Portions of this general chapter have been harmonized with the corresponding texts of the European Pharmacopoeia and/or the Japanese Pharmacopoeia. Those portions that are not harmonized are marked with symbols () to specify this fact.
这一章节已经和欧洲药典（EP）与日本药典（JP）统一。没有统一的部分已经用标记出来。
The Bacterial Endotoxins Test (BET) is a test to detect or quantify endotoxins from Gram-negative bacteria using amoebocyte lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus).
细菌内毒素检查法（BET）是通过鲎的阿米巴细胞溶解产物来检测或定量来自革兰氏阴性菌的内毒素。
There are three techniques for this test: the gel-clot technique, which is based on gel formation; the turbidimetric technique, based on the development of turbidity after cleavage of an endogenous substrate; and the chromogenic technique, based on the development of color after cleavage of a synthetic peptide-chromogen complex. Proceed by any of the three techniques for the test. In the event of doubt or dispute, the final decision is made based upon the gel-clot technique unless otherwise indicated in the monograph for the product being tested. The test is carried out in a manner that avoids endotoxin contamination.
细菌内毒素检查法有3种：凝胶法，基于凝胶的形成；浊度法，
BACTERIAL ENDOTOXINS TEST USP32
Portions of this general chapter have been harmonized with the corresponding texts of the European Pharmacopeia and/or the Japanese Pharmacopeia. Those portions that are not harmonized are marked with symbols () to specify this fact.
This chapter provides a test to detect or quantify bacterial endotoxins that may be present in or on the sample of the article(s) to which the test is applied. It uses Limulus Amebocyte Lysate (LAL) obtained from the aqueous extracts of circulating amebocytes of horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus) which has been prepared and characterized for use as an LAL Reagent.1
There are two types of techniques for this test: the gel-clot techniques, which are based on gel formation, and the photometric techniques. The latter include a turbidimetric method, which is based on the development of turbidity after cleavage of an endogenous substrate, and a chromogenic method, which is based on the development of color after cleavage of a synthetic peptide-chromogen complex. Proceed by any one of these techniques, unless otherwise indicated in the monograph. In case of dispute, the final decision is based on the gel-clot techniques, unless otherwise indicated in the monograph.
In the gel-clot techniques, the reaction endpoint is determined from dilutions of the material under test in direct comparison with parallel dilutions of a reference endotoxin, and quantities of endotoxin are expressed in USP Endotoxin Units (USP-EU). [NOTE—One USP-EU is equal to one IU of endotoxin.]
Because LAL Reagents have been formulated to be used also for turbidimetric or colorimetric tests, such tests may be used to comply with the requirements. These tests require the establishment of a standard regression curve; the endotoxin content of the test material is determined by interpolation from the curve. The procedures include incubation for a preselected time of reacting endotoxin and control solutions with LAL Reagent and reading of the spectrophotometric light absorbance at suitable wavelengths. In the endpoint turbidimetric procedure the reading is made immediately at the end of the incubation period. In the endpoint colorimetric procedure the reaction is arrested at the end of the preselected time by the addition of an enzyme reaction-terminating agent prior to the readings. In the turbidimetric and colorimetric kinetic assays the absorbance is measured throughout the reaction period and rate values are determined from those readings.
APPARATUS AND GLASSWARE
Depyrogenate all glassware and other heat-stable materials in a hot-air oven using a validated process.2Commonly used minimum time and temperature settings are 30 minutes at 250. If employing plastic apparatus, such as microplates and pipet tips for automatic pipetters, use only that which has been shown to be free of detectable endotoxin and not to interfere with the test. [NOTE—In this chapter, the term “tube” includes any other receptacle such as a micro-titer well.]
PREPARATION OF THE STANDARD ENDOTOXIN STOCK SOLUTION AND STANDARD SOLUTIONS
The USP Endotoxin RS has a defined potency of 10,000 USP Endotoxin Units (EU) per vial. Constitute the entire contents of 1 vial of the RSE with 5 mL of LAL Reagent Water3, mix intermittently for 30 minutes, using a vortex mixer, and use this concentrate for making appropriate serial dilutions. Preserve the concentrate in a refrigerator for making subsequent dilutions for not more than 14 days. Mix vigorously, using a vortex mixer, for not less than 3 minutes before use. Mix each dilution for not less than 30 seconds before proceeding to make the next dilution. Do not store dilutions, because of loss of activity by adsorption, in the absence of supporting data to the contrary.
Preparatory Testing
Use an LAL Reagent of confirmed label sensitivity.
The validity of test results for bacterial endotoxins requires an adequate demonstration that specimens of the article or of solutions, washings, or extracts thereof to which the test is to be applied do not of themselves inhibit or enhance the reaction or otherwise interfere with the test. Validation is accomplished by performing the inhibition or enhancement test described under each of the three techniques indicated. Appropriate negative controls are included. Validation must be repeated if the LAL Reagent source or the method of manufacture or formulation of the article is changed.
Preparation of Sample Solutions
Prepare sample solutions by dissolving or diluting drugs or extracting medical devices using LAL Reagent Water. Some substances or preparations may be more appropriately dissolved, diluted, or extracted in other aqueous solutions. If necessary, adjust the pH of the solution (or dilution thereof) to be examined so that the pH of the mixture of the LAL Reagent and sample falls within the pH range specified by the LAL Reagent manufacturer. This usually applies to a product with a pH in the range of to . The pH may be adjusted using an acid, base, or suitable buffer as recommended by the LAL Reagent manufacturer. Acids and bases may be prepared from concentrates or solids with LAL Reagent Water in containers free of detectable endotoxin. Buffers must be validated to be free of detectable endotoxin and interfering factors.
DETERMINATION OF MAXIMUM VALID DILUTION (MVD)
The Maximum Valid Dilution is the maximum allowable dilution of a specimen at which the endotoxin limit can be determined. It applies to injections or to solutions for parenteral administration in the form constituted or diluted for administration, or, where applicable, to the amount of drug by weight if the volume of the dosage form for administration could be varied. The general equation to determine MVD is:
MVD = (Endotoxin limit × Concentration of sample solution)/()
where the concentration of sample solution and are as defined below. Where the endotoxin limit concentration is specified in the individual monograph in terms of volume (in EU per mL), divide the limit by , which is the labeled sensitivity (in EU per mL) of the LAL Reagent, to obtain the MVD factor. Where the endotoxin limit concentration is specified in the individual monograph in terms of weight or Units of active drug (in EU per mg or in EU per Unit), multiply the limit by the concentration (in mg per mL or in Units per mL) of the drug in the solution tested or of the drug constituted according to the label instructions, whichever is applicable, and divide the product of the multiplication by , to obtain the MVD factor. The MVD factor so obtained is the limit dilution factor for the preparation for the test to be valid.
ESTABLISHMENT OF ENDOTOXIN LIMITS
The endotoxin limit for parenteral drugs, defined on the basis of dose, is equal to K/M,4where K is the threshold human pyrogenic dose of endotoxin per kg of body weight, and M is equal to the maximum recommended human dose of product per kg of body weight in a single hour period.
The endotoxin limit for parenteral drugs is specified in individual monographs in units such as EU/mL, EU/mg, or EU/Unit of biological activity.
GEL-CLOT TECHNIQUES
The gel-clot techniques detect or quantify endotoxins based on clotting of the LAL Reagent in the presence of endotoxin. The concentration of endotoxin required to cause the lysate to clot under standard conditions is the labeled sensitivity of the LAL Reagent. To ensure both the precision and validity of the test, tests for confirming the labeled LAL Reagent sensitivity and for interfering factors are described under Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques.
Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques
Test for Confirmation of Labeled LAL Reagent Sensitivity—Confirm the labeled sensitivity using at least 1 vial of the LAL Reagent lot. Prepare a series of two-fold dilutions of the USP Endotoxin RS in LAL Reagent Water to give concentrations of 2, , , and , where is as defined above. Perform the test on the four standard concentrations in quadruplicate and include negative controls. The test for confirmation of lysate sensitivity is to be carried out when a new batch of LAL Reagent is used or when there is any change in the experimental conditions that may affect the outcome of the test.
Mix a volume of the LAL Reagent with an equal volume (such as aliquots) of one of the standard solutions in each test tube. When single test vials or ampuls containing lyophilized LAL Reagent are used, add solutions directly to the vial or ampul.
Incubate the reaction mixture for a constant period according to directions of the LAL Reagent manufacturer (usually at 37 ± 1for 60 ± 2 minutes), avoiding vibration. To test the integrity of the gel, take each tube in turn directly from the incubator and invert it through about 180 in one smooth motion. If a firm gel has formed that remains in place upon inversion, record the result as positive. A result is negative if an intact gel is not formed. The test is not valid unless the lowest concentration of the standard solutions shows a negative result in all replicate tests.
The endpoint is the last positive test in the series of decreasing concentrations of endotoxin. Calculate the mean value of the logarithms of the endpoint concentration and then the antilogarithm of the mean value using the following equation:
Geometric Mean Endpoint Concentration = antilog (S e / f)
where S e is the sum of the log endpoint concentrations of the dilution series used, and f is the number of replicate test tubes. The geometric mean endpoint concentration is the measured sensitivity of the LAL Reagent (in EU/mL). If this is not less than and not more than 2, the labeled sensitivity is confirmed and is used in tests performed with this lysate.
Interfering Factors Test for the Gel-Clot Techniques—Prepare solutions A, B, C, and D as shown in Table 1, and perform the inhibition/enhancement test on the sample solutions at a dilution less than the MVD, not containing any detectable endotoxins, following the procedure in the Test for Confirmation of Labeled LAL Reagent Sensitivity above. The geometric mean endpoint concentrations of solutions B and C are determined using the equation in that test.
Table 1. Preparation of Solutions for the Inhibition/Enhancement Test for Gel-Clot
Techniques
This test must be repeated when any condition that is likely to influence the test results changes. The test is not valid unless Solutions A and D show no reaction and the result of Solution C confirms the labeled sensitivity.
If the sensitivity of the lysate determined in the presence of the sample solution under test of Solution B is not less than and not greater than 2, the sample solution does not contain factors which interfere under the experimental conditions used. Otherwise, the sample solution to be examined interferes with the test.
If the sample under test does not comply with the test at a dilution less than the MVD, repeat the test using a greater dilution, not exceeding the MVD. The use of a more sensitive lysate permits a greater dilution of the sample to be examined and this may contribute to the elimination of interference.
Interference may be overcome by suitable treatment, such as filtration, neutralization, dialysis, or heating. To establish that the chosen treatment effectively eliminates interference without loss of endotoxins, perform the assay
described below using the preparation to be examined to which USP Endotoxin RS has been added and which has been subjected to the selected treatment.
Gel-Clot Limit Test
This test is used when a monograph contains a requirement for endotoxin limits.
Procedure—Prepare Solutions A, B, C, and D as shown in Table 2, and perform the test on these solutions following the procedure in the Test for Confirmation of Labeled LAL Reagent Sensitivity under Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques.
Table 2. Preparation of Solutions for the Gel-Clot Limit Test
Interpretation—The test is not valid unless both replicates of positive control Solutions B and C are positive and those of negative control Solution D are negative. The preparation under test complies with the test when a negative result is found for both tubes containing Solution A. The preparation under test does not comply with the test when a positive result is found for both tubes containing Solution A.
Repeat the test when a positive result is found for 1 tube containing Solution A and a negative result for the other one. The preparation under test complies with the test when a negative result is found for both tubes containing Solution A in the repeat result. If the test is positive for the preparation under test at a dilution less than the MVD, the test may be repeated at a dilution not greater than the MVD.
Gel-Clot Assay
This assay quantifies bacterial endotoxins in sample solutions by titration to an endpoint.
Procedure—Prepare Solutions A, B, C, and D as shown in Table 3, and test these solutions by following the procedure in the Test for Confirmation of Labeled LAL Reagent Sensitivity under Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques.
Table 3. Preparation of Solutions for the Gel-Clot Assay
Calculation and Interpretation—The test is not valid unless the following conditions are met: (1) both replicates of negative control Solution D are negative;
(2) both replicates of positive product control Solution B are positive; and (3) the geometric mean endpoint concentration of Solution C is in the range of to 2.
To determine the endotoxin concentration of Solution A, calculate the endpoint concentration for each replicate series of dilutions by multiplying each endpoint dilution factor by . The endotoxin concentration in the sample is the geometric mean endpoint concentration of the replicates (see the formula given in the Test for Confirmation of Labeled LAL Reagent Sensitivity under Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques). If the test is conducted with a diluted sample solution, calculate the concentration of endotoxin in the original sample solution by multiplying by the dilution factor. If none of the dilutions of the sample solution is positive in a valid assay, report the endotoxin concentration as less than (if the diluted sample was tested, less than times the lowest dilution factor of the sample.) If all dilutions are positive, the endotoxin concentration is reported as equal to or greater than the greatest dilution factor multiplied by ., initial dilution factor times 8 times in Table 3).
The article meets the requirements of the test if the concentration of endotoxin is less than that specified in the individual monograph.
PHOTOMETRIC TECHNIQUES
The turbidimetric method measures increases in turbidity. Depending on the test principle used, this technique is classified as either endpoint-turbidimetric or kinetic-turbidimetric. The endpoint-turbidimetric technique is based on the quantitative relationship between the concentration of endotoxins and the turbidity
(absorbance or transmission) of the reaction mixture at the end of an incubation period. The kinetic-turbidimetric technique is a method to measure either the onset time needed to reach a predetermined absorbance of the reaction mixture or the rate of turbidity development.
The chromogenic method measures the chromophore released from a suitable chromogenic peptide by the reaction of endotoxins with the LAL Reagent. Depending on the test principle employed, this technique is classified as either endpoint-chromogenic or kinetic-chromogenic. The endpoint-chromogenic technique is based on the quantitative relationship between the concentration of endotoxins and the release of chromophore at the end of an incubation period. The kinetic-chromogenic technique is a method to measure either the onset time needed to reach a predetermined absorbance of the reaction mixture or the rate of color development.
All photometric tests are carried out at the incubation temperature recommended by the LAL Reagent manufacturer, which is usually 37 ± 1.
Preparatory Testing for the Photometric Techniques
To assure the precision or validity of the turbidimetric and chromogenic techniques, preparatory tests are conducted to verify that the criteria for the standard curve are valid and that the sample solution does not inhibit or enhance the reaction. Revalidation for the test method is required when conditions that are likely to influence the test result change.
Verification of Criteria for the Standard Curve—Using the Standard Endotoxin Solution, prepare at least three endotoxin concentrations to generate the standard curve. Perform the test using at least three replicates of each standard endotoxin concentration according to the manufacturer's instructions for the LAL Reagent (with regard to volume ratios, incubation time, temperature, pH, etc.). If the desired range in the kinetic methods is greater than two logs, additional standards should be included to bracket each log increase within the range of the standard curve. The absolute value of the correlation coefficient, |r|, must be greater than or equal to for the range of endotoxin concentrations indicated by the manufacturer of the LAL Reagent.
Interfering Factors Test for the Photometric Techniques—Select an endotoxin concentration at or near the middle of the endotoxin standard curve. Prepare Solutions A, B, C, and D as shown in Table 4. Perform the test on Solutions A, B, C, and D at least in duplicate following the instructions for the LAL Reagent used (with regard to volume of sample and LAL Reagent, volume ratio of sample to LAL Reagent, incubation time, etc.).
Table 4. Preparation of Solutions for the Inhibition/Enhancement Test for
Photometric Techniques
Calculate the mean recovery of the added endotoxin by subtracting the mean endotoxin concentration in the solution (if any) from that containing the added endotoxin. In order to be considered free of interfering factors under the conditions of the test, the measured concentration of the endotoxin added to the sample solution must be within 50% to 200% of the known added endotoxin concentration after subtraction of any endotoxin detected in the solution without added endotoxin.
When the endotoxin recovery is out of the specified ranges, the interfering factors must be removed as described in the Interfering Factors Test for the Gel-Clot Techniques under Preparatory Testing for the Gel-Clot Techniques.Repeating the Interfering Factors Test for the Gel-Clot Techniques validates the treatment.
Procedure for the Photometric Techniques
Follow the procedure described in the Interfering Factors Test for the Photometric Techniques under Preparatory Testing for the Photometric Techniques.
Calculation for the Photometric Techniques
Calculate the endotoxin concentration of each of the replicates of test Solution A using the standard curve generated by positive control series C. The test is not valid unless the following conditions are met: (1) the results of control series C comply with the requirements for validation defined under Verification of Criteria for the Standard Curve under Preparatory Testing for the Photometric Techniques;(2) the endotoxin recovery, calculated from the concentration found in Solution B after subtracting the endotoxin concentration found in Solution A is within 50 to 200%; and (3) the result of negative control series D does not exceed the limit of the blank value required in the description of the LAL Reagent used.
Interpretation of Results from the Photometric Techniques
In photometric assays, the preparation under test complies with the test if the mean endotoxin concentration of the replicates of Solution A, after correction for dilution and concentration, is less than the endotoxin limit for the product.
1 LAL Reagent reacts with some -glucans in addition to endotoxins. Some preparations that are treated will not react with -glucans and must be used for samples that contain glucans.
2 For a validity test of the procedure for inactivating endotoxins, see Dry-Heat Sterilization under Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles 1211. Use an LAL Reagent having a sensitivity of not less than Endotoxin Unit per mL.
3Sterile Water for Injection or other water that shows no reaction with the specific LAL Reagent with which it is to be used, at the limit of sensitivity of such reagent.
4K is 5 USP-EU/kg for any route of administration other than intrathecal (for which K is USP-EU/kg body weight). For radiopharmaceutical products not administered intrathecally the endotoxin limit is calculated as 175/V, where V is the maximum recommended dose in mL. For intrathecally administered radiopharmaceuticals, the endotoxin limit is obtained by the formula 14/V. For formulations (usually anticancer products) administered on a per square meter of body surface, the formula is K/M, where K= 5 EU/kg and M is the (maximum dose/m2/hour × m2)/70 Kg.
细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 2、实验试剂： ①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。 4、检验方法概述 ①凝胶法：限量法、半限量法 ②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法） 凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式：L≡K／M 式中： L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。
Q4B Evaluation and Recommendation of Pharmacopoeial Texts for Use in the ICH Regions Annex 14: Bacterial Endotoxins Test General Chapter This draft guidance, when finalized, will represent the Food and Drug Administration's (FDA's) current thinking on this topic. It does not create or confer any rights for or on any person and does not operate to bind FDA or the public. You can use an alternative approach if the approach satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. If you want to discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for implementing this guidance. If you cannot identify the appropriate FDA staff, call the appropriate number listed on the title page of this guidance. For questions regarding this draft document contact (CDER) Robert King 301-796-1242, or (CBER) Christopher Joneckis 301-827-0373.
细菌内毒素测定 1：试验用的试剂为 1.1内毒素工作品， 1.3鲎试剂灵敏度：λ 1.4细菌内毒素检查用水 1.5 无热源原安剖瓶 5ml/支 2：内毒素限值的确定： 3：样品最大稀释倍数确定 注射液MVD=λCL =鲎试剂灵敏度 内毒素限值样品浓度? （样品浓度按样品规格计算，单位换算为mg/ml ） 大输液MVD=鲎试剂灵敏度内毒素限值?=1λ CL （大输液的浓度都按1mg/ml 计算） 粉针样品稀释最大有限浓度=内毒素限值 鲎试剂灵敏度=L λ （然后根据样品规格计算出应该稀释的倍数） 4：溶液稀释 4.1样品稀释 样品稀释为比最大稀释倍数的小一倍的样品溶液为T 0和最大稀释倍数的样品溶液为T 1 4.2内毒素工作品稀释： 内毒素工作品根据鲎试剂的灵敏度稀释S 0=4λ,S 1=2λ。 4.3样品阳性对照0.5mlS 0+0.5mlT 0混匀 5：操作步骤 5.1取鲎试剂8支（如有一批样品），分别加入100ul 的检查用水，复溶。 5.2 对照品和供试品 5.2.1阴性对照加入100ul 检查用水 5.2.2阳性对照加入100ulS 0溶液 5.2.3样品加入100ulT 1溶液 5.2.4样品阳性对照加入100ul 样品阳性对照溶液
每个管平行做2支。 6：培养 放入试管恒温仪中37℃，培养60min。阴性对照、样品应无凝固。阳性对照、样品阳性对照应凝固，轻轻倒立180°无滑脱。 注：1、安剖瓶用酒精棉将曲颈擦拭消毒后，沿易折点折断。 2、试验完成后，用酒精棉球擦拭工作台面。 3、培养过程中注意防止震动，以免出现假阴性。 4、S1=2λ、S0=4λ。 5、如果同时做几批样品，可以只做2个阳性对照，2个阴性对照。 6、空安剖瓶的最大容积为5ml，在稀释过程中要注意不能使稀释体积过大。另外还要注意移液器的量程，尽量减少稀释次数。
细菌内毒素控制及检测培训试题及答案2018.5 姓名：成绩： 一、单选题（每题 4 分，共 20分） 1、细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，用于凝胶法时，其内毒素含量小于：。（ C） A、0.010EU/ml B、0.005EU/ml C、0.015EU/ml D、0.020EU/ml 2、耐热器皿常用去除可能存在的外源性内毒素。（B） A、干热灭菌法（ 160℃、 30 分钟以上） B、干热灭菌法（ 250℃、 30 分钟以上） C、干热灭菌法（ 170℃、 30 分钟以上） D、干热灭菌法（ 250℃、 15 分钟） 3、细菌内毒素的成分是。（B） A 、H 抗原 B、脂多糖 C、肽聚糖 D、荚膜多糖 4、供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法为：（A） A、将供试品的 pH 值调节至 6.0~8.0 B、添加适量钙离子、镁离子 C、将供试品适当加热 D、选择适当的超滤设备进行滤除 5、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化，来检测细菌内毒素。（D ） A、凝固蛋白原 B、凝固酶原 C、 B 因子
D、C因子 二、多选题（每题 4 分，共 20 分） 1、无菌药品附录中规定，必要时，物料的质量标准中应当包括：检查项目。 （ ABCD ） A、微生物限度 B、细菌内毒素 C、热原 D、培养基的外观 2、细菌内毒素的活性单位的表达方式包括：。（AB ） A 、EU B 、IU C 、IE D 、 L 3、细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括：。（ AB CD） A、含有螯合剂 B、含有某些抗凝因子 C、含有葡聚糖类物质 D、含有干扰作用的小分子 4、对于存在内毒素污染的物质或器具，则可以选择下述方法去除：。（ ABCD） A、加热法 B、酸碱法 C、蒸馏法 D、吸附法 5、热原污染的途径：。（ ABCD） A、注射用水 B、从原辅料中带入 C、从容器、用具、管道和装置等带入 D、制备过程中的污染
细菌内毒素定量检测的临床意义 1.细菌内毒素的本质 细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物，如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖（Lipoplydscharide, LPS）成分，它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。 2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现 微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应，严重时可导致弥漫性血管内凝血（DIC）及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS)，当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高，而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高，但局部有限的细菌感染，轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克，全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS)，无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者，而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。 3.细菌内毒素水平检测在临床上应用 体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数，通过内毒素水平的定量快速检测可以预示： (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义 体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素检查法 一、细菌内毒素检查法的定义： ●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。 二、背景介绍： ●1、细菌内毒素 ●2、热原 ●3、鲎 1、细菌内毒素 ●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质 特性： ●（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。 ●（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。 ●（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。 ●（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。 2、热原 2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 2.2 细胞分裂素（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原｛ 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原｛非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素） 2.3热原和内毒素的关系： 2.3.1热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。 3、鲎 3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有―活化石‖之称。又具有很高的药用价值。 3.2鲎试剂 鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。这种蓝色血液的提取物——―鲎试剂‖。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的―鲎试剂‖，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.doczj.com/doc/6017902787.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
药典三部版通则细菌内 毒素检查法 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/ （kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）； M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积 按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每 平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。
细菌内毒素的检测 摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。 本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。
关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查 0引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1) 附图1 内毒素脂多糖结构示意图 <一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：
批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱
细菌内毒素控制措施 1. 水 注射用水既是注射剂等药品制备中的一种重要原料，也是灌装无菌产品的包装容器、生产中使用的相关设备、管道、工器具等的最后洗涤用水，其水质好坏，对无菌产品质量的影响是至关重要的。注射用水水质最大污染风险是微生物和热源。 注射用水水质的污染包括外源性和内源性污染。外源性污染包括进料水、排气口或由于系统存在泄漏而与外界污染接触所致；内源性污染是系统运行中产生的，可能是水处理设备单元储存于分配系统的设计、选材、安装、运行、维护和使用不当产生利于微生物生存、繁殖的生物膜所致。 注射用水系统的水质保证体系包括硬件、软件和人员。即硬件方面的合理设计、精心安装、严密验证、达标运行、有效监控和及时维护，只有在具有一定素质的人员，严格按相关软件要求去认真操作和管理，才能制造出合格的注射用水。 2.原料 用无菌过程生产的药品可能被一种或多种成分，在使用中可能受到微生物或内毒素的污染。应优先选择无菌原料药，无菌原料药精制工艺用水及直接接触无菌原料药的包装材料的最后洗涤用水应符合注射用水质量标准；其它原料药精制工艺用水应符合纯化水质量标准。于可能夹带内毒素的每批组分应有书面操作步骤及适当的接收或拒收标准。任何组分不符合规定的内毒素标准者都应该拒收。 如果无法保证原料药中内毒素限度，应尽量制定企业内控标准。 常见的去除原料药内毒素的方法有离子交换法、有机溶剂析晶法、超滤法、吸附法和高温灭菌法等。 国外流行的的是无炭化生产。国内一般采取在药液配制时，采用0.1%活性炭吸附除去热原，达到控制内毒素的目的。试验表明，活性炭只能除去80~90%除热原，而且还容易带入很多不可知杂质。按照目前的条件，大多数厂家还是用的它，只是对于不耐热只能无菌灌装的药液，药液的温度不是活性炭除热源的理想
细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作 目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。 范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。 责任人：质量检测人员 材料： 一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。 二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。 四、旋涡混合器。 五、可调式移液器 六、0.25EU/ml鲎试剂。 七、细菌内毒素工作品。 八、凝胶法细菌内毒素检查用水。 九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。 操作方法 一、取样 1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。 2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。（可存放多长时间）。 3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。 二、鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
行鲎试剂灵敏度复核实验。 （一）实验操作 1、细菌内毒素工作品溶液的制备 取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 2、待复核鲎试剂的准备 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 3、加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4、加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 （二）实验结果计算
细菌内毒素检查相关问题 细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 审评四部王彦厚 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。 关键词：细菌内毒素检查、方法、验证 细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法