42卷 6期
2002年12月微生物学报Acta Microbiologica Sinica Vol.42December No.62002
*军事医学科学院创新课题启动基金资助课题(0010018)
作者简介:彭清忠(1970-),男,湖南慈利县人,军事医学科学院生物工程研究所助理研究员,博士,主要从事微生物遗传学研究。
收稿日期:2002-01-25,修回日期:2002-04-17
具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定
*
彭清忠 张惟材 朱厚础
(军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071)摘 要:短芽孢杆菌(Bacillus bre vis )具有分泌蛋白能力强和胞外蛋白酶活性低的特性,是分泌
表达外源蛋白较理想的宿主。为获得分泌表达系统较理想的宿主菌,建立了短芽孢杆菌高效
筛选模型,从800余株细菌中筛得8株具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的候选
菌。经多相分类学初步鉴定其中5株为短芽孢杆菌。
关键词:短芽孢杆菌,筛选,鉴定
中图分类号:Q93-3 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2002)06-0693-07
分泌表达作为蛋白质的一种表达形式具有以下优势:产物一般可溶、可正确折叠、有生物活性;毋需破碎细胞,使工艺简化;表达产物与胞内蛋白分离,利于纯化。现有原核分泌表达系统并不尽如人意。大肠杆菌遗传背景清楚,分子克隆操作技术成熟,但在进行外源蛋白高效表达时易形成包涵体;产物分泌表达水平低,且常常分泌至周质空间而不是真正的胞外[1]
。枯草杆菌具有良好的分泌性和非致病性,但胞外蛋白酶活性较高,易引起产
物降解[2,3]。短芽孢杆菌(Bacillus brevis )不仅分泌蛋白能力强而且胞外蛋白酶活性低[4,5],具有分泌表达外源蛋白的天然优势,利用它们可望建立一个高效的原核分泌表达系统。
为获得分泌表达系统较理想的宿主菌,本研究组建立了短芽孢杆菌的高效筛选模型,从不同来源的样本中筛选到8株分泌蛋白能力强的细菌,且没有检测到胞外蛋白酶活性。根据形态学、细胞脂肪酸组成分析和16S rRNA 序列特异性引物PCR 检测等方法,初步鉴定其中的5株为短芽孢杆菌。1 材料和方法
1 1 材料
1 1 1 菌株及培养条件:短芽孢杆菌AS1 1845(ATCC8246)和AS1 931购自中国普通微生
物菌种保藏中心,枯草杆菌CC TCC AB92068T 和170021由军事医学科学院微生物流行病
研究所杨瑞馥教授惠赠,大肠杆菌DH5 和JM109为本室收藏,其他菌株系本课题从土壤中分离得到;短芽孢杆菌培养用T 2培养基[6],枯草杆菌和大肠杆菌等其他菌株培养用LB 培养基。
1 1
2 试剂:菌种筛选用试剂:5%的高氯酸,5%和10%的三氯乙酸(TCA),干酪素,可溶性淀粉,小牛血清白蛋白(B SA),碘溶液(KI -I 2)。革兰氏染色试剂见文献[6]。细胞脂肪
694微 生 物 学 报42卷
酸组成分析试剂见文献[7]。PCR反应所用试剂和核酸Marker购自TaKa Ra公司。
1 2 菌种的筛选
1 2 1 分泌蛋白能力强的细菌的筛选:从北京、河北等地采集土样,分别置于含5mL无菌水的大试管中沸水浴10min,然后吸取上清涂布于LB琼脂平板,30 培养至长出菌落。把具有代表性的菌落从LB平板中挑于两个T2琼脂平板,30 培养24h,然后用5%的高氯酸覆盖其中的一个平板,静止10min后用涂棒刮开各菌落,观察菌落底部和周围是否有混浊圈。将有混浊圈产生的细菌于另一T2琼脂平板中做好标记。
将初筛的细菌接种至T2液体培养基,30 震荡培养2d。离心取上清液于1 5mL离心管中,加入等体积的10%TC A,混匀后室温放置30min,离心观察是否有大量沉淀生产。取有大量沉淀产生的细菌上清液20 L进行SDS-PAGE电泳。另外,以BSA作为标准蛋白,用Lowry法[8]测定上清液中蛋白含量。
1 2 2 细菌胞外蛋白酶和淀粉酶活性分析:将所筛分泌蛋白能力强的细菌接种于含0 5%干酪素的T2琼脂平板,30 培养2d后用5%TC A覆盖平板,观察菌落周围是否出现透明圈;将没有透明圈产生的细菌接种至含0 5%可溶性淀粉的T2琼脂平板,30 培养2d 后用碘溶液覆盖平板,观察菌落周围是否有无色透明圈显现。
1 3 菌种的鉴定
1 3 1 革兰氏染色和电镜观察:取不同生长时期的细菌菌液进行革兰氏染色[6],于光学显微镜下观察菌体染色结果。用1%H2SO4(pH6 8)对所筛菌株进行负染,于HPC M120型透射电镜下观察菌体形状及大小。
1 3
2 细胞脂肪酸组成分析:根据皂化作用提取细菌细胞脂肪酸甲酯[7],于HP6890型气相色谱仪上进行分析。利用MIDI系统软件(
3 2),将细胞脂肪酸甲酯的峰形图与各微生物的模式图进行比较分析以鉴定细菌的分类地位。
1 3 3 用短芽孢杆菌属16S rRNA序列特异性引物进行PCR检测及序列分析:按文献[9]合成16S rRNA序列特异性引物:Brev174F:5 AGACCGGGATAAC ATAGGGAAACTTAT3 , 1377R:5 GGC ATGC TGATCCGC GATTACTAGC3 。全菌PC R检测各筛选菌株,反应参数如下:94 预变性5min,94 变性1min 58 退火50s 7
2 延伸1 5min,共30个循环), 72 延伸5min,4 保存。
将50号菌的PCR产物经纯化后连接于pMD18-T载体,转化大肠杆菌D H5 ,用DNA 双脱氧链末端终止法测序。
2 结果
2 1 菌种的筛选
2 1 1 芽孢及分泌蛋白细菌的筛选:芽孢是细菌为抵抗不良环境而形成的休眠细胞,具有高度的耐热性,而营养细胞一般在50 下就死亡。我们首先将采集的120份土样沸水浴杀死营养细胞(耐热菌除外),这样样本中剩余的多数为芽孢。在适宜条件下使芽孢萌发,重新生成营养细胞。根据营养细胞菌落的形状、颜色和大小等特征,从中挑取800余株具有代表性的细菌,同时接种于两个T2琼脂平板培养。由于蛋白质遇酸变性,加入5%
高氯酸后,有蛋白分泌的细菌在其菌落底部和周围形成一混浊区域。混浊圈的大小和混浊程度基本上反映该细菌分泌蛋白能力的强弱
[10]。如图1所示:大肠杆菌JM109不形成混浊圈;枯草杆菌C CTCC AB92068T 和筛选的50号、301号、618号和735号等菌株都形成
很强的混浊圈;短芽孢杆菌AS1 1845和AS1 931则形成很弱的混浊圈。通过这种方式,我们从800余株细菌中获得96株能分泌蛋白质的细菌。
图1 琼脂平板上细菌分泌蛋白的检测
Fi g.1 Detection of protein e xcre tion on agar medium
1~4:Strains of No.35,50,268and 301;5:B .bre vis
AS1 1845;6:J M109;7~8:Strains of No.618and 735;
9:B .bre vis AS1 931;10~11:B .subtilis CCTCC
AB92068and 170021.2 1 2 分泌蛋白能力强的细菌的筛选:取初
筛细菌培养上清液,加入等体积10%TCA 使
蛋白质充分变性,离心收集变性蛋白。一般
地,沉淀蛋白的多少与上清中蛋白浓度成正
比。据此,我们从96株分泌蛋白细菌中选出
29株高蛋白分泌细菌,而短芽孢杆菌
AS1 931和AS1 1845仅有微弱的蛋白沉淀。
为观察沉淀蛋白组份,对其进行聚丙烯酸胺凝胶电泳(图2)。根据蛋白带型,可将这些高蛋白分泌细菌分为两类:一类如50、268和335号菌等主要分泌一种或二种高分子量的蛋白质;第二类如421、695号菌等分泌的各
种蛋白质在量上比较均衡。
图2 分泌蛋白细菌培养液上增SDS -PAGE 电泳结果Fi g.2 Sodium bodecyl sul fate pol yacrylamide gel elec trophoretogram of extracellul ar protei ns secreted by protein -producing bacteria 1:B .bre vis AS1 1845;2~6:Strains of No.50,268,269,300and 301;7~10:Strains of No.335,336,337and 338;11~14:Strains of No.410,411,412and 413.
根据蛋白电泳带型分布,选出11株代表
株(具有相同带型者选1株),用Lowry 法测得
其分泌蛋白量为2~5g L,其中50号和618
号茵分泌蛋白最多,分别为(4 6 0 3)g L 和
(4 0 0 1)g L 。
2 1
3 高蛋白分泌细菌胞外蛋白酶和淀粉
酶活性检测:有蛋白酶分泌的细菌,其菌落周
围的干酪素被降解。当遇酸时未被水解的干
酪素变性沉淀,而菌落周围的干酪素因水解
呈现透明圈。据此,我们发现11株细菌中3
株有胞外蛋白酶活性(图3),它们分别是
454、654和666号菌。
对8株未检出胞外蛋白酶活性的高蛋白
分泌菌进行胞外淀粉酶活性分析。T 2琼脂
平板中含0 5%的可溶性淀粉,当细菌分泌
淀粉酶时降解菌落周围的淀粉,碘的加入就
会使菌落周围出现透明圈;反之,菌落周围均为蓝色。经检测发现8株细菌都没有胞外淀粉酶活性。
2 2 菌种的鉴定
2 2 1 细菌革兰氏染色及形态特征:对筛选出的8株分泌蛋白能力强的细菌进行革兰氏695 6期彭清忠等:具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定
图4 50号菌透射电镜照片
Fig.4 Electron micrograph of ne gativel y s tained cells for strai n of No.50(Bar,2
m)
图3 高蛋白分泌细菌胞外蛋白酶活性检测
Fi g.3 Assay of extracell ular activity of
protease in protein -hyperproducers
1~6:Strains of No.50,268,301,335,413adn 454;
7~11:Strains of No.509,618,654,666and 735.
染色,发现染色结果和形态特征随着生长时期的不
同而变化。在延迟期,这些菌为革兰氏染色阴性,菌体呈
细长的杆状;在对数生长期,为革兰氏染色阳性,菌体成短而粗的杆状;在静止期,革兰氏染色又转为阴性,菌体成细长的杆状,偶尔也能观察到椭圆形的芽孢。图4是50号菌用1%H 2SO 4(pH6 8)负染后的电镜照片:菌体杆状、周生鞭毛、大小约0 88 m 2 2 m 。
2 2 2 细胞脂肪酸组成分析:细胞脂肪酸是微生物细胞膜脂双层的主要成分之一,它和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等有着极为密切的关系。以特征细胞脂肪酸组成为分类依据的化学分类法是细菌分类的一种十分有效的手段
[11]。我们对所筛选得的8株细菌进行气相色谱脂肪酸组成分析,鉴定结果见表1。
表1 8株细菌气相色谱脂肪酸鉴定结果
Table 1 Identi fication of protein -producing bacteria
by analysis of cellular fatty acid composi tion
Number of strains
Desi gnati on 50
Bac illus b rev is 268
Bac illus b rev is 301
Bacillus me gate rium 335
Bacillus sphae ricus 413
Bac illus b rev is 509
Bacillus sphae ricus 618
Bac illus b rev is 735Bac illus b rev is 2 2 3 短芽孢杆菌16S rRNA 序列特异性引物的PCR 检测及序列分析:根据Shida 等[9]报道的短芽孢杆菌属16S rRNA 序列特异性引物Brev174F 和1377R,我们对所筛的8株细菌、短芽孢杆菌AS1 193和AS1 1845、枯草杆菌CC TCCAB 92068T
、大肠杆菌JM109等进行PCR 扩增,结果如图5所示。短芽孢杆菌AS1 931和AS1 1845,50、268、413、618和735号菌都能扩增出特异的约1200bp 的片段,其他三株筛选菌(301、335和509号菌)、枯草杆菌和大肠杆菌都未扩增出相应的片段。将50号菌的PC R 产物连于pGE M -T 载体后测序(1236bp),发现与短芽孢杆菌ATCC8185
的16S rRNA 序列有99 3%的同源性。该序列已送GenBank 注册(Accession No AF424048)。
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图5 所筛菌株PCR 检测结果Fi g.5 PCR anal ysi s of protei n -produci ng bacteria M:DL2000marker;1~2:B .bre vis AS1 1845and 1 931;3~5:Strains of No.301,335and 509;6~7:J M 109and D H5 ;8~12:Strains of No.50,268,413,618and 735;13~14:B .subtilis CCTCC AB92068T and 170021.3 讨论
短芽孢杆菌细胞呈杆状,革兰氏阳性或可
变,以周生鞭毛运动,菌落平坦、光滑、黄灰色,
无可溶性色素。不水解淀粉,在不利于生长的
条件下能形成芽孢等[12]。根据短芽孢杆菌的
这些特征和分离具有高蛋白分泌能力且没有
胞外蛋白酶活性的候选宿主的目的,我们建立
了一个高效的筛选模型。首先,利用芽孢的耐
热性来筛选芽孢,这大大减少了筛选的工作
量,又提高了筛选效率。接着,用固体和液体
培养基对产蛋白细菌进行初筛和复筛。由于
在固体和液体培养基中,细菌分泌蛋白的能力
或多或少地受周围环境因素的影响,两者的检
测结果可能不一致。如268号菌在琼脂平板
上仅发现有弱的蛋白分泌能力,而在液体培养
基检测到大数量的蛋白分泌(3 4g/L)。但,一
般在固体培养基产生深的混浊圈的细菌在液
体培养基中亦有大量蛋白质堆集,如50号、
335号和618号菌等;而在固体培养基中遇酸
不产生混浊圈的细菌,则在液体培养基中不分
泌或只分泌少量蛋白质。此法也适用于其他
细菌蛋白分泌能力的检测,如335号菌后来证
明是球形芽孢杆菌。利用SDS -PAGE 检测各菌株所分泌的蛋白组份,将具有同样蛋白带型的菌株如268和269号菌,410、411、412和413号菌等归为一类,进一步宿小筛选范围。为了使分泌表达的外源蛋白稳定,不被蛋白酶降解,宿主菌必须没有或仅有微弱的胞外蛋白酶活性。我们对所筛茵株进行了胞外蛋白酶活性分析,发现其中3株分泌蛋白酶。利用这一筛选模型,我们从800余株细菌中获得8株具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的细菌,筛选率为1%。
多相分类学是确定细菌分类地位最可靠的手段。我们从表型性状、化学分类标志和遗传学特征对筛选的8株细菌进行了系列分析。
首先,革兰氏染色发现,这些菌的形态虽随生长时期的不同有所变化,但总体来说都为杆状。且在后期有芽孢形成,表明它们都为芽孢杆菌。革兰氏染色阴阳互变的特点也与芽孢杆菌中的一些种一致,如短芽孢杆菌、球形芽孢杆菌(Bacillus s phaericus )和多粘芽孢杆菌(Bacillus polym vxa )等[12]。细胞脂肪酸组成分析是一种常用的化学分类方法,操作快速、简单。在一致的培养条件下,细菌细胞脂肪酸色谱图是稳定的,关系密切的菌株有类似的脂肪酸图谱。气相色谱分析细胞脂肪酸在某种程度上可将菌株区分到属和种的水平[11]。我们筛选的8株细菌用此方法鉴定,其中5株即50号、268号、413号、618号和735697 6期彭清忠等:具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定
698微 生 物 学 报42卷
号菌为短芽孢杆菌;335号和509号菌为球形芽孢杆菌、301号菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。由于16S rRNA序列在细菌系统发育中的保守性,利用特异性引物扩增16S rRNA基因片段常被用于细菌的鉴定[13~15]。我们用短芽孢杆菌属16S rRNA序列特异性引物鉴定所筛8株细菌,仅从50、268、413、618和735号菌获得阳性检测结果,其他菌株都为阴性。此结果与细胞脂肪酸组成分析的结果是一致的。另外,对50号菌的部分16S rRNA 序列(1236bp)进行测序,发现与短芽孢杆茵ATC C8185的16S rRNA序列同源性为99 3%,进一步证明上文所述菌种鉴定的正确性。从多相分析的数据,我们可以初步确定50、268、413、618和735号菌为短芽孢杆菌。
关于短芽孢杆菌的命名,最近的分类学研究建议将其与土壤芽孢杆菌(Bacillus agri)、类短芽孢杆菌(Bacillus parabrevis)和侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)等10个种归为一新的属 短小芽孢杆菌属(Brevibacillus),相应地将短芽孢杆菌命名为短短小芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)[9]。对此国内学者亦有认同[16,17]。但鉴于我们在进行菌种鉴定时,所用的主要参考菌株AS1 1845和AS1 931等均尚未按此建议更名,故本文仍按原命名法定名。
众所周知,枯草杆芽孢菌曾被认为是一个非常有潜力的外源蛋白分泌表达的宿主。但是,由于它产生大量的胞外蛋白酶,一些外源蛋白特别是真核蛋白分泌表达后经常被迅速降解,仅获得低的产率[2,3]。尽管构建了多个蛋白酶缺失的突变株,但是效果仍不理想[18]。凭借有效的筛选模型,我们分离到的5株短芽孢杆菌既具有枯草芽孢杆菌分泌蛋白能力强的特性,又具有低或没有胞外蛋白酶活性的优势,因此,这些短芽孢杆菌可望成为外源蛋白高效分泌表达的宿主。
致谢:军事医学科学院微生物流行病研究所杨瑞馥教授惠赠枯草芽孢杆菌模式株,宋亚军博士协助完成细胞脂肪酸组成分析工作,仪器中心周涛助理研究员协助完成透射电镜观察工作,在此一并表示衷心的谢意。
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Screening and Identification of Protein -hyperproducing Bacillus brevis
*
Peng Qingzhong Zhang Weicai Zhu Houchu
(Institute of Biotechnology ,Academy o f military Me dical Sciences ,Be ijing 100071,China )Abstract :The use of B .b revis as a host offers the advantage that proteins are secreted direc tly into the culture medium,where they are accumulated at high levels in a pure state.The secreted pro -teins are usually not only correctly folded,soluble,and biologically active,but also stable and not significantly degraded because of low levels of e xtracellular protease activity.Based on the c harac -teristics of B .brevis ,a novel and efficient screening method was designed.Of 800isolates from soil,8protein -hyperproducing bacteria were isolated which showed no detectable e xtracellular activ-i ty of protease and amylase by means of measurement of enzyme activity.Based on the results of nu -merical analysis,five bacterial strains of 8protein -hyperproducers were identified as B .b revis ,which are strains of No.50,268,413,618and 735.
Key words :Bacillus brevis ,Screening,Identification
*Project Granted by Science Exploration Foundati on of Academy of Military M edical Sciences (0010018)
致 读 者
感谢广大作者、读者多年来对 微生物学报 的关心和支持。为了使您的
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微生物学报 编辑部699
6期彭清忠等:具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
广州辉骏生物科技有限公司 蛋白质质谱鉴定 一、技术概述 质谱是将待测物质变为气态离子并将离子按质荷比（m/z）进行分离，检测各种离子谱峰的强度而实现分析的一种方法。 蛋白质定性通常采用质谱分析结合数据库检索的方法，所分析的样本可以是蛋白质溶液、蛋白质胶条或胶点。 简单蛋白样本，例如双向电泳斑点或纯化蛋白，通常采用MALDI-TOF/TOF质谱（MS/MS）进行分析。 混合蛋白样本，例如蛋白溶液，或SDS-PAGE条带，通常采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行分析。应用领域有：亚细胞组分的全谱分析，IP、co-IP、Pull-down后的互作蛋白鉴定，或其他中等复杂蛋白样本的鉴定。 二、技术原理 串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是：蛋白先经胰酶消化成肽段，肽段在质谱仪中离子化后，会带上一定量的电荷，通过检测器分析，可得到各肽段的质荷比（m/z），从而得知各肽段的相对分子质量。为获得肽段的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行破碎，再次分析，获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，同时以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，反之则鉴定失败。 LC-MS/MS方法是将蛋白酶切消化为肽段混合物，之后这些肽段先经高效液相色谱分离形成简单的组分，再进行串联质谱（MS/MS）分析；因此适合于混合蛋白样本的鉴定。 三、技术优势 1. 采用高效液相色谱和质谱联用的分析方法，可以一次性鉴定成百上千种蛋白质。 2. 鉴定准确性和灵敏度高。 四、技术流程 蛋白样本制备——蛋白酶解——串联质谱分析（或LC-MS/MS分析）——数据库检索——蛋白质鉴定结果
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。 本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。 二、仪器与试剂 1、材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。 2、试剂： （1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis） （2）10%的SDS溶液 （3）10%的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8 （6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8 （7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3 （8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 （9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液
（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液 （11）标准分子量蛋白。 3、仪器设备： 电泳仪、垂直电泳槽等。 三、操作步骤 1、凝胶制备： 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。 2、上样： 分别取样品若干ml于离心管中，按1/1～1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3～5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30μl不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2～3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1～2cm时，即可停止电泳。 3、染色： 电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 四、结果（略） 五、注意事项 1、SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），如果比例不当，就不能得到准确的数据。 2、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。 3、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 4、有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 5、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
蛋白质的鉴定 【实验一】生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定 一、教学目的 初步掌握鉴定生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 二、教学建议 教材中本实验安排为验证性实验，有条件的学校可以改为探索性实验，安排在讲课之前，或与讲课同步进行。 本实验难度并不大，但内容较多，实验时间较长，因此，必须作周密安排，才能按时完成。实验中应注意以下几点。 1.增设教师演示实验。上课之前，教师应该准备好做演示实验所需的实验材料、用具、仪器和试剂等。同时，逐项完成还原糖、脂肪、蛋白质3类有机物的鉴定实验。在实验课上，将3个实验的正确结果分别展示在讲台上，并作扼要的介绍，以便使学生将自己的实验结果与教师的演示实验作比较。 2.实验中学生应分工合作。在“还原糖的鉴定”实验中，当每组两个学生中的一个制备生物组织样液时，另一个学生可以用酒精灯将水煮开，以便缩短实验的等待时间。在“脂肪的鉴定”实验中，一个学生制作临时装片时，另一个学生则可以调试显微镜。另外，在完成前两个实验时，一个学生
洗刷试管、清洗玻片和整理显微镜，另一个学生则可以进行后一个实验的操作。 3.关于鉴定还原糖的实验，在加热试管中的溶液时，应该用试管夹夹住试管上部，并放入盛开水的大烧杯中加热。注意试管底部不要接触烧杯底部，同时试管口不要朝向实验者，以免试管内溶液沸腾时冲出试管，造成烫伤。如果试管内溶液过于沸腾，可以上提试管夹，使试管底部离开大烧杯中的开水。 4.做鉴定还原糖和蛋白质的实验时，在鉴定之前，可以留出一部分样液，以便与鉴定后的样液的颜色变化作对比，这样可以增强说服力。 5.斐林试剂的甲液和乙液混合均匀后方可使用，切勿将甲液和乙液分别加入组织样液中。 三、参考资料 还原糖的鉴定原理生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基），因此叫做还原糖。蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用斐林试剂只能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。 斐林试剂由质量浓度为0.1 g／L的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05 g／L的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，
实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2) ，或与此相似的基团［如—CH2-NH2 ，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —),可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1?10mg蛋白质。干扰这一测定 的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1 ?双缩脲试剂：取CuSO4 ?5H20.)和酒石酸钾钠.)以少量蒸馏水溶解，再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1g/L 的A280 为来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或%NaCl配制，酪蛋白用L NaOH配 制。 ［器材］ 1. 试管：15X 150mm试管7只； 2. 1ml，5ml 移液管； 3. 坐标纸；
講員: 蔡沛倫 鎂陞科技股份有限公司Mass Solutions Technology 時間: 2010年7月22日 地點: 台灣大學 MASCOT 介紹與蛋白質鑑定的實際應用
MASCOT 網頁免費版: https://www.doczj.com/doc/6212464284.html,/search_form_select.html In House版: http://localhost/search_form_select.html
Protein separation Enzymatic digestion Peptide separation Mass spectrometry Database search Current Opinion in Chemical Biology2000
1108.53 Peak List 1202.66 1429.59 1731.90 1732.78 1918.13 1919.05 1920.13 2041.99 2185.16 2186.15 2206.10 2207.09 2208.09 2209.24 2210.24 2223.16 2476.24 2499.41 2500.29 2501.34 …. …. ….
Database Example >gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK TRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCN
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
双缩脲法测定蛋白质浓度 ――生物化学实验 一、目的 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。 二、原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应(蛋白质分子中有-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜色反应)，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色配合物，在540m处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。 双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但Cu2＋离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。 三、实验仪器 1．容量瓶10ml(×6)。 2．试管1.5cm×15cm(×8)。 3．吸管5.0ml(×3)、2.0ml(×1)。 4．722型(或7220型)分光光度计。 四、实验试剂 1、双缩脲试剂：将0.175g CuSO4·5H20溶于约15ml蒸馏水，置于l00ml 容量瓶中，加入30ml浓氨水30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 2、卵清蛋白液：约lg卵清蛋白溶于l00ml 0.9％NaCl溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9％NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg/ml的牛血清白蛋白溶液。 3、未知液：可用酪蛋白配制。 五、操作 1、标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。
取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管吸光度(须在显色后30min内比色，30min后可能有雾状沉淀产生；各管由显色到比色的时间尽可能一致)。绘制浓度一吸光度曲线。 2、样液测定： 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml(样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml范围内)置试管内，加入双缩脲试剂2．0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。 六、思考题 1、写出双缩脲反应的方程式。 2、简述用分光光度法测定蛋白质浓度的原理。 3、总结本实验应该注意的主要问题。
生物化学实验报告 姓名: 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目得 1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作; 1.２。掌握双缩脲试剂得配制; 1。3。熟悉血清总蛋白得临床意义; 1。4。了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。 二、实验原理 2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、
2。2。蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu ２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。 三、材料与方法: 3、１、实验材料: 3。１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。 3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒 ;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。 3。2、实验步骤 — 双缩脲试剂4。0 4。０4。0
测定次数 1 2 3 平均吸光度 m,以空白管调零,测S与U管吸得光度; d。测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。 依据公式算出结果: 四、结果与讨论: 4.1。实验现象: ①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、 ②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。(如图一) 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S0、18５0。１8４0。1８5 0。1847 U 0、１5２0.１51 0.15２ 0。1517 管号
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期 1、实验目的 1、1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1、2、掌握双缩脲试剂的配制； 1、3、熟悉血清总蛋白的临床意义； 1、4、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2、1、两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2、2、蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法：
3、1、实验材料： 3、1、1、实验试剂：①小牛血清；② 6、0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0、9%NaCl；⑥蒸馏水。 3、1、2、实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平； ⑧水浴锅。 3、2、实验步骤取3支试管，做好标记，按下表操作： 加入物（ml） B（空白） S（标准） U（待测）小牛血清（1:10） 0、5蛋白质标准液（1:10）0、9%Nacl 0、5双缩脲试剂 4、0 4、0 4、0a、各管混匀，观察各试管颜色；b、将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色；c、将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度；d、测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。 依据公式算出结果： 四、结果与讨论： 4、1、实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0、9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0、
蛋白质的纯化原理 一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]
一个简单的方法来区分蛋白质和DNA——一个普通化学的实验摘要：我们提出一个课堂实验，来补充被埃利斯等人在这个杂志提出的课堂活动。在埃利斯的活动中，学生从常见食物的细胞中提取高分子聚合物。在这个实验中,提取的聚合物是DNA还是蛋白质可以用做下面的三个易理解,便宜,而且容易的实验来鉴定。前两个测试——温度和酸介质效应——基于DNA的物理化学属性(可逆变性),第三个测试定性测定蛋白质(而非DNA)。这三种测试的结果提供证据来区分纯的的DNA分子和可能看起来像DNA的蛋白质。 艾利斯等人描述一个课堂活动,阐明了从动物和植物组织提取DNA的方法。在这个活动中,学生从常见的食物(牛肉、肝脏和洋葱)的细胞中用三个步骤提取DNA: (1)用机械粉碎的方法破坏细胞膜并添加缓冲洗涤溶液； (2)用离心机分离和除去细胞碎片, (3)通过添加冷乙醇沉淀DNA。 学生在最后一步获得一层DNA的高分子聚合物纤维。有什么证据能够证明这个聚合物纤维是DNA?我们如何能证明那些白色物质是DNA中而不使用分光光度计吗?学生们可能感觉提取的是蛋白质甚至认为沉淀是蛋白质,而不是DNA,所以我们如何区分蛋白质和DNA? 蛋白质是最丰富的生物大分子,存在于在所有细胞和细胞的所有部分。蛋白质是氨基酸的聚合物,每个氨基酸残基通过肽键这种特定的共价键和它旁边的氨基酸残基链接。蛋白质只能通过各种方法被分解(水解)成他们原来组成的氨基酸,所以,最早的对蛋白质研究集中在来源于他们的氨基酸。20种不同的氨基酸都在常见的蛋白质中发现，它们有一个羧基(-COOH)和一个氨基(-NH2)集团并且它们连接到同一个碳原子(α-碳)上。氨基酸的区别在于不同的侧链,或者说R基团不等的结构、尺寸、电荷。蛋白质有四级结构：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。所有共价键(主要是肽键和二硫键)对氨基酸残基的链接确定了多肽链的一级结构。最重要的决定二级结构的因素是指氨基酸残基的特定安排引起的循环结构 (螺旋和折叠)。三级结构说明了所有方面的多肽三维折叠方式。当一个蛋白质有两个或更多的多肽的子单元时,他们在空间的安排称为四级结构。了解DNA和蛋白质的主要理化特性,下面能完成这两种分子的区分。 我们提出一个课堂实验，来补充被埃利斯等人在这个杂志提出的课堂活动。这个实验在一个中学进行。活动30分钟即可进行完成。提取的聚合物是DNA还是蛋白质可以用做下面的三个易理解,便宜,而且容易的实验来鉴定。前两个测试——温度和酸介质效应——基于DNA的物理化学属性(可逆变性),第三个测试定性测定蛋白质(而非DNA)。这三种测试的结果提供证据来区分纯的的DNA分子和可能看起来像DNA 的蛋白质。 实验： 综述： 在这三个实验中,DNA的物理化学性质和蛋白质的不同。DNA样本在此前的一个实验中被“精制” (从草莓和香蕉中提取)。对于每个三个测试,获得的纤维绕在玻璃棒或木头棍(烧烤棒)上,像意大利面绕在叉子上一样,然后放在一个试管中。同样的
斐林试剂和双缩脲试剂区别 1、试剂的浓度和配制方法不同 斐林试剂：甲液： 0.1g/mL 的NaOH 溶液；乙液：0.05g/mL 的4CuSO 溶液。使用前临时配制，在2mL 的甲液中滴入4滴～5滴乙液，振荡使混合均匀后即可。 双缩脲试剂：A 液：0.1g/mL 的NaOH 溶液；B 液：0.01g/mL 的4CuSO 溶液。 分别配制好A 液和B 液即可。 2、试剂的作用和鉴定原理不同 斐林试剂： 作用：可鉴定可溶性还原糖。 原理：甲液和乙液混合后产生 2)OH (Cu 沉淀，2)OH (Cu 与含醛基（—CHO ）的可溶性还原糖，在加热条件下反应，将 2)OH (Cu 还原为砖红色的O Cu 2沉淀。双缩脲试剂： 作用：可鉴定蛋白质溶液。 原理：在碱性溶液（NaOH ）中，双缩脲（22CONH NH NCO H ）能与2Cu 反应，形成紫色络合物。由于蛋白质分子中含有许多与双缩脲结构相似的肽键（— CO —NH —）， 因此，蛋白质都可以与双缩脲试剂发生反应而使溶液呈现紫色。3、试剂的使用方法不同 斐林试剂：使用时现配现用，要水浴加热。如果斐林试剂放置一段时间， 因2)OH (Cu 沉淀在溶液底部而无法使用。使用时，甲液和乙液不可分别加入到待测液中，否则，待测液（苹果组织样液）中的有机酸会中和NaOH ，使产生的2)OH (Cu 不足而影响鉴定。 双缩脲试剂：使用时，双缩脲试剂A 液和双缩脲试剂 B 液要分别先后加入到待测液中，不需要加热。双缩脲试剂A 液和双缩脲试剂 B 液不可以混合后再加入待测液。如先混合，则会产生2)OH (Cu 沉淀而无2Cu 产生。加入的双缩脲试剂 B 液（4CuSO ）也不能过量，