NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞杀伤机制的异同
自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）是先天免疫中的一类十分重要的淋巴细胞，通过其细胞毒活性可以杀伤靶细胞。CD8+T细胞细胞表面表达CD8分子，可以特异的杀伤靶细胞，又称为细胞毒性T细胞或杀伤性T细胞。NK细胞和CD8+T细胞都具有杀伤靶细胞的作用，但它们对靶细胞的杀伤既有相同之处，又有不同之处。本文对NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的异同进行了概述。
1.NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的相同之处
NK细胞和CD8+T细胞都可以通过以下途径杀伤相应的靶细胞：穿孔素、颗粒酶、Fas/FasL、TNF-α、INF-γ和LT途径。
1.1穿孔素途径
穿孔素（perforin）也称为成孔蛋白(performing pertein, PFP)，NK细胞和CD8+T 细胞上都有表达。1988年,Podack 等[1]报道了人穿孔素的结构和表达,人穿孔素基因定位于10 号染色体10q22，基因全长6218bp ,其cDNA 长为1668bp。人穿孔素蛋白由534 个氨基酸残基组成,其分子量约为66～75KD。
穿孔素贮存于CD8+T细胞和NK细胞胞浆颗粒中，是CD8+T细胞和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。细胞激活后发生脱颗粒（含有穿孔素、颗粒酶等），释放穿孔素。在Ca2+的存在下,穿孔素单体可迅速附着于靶细胞膜,嵌入细胞膜的双层磷脂中,多个单体聚合形成打孔聚合物,在靶细胞膜上形成不同孔径(50～160nm) 的跨膜孔道,
O经过通道进入胞内,一些电解质和大分子物质流出从而导致靶细胞膜去极化。Na+、H
2
胞外,改变细胞膜渗透压，最终引起靶细胞渗透性死亡。此过程与补体介导的溶细胞过程类似，溶解细胞过程比较迅速。细胞本身可能释放A型硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸软骨素A限制因子，因此可避免穿孔素对自身细胞的攻击。对靶细胞进行攻击后，细胞与裂解的靶细胞分离,又可继续攻击其它靶细胞[2]。
穿孔素还可以通过颗粒酶促进靶细胞凋亡而杀伤靶细胞[3]。穿孔素形成的传膜孔道有利于颗粒酶进入靶细胞。此外，穿孔素还引起颗粒酶在靶细胞胞浆和胞核的重新分布，使颗粒酶聚集在其裂解部位，有利于裂解靶细胞。
1.2 颗粒酶途径
颗粒酶即颗粒相关丝氨酸酯酶，属于糜蛋白酶超家族，在N端具有保守序列[4]。
目前人们已经认识到的颗粒酶有10多种，而研究较多的主要是颗粒酶B。颗粒酶B 分子量约为35KD,编码人类颗粒酶B的基因位于人类14q11.2上,含有5个外显子[5].
颗粒酶与穿孔素一起贮存于NK细胞和CD8+T细胞的胞浆颗粒中，细胞激活胞吐过程中，颗粒酶和穿孔素一起释放入细胞间隙。颗粒酶可借助于穿孔素在靶细胞上形成的跨膜通道进入细胞中，直接作用于靶细胞核，通过激活半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）级联反应而诱发靶细胞凋亡[6]。颗粒酶B能活化大多数procaspase，是诱发凋亡能力最强的酶。四肽序列异亮－谷－苏－天冬氨酸是颗B最适意识别单位，也是caspase－8和caspase－10的识别位点。同时颗粒酶B还可以裂解多聚ADP核糖聚合酶、DNA依赖性蛋白酶和核有丝分裂器等核底物，直接引起细胞凋亡。Sutton 等[7]认为,Bcl－2 可阻断由颗粒酶B和穿孔素引起的细胞凋亡。
颗粒酶和穿孔素还可以通过细胞内非caspase依赖性途径诱发细胞凋亡，这种作用不被病毒产物CrmA 所抑制，而颗粒酶caspase依赖性细胞毒作用可以被病毒产物CrmA 所抑制[3]。
Shi等[8]发现尽管颗粒酶B也能自主进入靶细胞,不需要穿孔素的辅助,但穿孔素对凋亡过程的起始和颗粒酶B 进入核内有关键作用。纯化的颗粒酶B 以及其它颗粒酶单独存在不能引起靶细胞凋亡。
1.3 Fas/FasL途径
Fas分子也称为APO－1或CD95，属于Ι型跨膜糖蛋白，含有335个氨基酸残基，分子量约为45000－50000[9]。Fas分子膜外部分的氨基酸序列与肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体同源，可以与Fas配体或抗Fas抗体结合并将刺激信号传入膜内部分；膜内部分与TNF－R1的膜内部分同源。
FasL是Ⅱ型跨膜糖蛋白,呈球状三聚体结构,与TNF 超分子家族具有同源性[10]。FasL全长278个氨基酸残基，经过糖基化的FasL分子量为36－43KD。细胞受到抗原刺激或在IL-2存在的条件下，其表面可以迅速地被诱导出FasL。
当FasL与Fas结合时，Fas可以向细胞传递“死亡信号”，数小时内细胞凋亡[11-13]。Fas的凋亡信号主要是通过与其胞浆区相关的死亡结构域蛋白（FADD）介导的。Fas 与FasL结合后，受体发生多聚化，胞浆区的死亡结构域蛋白（DD）也发生多聚化，使得位于胞浆内的FADD可以通过其C端的DD与受体胞浆的DD结合。FADD一方面通过C端的DD结合Fas，另一方面通过N端的死亡反应结构域（DEM）与caspase－8 N
端的DEM结合，通过caspase－8诱导效应性caspase蛋白酶的激活，降解自身的DEM 并最终导致细胞凋亡的发生。
Fas/FasL途径与穿孔素－颗粒酶途径是相互独立的。去处穿孔素基因小鼠的CTL, 或无穿孔素表达的CTL 细胞素均可通过Fas 途径杀伤靶细胞[14]; 而FasL 基因突变小鼠CTL 无活性FasL 表达, 但仍可通过穿孔素-颗粒酶途径杀伤[15]。同时Fas/ FasL 途径与穿孔素－颗粒酶途径杀伤靶细胞作用有一定的区别[16]，前者主要删除活化T 细胞和NK细胞，作用较迅速（＜4小时），无Ca2+依赖性，具半胱天冬氨酸依赖性。后者主要清除病毒感染细胞、恶性转化细胞及异体细胞，作用反应迅速（分－秒），具有Ca2+依赖性及部分（核效应）半胱天冬氨酸酶依赖性。
1.4 TNF-α途径
人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。小鼠TNF-α前体为235氨基酸残基，信号肽79氨基酸残基，成熟的小鼠TNF-α分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成，第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。人的TNF-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上[17]。
NK细胞和CD8+T细胞都可以分泌细胞因子TNF-α，TNF通过①改变靶细胞溶酶体的稳定性，导致多种水解酶外漏；②影响细胞膜磷脂代谢；③改变靶细胞糖代谢使组织中pH降低；④以及活化靶细胞核酸内切酶，降解基因组DNA从而引起程序性细胞死亡等机理杀伤靶细胞[18]。TNF引起细胞死亡过程要明显慢于穿孔素溶解细胞的作用过程。
1.5 INF-γ途径
人INF-γ成熟分子由143个氨基酸组成，糖蛋白，以同源双体形式存在，分子量为40kDa；小鼠成熟IFN-γ分子由133个氨基酸残基组成，IFN-γ生物学作用有严格的种属特异性。人和小鼠IFN-γ基因分别定位于12号和10号染色体，在DNA 水平上IFN-γ基因与IFN-α/β基因无同源性。人和小鼠IFN-γ在DNA水平上有65%左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有40%左右[3]。
NK细胞和CD8+T细胞可以通过INF-γ来间接杀伤靶细胞。INF-γ活化巨噬细胞，
使其杀伤寄生虫和胞内寄生菌的能力显著增强。
1.6 LT途径
NK细胞和CD8+T细胞都可以分泌淋巴毒素（lymphotoxin, LT），LT与靶细胞表面的相应受体结合后向细胞内移，继而被溶酶体摄取，导致溶酶体稳定性下降，各种溶酶体酶外逸，直接引起细胞溶解。LT也可与靶细胞表面的TNF R1结合，通过受体胞浆区的DD传递靶细胞凋亡信号[3]。
2.NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的相异之处
杀伤过程的不同之处
杀伤靶细胞过程中，NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞的识别方式、颗粒产生方式及杀伤特性是不同的。
CD8+T细胞识别靶细胞是受MHC-Ι类分子限制的，由TCR将特异的识别。而NK 细胞虽然也可以通过表达的KIR，CD94/NKG2等受体识别靶细胞上的MHC-Ι类分子，但其也可通过NKR-P1家族识别靶细胞上的某些碳水化合物，或其他粘附分子识别靶细胞，因此NK细胞是非MHC-Ι类分子限制的[19]。MHC-Ι类分子丢失的病毒感染细胞对CD8+T细胞不敏感而对NK细胞变得更敏感。
NK细胞和CD8+T细胞产生穿孔素/颗粒酶颗粒的方式是不同的[19]。NK细胞本身存在这种颗粒，而静止的CD8+T细胞中不存在这种颗粒。CD8+T细胞只有与靶细胞上特异的MHC-Ι和抗原的复合物识别后，或受到IL-2等刺激的情况下，才会在胞浆内产生这种颗粒。
NK细胞的杀伤功能属于先天免疫，特异性差，其对靶细胞的杀伤作用出现的早，在体外1小时、体内4小时及见杀伤效果。而CD8+T细胞对靶细胞的杀伤属于细胞免疫，从前提细胞诱导成成熟的效应T细胞需要一个应答过程，一般需要一周以上，但其识别和杀伤具有特异性，而且免疫力维持时间较长。
2.2 NK细胞杀伤靶细胞的机制－ADCC途径
NK细胞表达的FcγRⅢA(CD16)主要结合人的IgG1和IgG3的Fc端（Cγ2、Cγ3功能区），在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下，可杀伤相应的靶细胞，这一杀伤过程称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）[3]。IL-2和IFN-γ明显增强NK细胞介导的ADCC作用。NK细胞发挥ADCC后，其本身表达Fas并可通过Fas/FasL机制发生化活诱导的细胞死亡。
2.3 CD8+T细胞杀伤靶细胞的机制
2.3.1 Leulalexin途径
Leulalexin又称TNF相关蛋白，CD8+T细胞的胞浆颗粒(分泌型)和细胞膜表面（膜结合型）均表达leulalexin[20]。存在于胞浆颗粒的分泌型leulalexin进入靶细胞的过程及发挥作用的过程都依赖于穿孔素，可介导靶细胞凋亡。膜表面的结合型leulalexin可通过细胞－细胞直接接触杀伤靶细胞，其机制可能类似于FasL。
2.3.2 丝氨酸酯酶途径
活化的CD8+T细胞可释放多种丝氨酸酯酶，如CTLA-1、CTLA-3等，它们的作用可能类似与参加补体激活的酯酶样成分，通过激活穿孔素而促进杀伤靶细胞[3]。
综上所述，NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞的杀伤既有相同点也有不同点。相同点主要集中在两者都可以通过穿孔素、颗粒酶、Fas/FasL、TNF-α、INF-γ和LT途径杀伤靶细胞；杀伤不同点包括两者对靶细胞的识别方式、颗粒产生方式及杀伤特性不同，NK细胞可以通过ADCC杀死靶细胞，CD8+T细胞可以通过leulalexin和丝氨酸酯酶途径杀伤细胞。
参考文献
[1] Podack ER, Lowrey DM, Lichtenheld M, et al.Structure, function and expression of murine and human perforin 1 (P1).Immunol Rev, 1988,103:203-11.
[2] 刘培军.穿孔素研究紧张.国外医学免疫学分册,2002,25(2):69-72.
[3] 金伯泉.细胞和分子免疫学(第二版).北京:科学出版社,2001.
[4] Podack ER, Konigsberg PJ. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural, biochemical, and functional characterization.J Exp Med. 1984,160(3):695-710 [5] Haddad P, Clement MV, Bernard O, et al. Structural organization of the hCTLA-1 gene encoding human granzyme B.Gene. 1990,87(2):265-71.
[6] Galvin JP, Spaeny-Dekking LH, Wang B, et al.Apoptosis induced by granzyme B-glycosaminoglycan complexes: implications for granule-mediated apoptosis in vivo.J Immunol. 1999,162(9):5345-50.
[7] Sutton VR,Vaux DL,Trapani JA.Bcl-2 prevents apoptosis induced by perforin and granzyme B, but not that mediated by whole cytotoxic lymphocytes. J Immunol. 1997.158(12):5783-90.
[8]Shi L, Mai S, Israels S, et al. Granzyme B (GraB) autonomously crosses the cell membrane and perforin initiates apoptosis and GraB nuclear localization. J Exp Med.1997;185(5):855-66.
[9] 郭梁,吴荣聪,王钊.与CD95相关的细胞凋亡和免疫调节.生命的化学,2002,22(2):106-10.
[10] Nagata S, Golstein P.The Fas death factor.Science,1995,267:1449-56.
[11] Suda T,Nagata S.Purification and characterization of the Fas-ligand that induces apoptosis.J Exp Med.1994,179(3):873-9.
[12] Berke G.. Unlocking the secrets of CTL and NK cells. Immunol Today. 1995,16(7):343-6
[13]彭黎明,王曾礼. 细胞凋亡的基础与临床(第一版).北京:人民卫生出版社,2000
[14] Walsh CM, Glass AA, Chiu V, et al.The role of the Fas lytic pathway in
a perforin-less CTL hybridoma. J Immunol,1994,153(6):2506-14.
[15]Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al.Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell,1993,75(6):1169-78.
[16] Edwards KM, Davis JE, Browne KA, et al. Anti-viral strategies of cytotoxic T lymphocytes are manifested through a variety of granule-bound pathways of apoptosis induction.Immunol Cell Biol,1999,77(1):76-89.
[17] 王良斌,侯水薇,吴文鹃. 肿瘤坏死因子(TNF)的分子结构和生物学活性.新疆师范大学学报,1994,12(2):74-9.
[18] Golstein P, Ojcius DM, Young JD. Cell death mechanisms and the immune system.Immunol Rev 1991,121:29-65.
[19]陆云彪,葛锡锐. 杀伤性T淋巴细胞介导的细胞溶解机理.上海免疫学杂志,1997,17(5):318-20.
[20] 潘景轩,马涧泉,李树浓.细胞毒性T细胞对靶细胞的杀伤机制研究进展.免疫学杂志,1997,13(1):58-62
.
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
腹腔巨噬细胞的获取和培养 1.实验目的： 掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术 2.实验原理： 利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。 3.实验器材及材料： （1）成年大鼠 （2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳 （3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等 （4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。 （5）培养液：DMEM（加10%血清） （6）细胞计数板和计数器 4.实验步骤： （1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。将动物仰置，
剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。 （3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。 （4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。 （5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。 （7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。 5.实验结果分析： （1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。最终获得95%以上是巨噬细胞。（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。 （2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。
1病毒没有细胞结构，但必须依赖（活细胞）才能生存。 2生命活动离不开细胞，细胞是生物体结构和功能的（基本单位）。 3生命系统的结构层次：（细胞）、（组织）、（器官）、（系统）、（个体）、（种群）（群落）、（生态系统）、（生物圈）。 4血液属于（组织）层次，皮肤属于（器官）层次。 5植物没有（系统）层次，单细胞生物既可化做（个体）层次，又可化做（细胞）层次。 6地球上最基本的生命系统是（细胞）。 第二节细胞的多样性和统一性 知识梳理： 一、高倍镜的使用步骤（尤其要注意第1和第4步） 1在低倍镜下找到物象，将物象移至（视野中央）， 2 转动（转换器），换上高倍镜。 3调节（光圈）和（反光镜），使视野亮度适宜。 4 调节（细准焦螺旋），使物象清晰。 二、显微镜使用常识 1调亮视野的两种方法（放大光圈）、（使用凹面镜）。 2高倍镜：物象（大），视野（暗），看到细胞数目（少）。 低倍镜：物象（小），视野（亮），看到的细胞数目（多）。 3物镜：（有）螺纹，镜筒越（长），放大倍数越大。 目镜：（无）螺纹，镜筒越（短），放大倍数越大。 三、原核生物与真核生物主要类群： 原核生物：蓝藻，含有（叶绿素）和（藻蓝素），可进行光合作用。 细菌：（球菌，杆菌，螺旋菌，乳酸菌） 放线菌：（链霉菌） 支原体，衣原体，立克次氏体 真核生物：动物、植物、真菌：（青霉菌，酵母菌，蘑菇）等 四、细胞学说 1创立者：（施莱登，施旺） 2内容要点：P10，共三点 3揭示问题：揭示了（细胞统一性，和生物体结构的统一性）。 五、真核细胞和原核细胞的比较 第二章组成细胞的元素和化合物 第一节细胞中的元素和化合物 知识梳理：
安徽大学 本科毕业论文（设计、创 作） 题目：山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研 究 学生姓名：孙义学号：D3******* 院（系）：生命科学学院专业：生物工程 入学时间：2012年9月 导师姓名：班谦职称/学位：博士 导师所在单位：安徽大学 完成时间：2016年5月
山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培 养技术研究 摘要 肺泡巨噬细胞是存在于肺泡中的免疫细胞，它是免疫系统的重要组成部分，肺泡巨噬细胞免疫功能非常活跃。它是肺脏抵御外来微生物侵害的第一道防线。本次实验通过研究山羊巨噬细胞的体外分离和体外培养技术，从而建立一套完整可行的巨噬细胞分离培养技术方法。人体吸入空气中的尘粒、细菌等异物进入肺泡和肺间质，多被巨噬细胞吞噬清除，在今天空气污染日趋严重的情况下，研究肺泡巨噬细胞对于免疫学和人类健康有重要的意义。而研究巨噬细胞分离培养技术将为肺泡巨噬细胞的免疫学研究奠定坚实的基础。本实验从健康无病变的羔羊肺脏灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，加入脂多糖进行诱导刺激。实验表明，通过此次实验的方法，获得了高纯度的山羊肺泡巨噬细胞，在CO2培养箱中连续培养30天左右未发现细胞大规模死亡，LPS刺激下发现其仍具有免疫活性。为进一步通过山羊肺泡巨噬细胞进行各种致病菌导致的疾病的治疗和肺泡巨噬细胞的免疫学功能研究奠定实验基础。 关键词：肺泡巨噬细胞；分离培养；LPS；山羊。 Isolation and primary culture of goat alveolar macrophages in vitro Abstract Alveolar macrophages are present in alveolar in immune cells, it is an important part of the immune system, immune function of alveolar macrophages is very active. It is the first line of defense against microbial invasion of the lung. This experiment through study on goat macrophages in vitro isolation and in vitro culture techniques, so as to establish a complete set of feasible macrophage separation cultivation techniques. Inhaled dust particles in the air, bacteria and other foreign matter into the alveolar and interstitial lung, is phagocytosis of macrophages, in today's air pollution increasingly serious situation, study of alveolar macrophages is important for immunology and human health. And the study of macrophage isolation technology will lay a solid foundation for Immunology Study on alveolar macrophages. The separation of alveolar macrophages from healthy lamb lung lavage fluid of lesions in this experiment, With lipopolysaccharide induced stimulation. The experimental results show that through the experimental method, goat alveolar macrophages in high purity and in CO2 culture box in continuous culture about 30 days found no large-scale cell death, under the stimulation of LPS found it still has the immune activity. Study on the immunological function of further by goat alveolar macrophages were all pathogenic bacteria caused the disease treatment and alveolar macrophages lay the experimental foundation.
细胞结构和功能知识点归纳 1、具有双层膜结构的细胞器----线粒体、叶绿体；具有双层膜的细胞结构---线粒体、叶绿体、细胞核。 2、具有单层膜结构的细胞器----内质网、高尔基体、液泡、溶酶体；具有单层膜的细胞结构----内质网、高尔基体、液泡、溶酶体、细胞膜。 3、没有膜结构的细胞器----中心体、核糖体。 4、含有DNA的细胞器----线粒体、叶绿体；含有DNA的细胞结构----线粒体、叶绿体和细胞核。 5、含有RNA的细胞器----线粒体、叶绿体、核糖体；含有RNA的细胞结构---线粒体、叶绿体、核糖体、细胞核、细胞质基质（含游离的tRNA）。 6、能产生水的细胞器----线粒体(有氧呼吸第三阶段O2与[H]结合生成水)、叶绿体(光合作用暗反应阶段产生水)、核糖体(氨基酸脱水缩合产生水)、高尔基体(将葡萄糖合成纤维素时产生水)；能产生水的细胞结构----线粒体、叶绿体、核糖体、高尔基体、细胞核（DNA复制、转录过程产生水）。 7、能产生ATP的细胞器----线粒体（有氧呼吸第二、三阶段产生ATP，ATP的去向：直接为生物体生命活动提供能量）、叶绿体（光合作用光反应阶段产生ATP,必需在光照下才能产生，ATP去向：还原C3生成糖类和C5）；能产生ATP的细胞结构----线粒体、叶绿体、细胞质基质（有氧呼吸和无氧呼吸第一阶段产生ATP，ATP的去向：直接为生
物体生命活动提供能量）。 8、与能量转换有关的细胞器----线粒体（将丙酮酸中的化学能转换成ATP中活跃的化学能）、叶绿体（将光能转换成ATP中活跃的化学能）；与能量转换有关的细胞结构----线粒体、叶绿体、细胞质基质（将有机物中的化学能转换成ATP中活跃的化学能）。 9、能产生[H]的细胞器----线粒体（有氧呼吸第二阶段产生[H]）、叶绿体（光合作用光反应阶段产生[H]，必需在光照下才能产生）；能产生[H]的细胞结构----线粒体、叶绿体、细胞质基质（有氧呼吸和无氧呼吸第一阶段产生[H]）。 10、含有色素的细胞器-----叶绿体（叶绿素和类胡萝卜素）、液泡（花青素）。 11、动植物细胞都有但功能不同的细胞器----高尔基体（动物细胞中高尔基体与细胞分泌物的形成有关，植物细胞中高尔基体与细胞壁的形成有关。） 12、原核细胞和真核细胞都有的细胞器----核糖体（原核细胞和真核细胞都能合成蛋白质）。 13、与动物细胞有丝分裂有关的细胞器----核糖体（合成蛋白质）、线粒体（提供能量）、中心体（发射星射线形成纺锤体）；与高等植物细胞有丝分裂有关的细胞器----核糖体（合成蛋白质）、线粒体（提供能量）、高尔基体（与细胞壁的形成有关）；与低等生物细胞有丝分裂有关的细胞器----核糖体（合成蛋白质）、线粒体（提供能量）、中心体（发射星射线形成纺锤体）、高尔基体（与细胞壁的形成有关）。
细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培
第2单元生物的结构层次第3章细胞是生命活动的单元第1节 细胞的基本结构和功能 教学目标： 1、知识目标 （1）、观察和识别动植物细胞的结构 （2）、模仿、练习制作临时装片，尝试绘制细胞结构简图。 2、能力目标 （1）、学习使用显微镜和制作临时装片，提高动手操作能力。 （2）、检索、收集和整理有关显微镜技术发展的资料，撰写小综述报告，提高归纳总结的能力。 3、情感、态度、价值观目标 （1）、将基础知识的学习与实验操作有机结合，激发学生发现问题，主动学习的兴趣。 （2）、通过学习绝大多数生物（除病毒外）都是有细胞构成的，从而加强学生的物质统一性和特殊性的唯物辨证观教育。 （3）、通过阅读小资料，是学生认同科学的发展离不开技术的发展。 教学重难点： 1、重点 （1）、认识动、植物细胞的结构和功能 （2）、认识和使用显微镜。 （3）、临时装片的制作。 2、难点 （1）、有关细胞结构的基本概念，如线粒体，叶绿体、染色体等。 （2使用显微镜。 （3）、制作临时装片。 教学方法：讲授法、演示法 教学：4 教学过程： （第一） 1、创设情景，引人新课。 2、简介：单细胞生物和多细胞生物。 要求学生观察教材p33图31形形色色的细胞。 讲述科学研究表明，在生物圈中有的生物只有一个细胞，如图3-1a所表示的衣藻，草履虫，这类生物称为单细胞生物；大多数生物是由许多细胞构成的，如图31b,c所表示的血管中的红细胞和玉米叶的下表皮细胞，这类生物称为多细胞生物。可见，细胞是生物体结构和功能的单位。 那么，怎样观察和研究构成生物体的细胞结构呢？有没有同学肉眼看过细胞？ 出示新鲜的洋葱鳞片叶，并撕取下表皮，请几位同学上讲台用肉眼进行观察，问到：你们看清楚细胞了吗？ 问：为什么肉眼看不清楚细胞？ 对，大多数细胞很微小，肉眼根本看不见。科学家们常常使用显微镜来研究细胞（简介光学显微镜和电子显微镜今天我们就先来了解光学显微镜。
1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。 3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜， 但勿伤及腹膜壁。 4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用 手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管 内。 6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle 培养基。 7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。 8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。 9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2 次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7 1.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是，以0.25%胰 酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。 2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞 贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、 细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。 4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折 光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。 5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了 的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞 6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国 GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和 50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化 细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。 7.ATCC complete growth medium:The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用
酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。 4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。 三、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。 注意
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
巨噬细胞培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下： 1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。 2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。 3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。 4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。 5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。 6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。 7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。 8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。 9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹 面朝上； 2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜； 3.10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜， 向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液； 4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛 血清悬起细胞，2×106细胞/ ml ； 5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二 次，留下贴壁细胞； 6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
2019年高中生物知识点之细胞的结构和功 能 名词：1、显微结构：在普通光学显微镜中能够观察到的细胞结构。2、亚显微结构：在普通光学显微镜下观察不能分辨清楚的细胞内各种微细结构。3、原核细胞：细胞较小，没有成形的细胞核。组成核的物质集中在核区，没有染色体，DNA 不与蛋白质结合，无核膜、无核仁；细胞器只有核糖体；有细胞壁，成分与真核细胞不同。4、真核细胞：细胞较大，有真正的细胞核，有一定数目的染色体，有核膜、有核仁，一般有多种细胞器。5、原核生物：由原核细胞构成的生物。如：蓝藻、绿藻、细菌(如硝化细菌、乳酸菌、大肠杆菌、肺炎双球菌)、放线菌、支原体等都属于原核生物。 6、真核生物：由真核细胞构成的生物。如：酵母菌、霉菌、食用菌、衣藻、变形虫、草里履虫、疟原虫等。 7、细胞膜的选择透过性：这种膜可以让水分子自由通过，细胞要选择吸收的离子和小分子(如：氨基酸、葡萄糖)也可以通过，而其它的离子、小分子和大分子(如：信使RNA、蛋白质、核酸、蔗糖)则不能通过。 8、膜蛋白：指细胞内各种膜结构中蛋白质成分。 9、载体蛋白：膜结构中与物质运输有关的一种跨膜蛋白质，细胞膜中的载体蛋白在协助扩散和主动运输中都有特异性。10、细胞质：在细胞膜以内、细胞核以外的原生质，叫做细胞质。细胞质主要包括细胞质基质和细胞器。
11、细胞质基质：细胞质内呈液态的部分是基质。是细胞进行新陈代谢的主要场所。12、细胞器：细胞质中具有特定功能的各种亚细胞结构的总称。13、细胞壁：植物细胞的外面有细胞壁，主要化学成分是纤维素和果胶，其作用是支持和保护。其性质是全透的。 语句：1、地球上的生物，除了病毒以外，所有的生物体都是由细胞构成的。(生物分类也就有了细胞生物和非细胞生物之分)。2、细胞膜由双层磷脂分子镶嵌了蛋白质。蛋白质可以以覆盖、贯穿、镶嵌三种方式与双层磷脂分子相结合。磷脂双分子层是细胞膜的基本支架，除保护作用外，还与细胞内外物质交换有关。3、细胞膜的结构特点是具有一定的流动性；功能特性是选择透过性。如：变形虫的任何部位都能伸出伪足，人体某些白细胞能吞噬病菌，这些生理的完成依赖细胞膜的流动性。4、物质进出细胞膜的方式：a、自由扩散：从高浓度一侧运输到低浓度一侧；不消耗能量。例如：H2O、O2、CO2、甘油、乙醇、苯等。b、主动运输：从低浓度一侧运输到高浓度一侧；需要载体；需要消耗能量。例如：葡萄糖、氨基酸、无机盐的离子(如K+ )。c、协助扩散：有载体的协助，能够从高浓度的一边运输到低浓度的一边，这种物质出入细胞的方式叫做协助扩散。如：葡萄糖进入红细胞。5、线粒体：呈粒状、棒状，普遍存在于动、植物细胞中，内有少量DNA和RNA内膜突起形成嵴，内膜、基质
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞 1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。 2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5分钟。 3．以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。 合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。 4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。 二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化 1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。 2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。 3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单个细胞。 4．以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。 5．离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。 6．用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90％以上，巨噬细胞占全部细胞的90％以上。 三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞 1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640培养液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。 2．离心200×g 10分钟，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108～5×108/ml。 巨噬细胞的纯化 一、用帖壁法纯化巨噬细胞 1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B 淋巴细胞的粘附。 2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mmol/L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。