3调整 pH 值至7.4，4℃冰箱保存备用。 2．甲基红试剂 （1）成份 甲基红 0.1g 蒸馏水 200ml 95％乙醇 300ml （2）用途：测定甲基红反应。 3．Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO 4·7H 2 O 2g MgCl 2·6H 2 O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl 2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 原液乙： Na 2NPO 4 ·12H 2 O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 使用时甲,乙原液按下列比例配成Hanks 液使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，8磅20min灭菌，放4℃冰箱保存，使用前用NaHCO 3 调整PH值。 4．0.4%酚红溶液 称取0.4g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.lmol/LNaOH并不断研磨，直到所有的颗粒 几乎完全解，加入0.lmol/LNaOHl0ml，然后倒入容量瓶中，并加蒸馏水至l00ml,棕色瓶保存备用。 5．pH7.2 Tris-NH 4 CI溶液(红细胞崩解液） Tris (三羟甲基氨基甲烷) 1.03g NH 4 Cl（氯化氨) 3.735g 加双蒸水至500ml，用浓HCl调pH=7.2，10磅15min灭菌后放4℃保存。 6．0.05moI/L pH8.6 巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 加蒸馏水 200ml 加热溶解 巴比妥纳 10.3g 叠氮纳 0.2g 加蒸馏水溶解 , 并补加到 1000ml 。 7．磷酸盐缓冲液(PB) A 液：为 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液 ,NaH 2PO 4 ·H 2 O 27.6g, 溶于蒸馏水中, 最 后补加蒸馏水至 1000ml 。 B 液：为 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液 ,Na 2HPO 4 .7H 2 O 3.6g（或 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g, 或Na 2HPO 4 · 2H 2 O 35.6g ）, 加蒸馏水溶解，最后加水至 1000ml。若再加 蒸馏水至200ml则成为0.1mol/LPB。 8．0.1mol/LPH8.4 硼酸缓冲液（BBS） 硼酸钠（Na 2B 4 O 7 .10H 2 O） 0.46g 硼酸（H 2BO 3 ） 0.51g 加蒸馏水至100ml 溶解。9．PH7.4 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法一： 0.2mol/L Na 2HPO 4 （ Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g加蒸馏水至1000ml） 0.2mol/L NaH 2PO 4 （NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 35.6g加蒸馏水至1000ml） 取0.2mol/L Na 2HPO 4 81.0ml 加0.2mol/L NaH 2 PO 4 19ml,再加1900mlH 2 O和 17gNaCl即为PH7.4 0.01mol/L PBS。 PH7.4 0.01mol/L PBS再加入0.05%Tween-20即为ELISA试验的洗涤液。 配制方法二： 甲液（0.1mol/LKH 2PO 4 溶液）：KH 2 PO 4 13.608g，加蒸馏水至1000ml。 乙液（0.1mol/L Na 2HPO 4 溶液）：Na 2 HPO 4 35.814g，加蒸馏水至1000ml。 取甲液19ml，乙液81ml NaCl8.5g、Tween-20 0.5ml混合后加蒸馏水至1000ml即可。 透析液配置操作常规及流程 一、配制室 1．浓缩液配制室应位于透析室清洁区内相对独立区域，周围无污染原，保持环境清洁， 每班用紫外线消毒1 次。 2．浓缩液配制桶须标明容量刻度，应保持配制桶和容器清洁，定期消毒。 3．浓缩液配制桶及容器的清洁与消毒。 （1）浓缩液配制桶：每日用透析用水清洗 1 次；每周至少用消毒剂进行消毒1 次， 并用测试纸确认无残留消毒液。配制桶消毒时，须在桶外悬挂“消毒中”警示牌。 （2）浓缩液配制桶滤芯：每周至少更换 1 次。 （3）容器：应符合中华人民共和国药典、国家/ 行业标准中对药用塑料容器的规定。 用透析用水将容器内外冲洗干净，并在容器上标明更换日期，每周至少更换1 次或消毒1 次。 二、成分及浓度 透析液成分与人体内环境成分相似，主要有钠、钾、钙和镁四种阳离子，氯和碳酸 氢根两种阴离子，部分透析液含有葡萄糖，具体成分及浓度见表 碳酸氢盐透析液成分及浓度 成分浓度(mmol/L) 钠135 ～145 钾0 ～4 钙 1.25 ～1.75 镁0.5 ～0.75 氯100 ～115 醋酸根 2 ～ 4 碳酸氢根30 ～40 葡萄糖0 ～11 二氧化碳分压(mmHg) 40 ～110 pH 7.1 ～7.3 1．钠常用透析液钠离子浓度为135 ～145 mmol/L，少数特殊病情（如低钠血 症、高钠血症等）患者用低钠（钠离子浓度低于130 mmol/L）或高钠（钠离子浓度高于 145 mmol/L）透析液。 2．钾透析液钾离子浓度为0 ～ 4 mmol/L，常用钾浓度为 2 mmol/L，临床应依 据患者血钾浓度适当调整 3．钙终末期肾衰竭患者有低钙血症倾向。常用透析液钙离子浓度一般为1.5 mmol/ L；当患者患高钙血症时，透析液钙离子浓度调至1.25 mmol/L；当患者患低钙血症时， 透析液钙离子浓度调至1.75 mmol/L。 4．镁透析液镁浓度一般为0.5 ～0.75 mmol/L。 5．氯透析液浓度与细胞外液氯离子浓度相似，一般为100 ～115 mmol/L。 6．葡萄糖分含糖透析液（5.5 ～11 mmol/L）和无糖透析液两种。7．透析液碳酸氢盐透析液碳酸氢盐浓度为30 ～40 mmol/L。8．醋酸根浓缩液中常加入2 ～4 mmol/L 醋酸，调整透析液pH 值和防止CO2 跑掉。 三、配制 （一）制剂要求 1．透析液应由浓缩液（或干粉）加符合质控要求的透析用水配制。2．购买的浓缩液或干粉，应具有国家相关部门颁发的注册证、生产许可证或经营许 可证、卫生许可证。 3．医疗机构制剂室生产血液透析浓缩液应取得“医疗器械生产企业许可证”后按国 家相关部门制定的标准生产。 （二）人员要求 Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量） 目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- Western blot 常用试剂配制 1.5 mol/L Tris (PH8.8) 1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．用浓盐酸调节pH值至8.8。 4．定容至1L. 5．高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。（参照kara公司Catalog-N1） 1 mol/L Tris (PH6.8) 1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。 pH值浓HCl 6.8 7.4 约70 ml 7.6 约60 ml 8.0 约42 ml 4．定容至1L. 5．高压灭菌后，室温保存。 注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。 （参照kara公司Catalog-N1） 30％丙稀酰胺（100ml） 1．称量下列试剂置于烧杯中。 丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g 双丙烯酰胺(BIS) 1 g 2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。 3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。 5．于棕色瓶中4 oC保存。 注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。 （参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924） 30％SDS 1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。 2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。 Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8 ●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。 Western Blot蛋白测定步骤 三蒸水制备后需要高压消毒 一、组织的采集 （一）器材和试剂准备： 镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮 （二）步骤（以心脏为例）: 1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号 2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中 3、组织于-80摄氏度冻存 二、组织蛋白的提取： （一）器材和试剂准备： 4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水 （二）步骤 1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻 2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管 3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。每管研磨的转速和时间保持一致。当出现大量泡沫时即可停止 4、静置于冰盒30分钟 5、12000rpm，4摄氏度，30分钟 6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。前者用于测试，后者备用。-80摄氏度冻存。 注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存 实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30 注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃； Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris〃HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris〃HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 透析液配置室制度 1.购买的浓缩液或者干粉，需由国家相关部门颁发的注册证， 生产许可证或经营许可证，卫生许可证。 2.透析液必须用浓缩液或者干粉加符合标准的透析用水配制。 3.医疗机构制剂室应取得“医疗器械生产企业许可证”后按国 家相关部门制定的标准生产血液透析浓缩液，且只能限本医院内部使用。 4.透析室用干粉配置浓缩液（A,B液），应由经过培训的护士和 技术员操作，并做好配置记录和专人核实登记。 5.透析液配置应在清洁区内相对独立区域设置，周围无污染源， 干燥通风，室内整洁，每班对环境清洁消毒一次。 6.浓缩液配置桶须标明容量刻度，应保持配置桶和容器清洁， 每日用透析用水清洗一次，每周消毒一次，并有记录。 7.每周至少更换或消毒一次容器，消毒后备用容器应干燥保存。 8.透析液成分及浓度测定每月一次，检查记录。 9.浓缩B液配制应在配制后24小时内使用，B桶外标明配制时 间，当天未用完的B液应废弃。A液应在配制后一周内使用。 10.浓缩液配制桶滤芯，每周至少更换一次。 11.每月一次透析液细菌培养一次，要求细菌数＜200CFU/ml,透 析液内毒素至少3个月检测一次，内毒素＜2EU/ml.透析液的细菌内毒素每台透析机至少每年检测一次，登记并保留检验结果。 透析液配置流程 多人份的配制： 1.按照需要配液量，先注入所需的配液量的透析用水，水37°C 2.开启电源开关，开始搅拌，同时加入核对好数量的A或B透 析粉（A干粉15袋，B干粉15袋）并计时。 3.当液体搅拌清澈时，关闭电源开关。 4打开阀门开关，分装透析液至每个容器内。 5分装后立即用透析用水冲洗桶内。 单人份的配制： 取量杯一只，用透析用水将容器内外以及量杯冲洗干净，按成品干粉说明要求，将所需的干粉倒入容器内，加入所需透析用水的量，加盖后左右上下摇动容器，至干粉完全融化即可。 Western blot常用试剂配方 1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml） 丙烯酰胺29 g 双丙烯酰胺1g 加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。 2. 10% SDS：（10ml） 电泳级SDS 1 g 蒸馏水9 ml 初始PH约为，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至，定容至10ml。（四甲基乙二胺）（成品） 4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH ）：50ml Tris-base 9.085 g 蒸馏水45 ml 加浓盐酸（约）调PH至后定容至50ml，4℃保存。 5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH ）：50ml Tris-base 6.055 g 蒸馏水44 ml 加浓盐酸调PH至后定容至50ml，4℃保存。 6. 10%过硫酸铵（10% AP）：新鲜配制 称取0.05g AP于EP管中，储存于-20℃，用时溶于蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50ml upper buffer ml 甘油（丙三醇）ml 25ml SDS g 5g DTT 0.0385 g 溴酚蓝 加蒸馏水溶解后定容至1ml。取加蒸馏水配成工作液。8. 5 × running buffer：（1000ml） Tris-base 15.1 g 甘氨酸（Glycine）94 g SDS 5 g 加蒸馏水溶解后定容至1000ml。用时加4000 ml蒸馏水。 9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用） 甲醇30 ml 冰乙酸10 ml 蒸馏水60 ml 考马斯亮-250 0.05 g 10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配 乙酸（10%）50ml 甲醇（30%）150ml 加蒸馏水定容至500ml。 11. Transbuffer（PH ）：100ml 现用现配 Tris-base 0.3028 g 甘氨酸 1.4872 g 甲醇20 ml 加蒸馏水定容至100ml。 12. 10 x 丽春红染液（储存液）：（可重复利用） （用时用蒸馏水稀释为1 X 的）染色后用纯水脱色 透析液测定操作流程 1、打开仪器电源，预热30分钟，使仪器处于稳定状态（37℃）； 2、填写表头： “测定日期”默认为同电脑的系统时间相同 “数据文件名”与“测定日期”相同，可以改动； “检验员”填写操作者姓名； “试剂批号”与试剂盒上的批号一致；（必填） “试剂灵敏度”的填写为0.01EU/ml；（必填） 3、填写标本名称、稀释倍数（如果标本名称一样，一定要区分开（如透析液1、透析液2），否则软件会自动计算2个标本结果的平均值）。 4、确认试验方法为动态浊度法，然后点击“采集”（如图） 5、进行标本操作： （1）、样品预处理：原水，RO水，透析液不用预处理，可直接进行检测； A原液，B原液须用内毒素检测用水或处理液稀释40倍后进行检测 （2）、样品的检测：取样品0.2ml加入反应主试剂A中，待干粉完全溶解后完全转移至平底试管进行检测 6、试验结束，返回主界面，进入数据分析： 7、调入实验数据： 8、查看试验结果： 结果判断： （1）、《中华人民共和国医药行业标准》YY 0572-2005《血液透析和相关治疗用水》（ISO 13959：2002,MOD）用水标准 在水处理装置的输出端的细菌内毒素的含量≤1EU/ml；血液透析装置入口的输送点上细菌内毒素的含量≤5EU/ml； （2）、《中华人民共和国医药行业标准》YY 0598-2006《血液透析和相关治疗用浓缩物》（ISO 13958：2002,MOD）标准 浓缩物以细菌内毒素检查用水配成透析液后细菌内毒素的含量<0.5EU/ml； （3）、我国《血液透析器复用操作规范》透析复用用水标准 血液透析器透析复用用水内毒素含量≤2EU/ml； （4）、血液净化标准操作规程（2010 版） 透析用水的内毒素＜2 EU/ml；置换液内毒素＜0.03EU/ml； 9、打印试验结果： 点击功能键“打印”选择分组格式，即可打印。 https://www.doczj.com/doc/5f3242340.html, 常用试剂配制及显色方法 （一）通用显色剂 1．重铬酸钾——硫酸 一般有机物均能显色，不同化合物显示不同颜色。 喷洒剂：5克重铬酸钾溶于100ml，40%硫酸中。喷洒后加热至150o C斑点出现。2．碘：检查一般有机物 （1）碘蒸汽：在一个密闭玻璃皿先放入碘片，使缸内空气被碘蒸气饱和将薄层或纸层放入缸内数分钟即显色，有时在缸内放一盛水的小杯，增加缸内的湿度，可提高 显色的灵敏度。 （2）0.5%碘的氯仿溶液，取出挥发散过量的碘再喷1%淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。3．碘——碘化钾溶液：很我有机物虽黄色（配法见后）。 4．5%——磷钼酸乙醇溶液：喷后120o C烤，还原性物质显兰色，再用氨气熏，则背景变为无色。 5．20%磷酸乙醇溶液：喷后120o C，还原性物质显兰色。 6．碱性高锰酸钾试剂：还原性物质在淡红背景上显黄色。溶液I:1%高锰酸钾溶液。 溶液II：5%碳酸钠溶液。 溶液I和溶液II等量混合使用。 7．中性0.05%高锰酸钾溶液：易还原性物质在淡红背景上显黄色。 8．硝酸银——氢氧化铵（Tollen’s--zoffaronl）试剂，喷后105o C烤5~10分钟，还原性物质显黑色。 溶液I：0.1N硝酸银溶液。溶液II：氢氧化铵溶液。 临用前溶液I和溶液II以1：5混合。注意：放久则形成爆炸性的叠氦化银。 9．硝酸银——高锰酸钾试剂：还原性物质在兰绿色背景上立即显黄色。 溶液I：0.1N硝酸银溶液：2N氢氧化铵溶液：2N氢氧化钠（1：1：2）。临用前配制。 溶液II：高锰酸钾0.5g，碳酸钠1g，加水成100ml溶液,临用前溶液I和溶液II等量混合。 10．四唑试剂：还原性物质，在室温或微加热时显紫色。 溶液I：0.5%四唑兰甲醇溶液。溶液II：6N氢氧化钠溶液。临用前溶液I和溶液II等量混合。 11．铁氰化钾：三氯化铁试剂：还原性物质显兰色，再喷射2N/L盐酸溶液，则兰色加深。 溶液I：1%铁氰化钾溶液。溶液II：2%三氯化铁溶液。临用前溶液I和溶液II 操作流程 1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。 4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。 5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表： 凝胶浓度Buffer GM使用量 1.0％3个凝胶体积量 1.0％～1.5％4个凝胶体积量 1.5％～ 2.0％5个凝胶体积量 6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。 7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。 11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 氨苄青霉素 ﹡组分浓度 100mg/ml 氨苄青霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 5g Ampicillin置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。卡那霉素 (可配 25mL ﹡组分浓度 50mg/ml卡那霉素 ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 2.5g 卡那霉素置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。RNase A ﹡组分浓度 10mg/ml RNase A ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.取 0.5g RNase A置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3. 100℃煮沸 15min, 缓慢冷却至室温,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。IPTG ﹡组分浓度 24mg/ml IPTG ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1.2g IPTG置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40ml 灭菌水,充分混合溶解之后定容 50ml 。 3.用0.22μm 滤膜过滤除菌,小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 X-Gal ﹡组分浓度 20mg/ml X-Gal ﹡配制量 50ml ﹡配制方法 1.称取 1g X-Gal置于 50ml 塑料离心管中。 2.加入 40mlDMF (二甲基甲酰胺 ,充分混合溶解之后定容至 50ml 。 3.小份分装(1ml/管后,置于-20℃保存。 DTT ﹡组分浓度 1M DTT ﹡配制量 10ml Western Blot 实验详解 、实验材料 Western Blot 相关试剂： 甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。4 C 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水 37 C 溶解，定容至100ml 。4C 避光保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。分装，-20C 保存。 Western BIot 相关仪器： 电泳仪；转移仪；摇转仪。 二、实验原理 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该 技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 文档收集自网络，仅用于个人学习 2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH8.8，定容至1L 室温 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH7.5，定容至1L 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ， 水定容至1L 。工作液：1 X TS 室温保存。文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水， 调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入 pH7.5 ，定容至 1L 室温保 去离子 室温保 68 C 加热溶解。用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43gWestern blot试剂配方
常用试剂的配制.
透析液配制操作常规及质量控制教学提纲
western blot实验步骤
Takara RT-PCR Kit
Western blot 常用试剂配制
Takara说明书
western blot 相关试剂及步骤
实验室常用生化试剂配方
Western_blot_试剂配制及操作流程
透析液配制室制度流程
常用westernblot试剂配方
透析液检测操作流程
常用试剂配制及显色方法
takara 胶回收试剂盒说明书
分子实验常用试剂配制(精)
WesternBlot实验详解(--)
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