【目的】
指导过氧化物酶染色检查。
【该SOP变动程序】
本标准操作程序的改动可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、质控主管、科主任。
【用途】
急性白血病的鉴别诊断，急非淋（粒细胞，单核细胞）阳性，急淋呈阴性反应。【染色原理】
当存在过氧化物酶之活性时，可以将基质（过氧化氢）分解，而产生新生态的氧，此新生态氧进而使无色联苯胺氧化为蓝色的联苯胺。联苯胺是一种不稳定的中间产物，它可以进一步氧化变成棕色的化合物。
【分布】
1．粒细胞系：原粒细胞为阴性，白血病时副原粒细胞可呈阳性反应。
中性粒细胞：自早幼粒细胞起，随细胞成熟而阳性强度也递增。其阳性颗粒为圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，而比瑞氏染色的特殊颗粒为
大。
嗜酸粒细胞：为阳性反应，其颗粒比中性粒细胞的大，着色也深。
嗜碱粒细胞：为阴性反应，但在慢粒白血病时可出现阳性反应。
在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和逐渐增多，与特殊颗粒的出现和增多有平行关系。
2.单核细胞系：呈弱阳性反应，颗粒数少，细小，着色较浅。在白血病时可见强
阳性。
3．组织细胞（网状细胞）：一般呈阴性反应，部分细胞有不同强度的阳性反应。
4. 其他细胞：均为阴性反应。
【试剂配制】
一、3%联苯胺酒精溶液配制: 联苯胺0.3g+碱性品红0.1g+95%乙醇99ml全溶
后加入亚硝基铁氰化钠饱和水溶液（36%）1。此液可保存1-2年。
一、过氧化氢溶液配制: 3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml。每次用需新鲜配制。【染色步骤】
1. 将新鲜之血或骨髓涂片，滴加0.3%联苯胺酒精溶液4—8滴，盖满涂膜约1分钟。
2.1分钟后，立即加入过氧化氢等量与上液混匀。
3.4—5分钟后，一出现蓝色，立即冲洗，否则颗粒变黑。
4.立即再用瑞氏染色法复染，时间应稍长
【结果判断】
阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。
【临床意义】
1.急性粒细胞白血病呈阳性反应。
2.单核细胞白血病呈弱阳性反应，但有些病例可呈强阳性反应，故不能与急
性粒细胞白血病鉴别，尚需作其他检验。
3.急性淋巴细胞白血病呈阴性反应。
【注意事项】
1. 复染除用瑞氏染液外，也可用姬姆萨染液等。
2. 已固定的血膜不能再作过氧化物酶染色,因酶已破坏。
3. 所用过氧化氢必须新鲜，即加于血迹上发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳
性。
4. 过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。
5. 最适合PH值为5.8—
6.5（<5.7时可出现假阳性）。
6. 滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察发现胞浆出
现阳性颗粒，立即水洗，晾干，复染，镜检。
操作人员部门主管质量负责人
姓名王烈
日期 04年07月15日
第七章线粒体与过氧化物酶体 细胞的生存需要两个基本的要素：构成细胞结构的化学元件和能量。生物从食物中获取能量，根据对氧的需要情况分为两种类型：厌氧、好氧。在真核生物中，需氧的能量转化过程与线粒体有关，并且伴随一系列的化学反应，而在原核生物中，能量转化与细胞质膜相关。 线粒体外膜是线粒体最外的一层全封闭的单位膜结构，是线粒体的界膜，厚6～7nm, 平整光滑。外膜含有孔蛋白, 所以外膜的通透性非常高,使得膜间隙中的环境几乎与胞质溶胶相似。外膜含有一些特殊的酶类，外膜上含有单胺氧化酶,该酶是外膜的标志酶,这种酶能够终止胺神经递质,如降肾上腺素和多巴胺的作用。外膜的主要作用是形成膜间隙，帮助建立电化学梯度，同时能进行一些生化反应，协助线粒体内膜和基质完成能量转换功能。 内膜是位于外膜的内侧包裹线粒体基质的一层单位膜结构，厚5～6nm。内膜的通透性较低，一般不允许离子和大多数带电的小分子通过。内膜的蛋白与脂的比例相当高，并且含有大量的心磷脂，约占磷脂含量的20%，心磷脂与离子的不可渗透性有关。线粒体内膜通常要向基质折褶形成嵴，嵴的形成使内膜的表面积大大增加。线粒体内膜的嵴上有许多排列规则的颗粒称为线粒体基粒，即ATP 合酶，又叫F0 F1 ATP酶复合体，是一个多组分的复合物。内膜的酶类可以粗略地分为三个大类∶运输酶类∶内膜上有许多运输酶类进行各种代谢产物和中间产物的运输；合成酶类∶内膜是线粒体DNA、RNA和蛋白质合成的场所；电子传递和ATP合成的酶类∶这是线粒体内膜的主要成分，参与电子传递和ATP的合成。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。内膜是线粒体进行电子传递和氧化磷酸化的主要部位，含有电子传递链中进行氧化反应的蛋白和酶。在电子传递和氧化磷酸化过程中，线粒体将氧化过程中释放出来的能量转变成ATP。 膜间隙是线粒体内膜和外膜之间的间隙，宽6～8 nm，其中充满无定形的液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙中的化学成分很多，几乎接近胞质溶胶。腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶，它的功能是催化ATP分子的末端磷酸基团转移到AMP，生成两分子ADP。膜间隙的功能是建立氢质子梯度。线粒体基质是内膜和嵴包围着的线粒体内部空间是线粒体基质。基质中的酶类最多，与三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有关的酶都存在于基质之中。此外还含有DNA、tRNAs、rRNA、以及线粒体基因表达的各种酶和核糖体。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。线粒体基质的功能是进行氧化反应，主要是三羧酸循环。 线粒体对许多亲水物质透性低，所以必须具备主动运输系统。线粒体还是钙库，具有储备钙离子的能力，但是钙离子的出入需要运输蛋白。内膜的运输系统主要是运输蛋白和促进运输作用的脂类，此外还有参与电子传递和氢质子传递的复合物。线粒体需要自主完成下列运输作用:①糖酵解产生的NADH必须进入电子传递链参与有氧氧化；②线粒体产生的代谢物质如草酰辅酶A和乙酰辅酶A
甲状腺过氧化物酶超出1000，是什么病？ 甲状腺过氧化物酶（TPOA）是催化甲状腺激素的重要酶。甲状腺过氧化物酶（TPOA）由甲状腺滤泡细胞合成，它是由933个氨基酸残基组成的分子量为103kD的10%糖化的血色素样蛋白质，在滤泡腔面的微绒毛处分布最为丰富。甲状腺过氧化物酶很常见，服用某些药物也会产生甲状腺过氧化物酶升高的现象，超出三倍以上就可确诊为甲状腺炎，在三倍以下可以观察，看是否甲状腺过氧化物酶恢复正常。 甲状腺专家贾春宝博士指出：甲状腺过氧化物酶（TPOA）是主要的甲状腺组织自身抗体，是甲状腺激素合成过程的关键酶，与甲状腺组织免疫性损伤密切相关。主要包括甲状腺刺激性抗体(TS-Ab)和甲状腺刺激阻滞性抗体(TSB-Ab)。 这项化验结果高说明您患有甲状腺的炎症，一般来说甲状腺功能的检查都会查T3、T4、TSH，所以只有这一项不合格的话，就说明只是单纯的炎症，没有伴随甲亢或甲减的症状，但是并不能肯定炎症是如果引起的，因为引起炎症的因素有很多，所以还要配合其他检查来确定。建议再去做一个甲状腺彩超，看是否有可能是甲状腺的结节或肿大引起的。 对于甲状腺炎的治疗，西医是没有药物治疗的，只有当患者发展为终身性甲减或者甲亢时，医生会开一些激素药，让患者服用，长期服用激素对身体有很大的影响，而且会产生依赖性。 中医中药对于治疗桥本氏甲状腺为具有明显的优势。贾春宝博士说，所谓桥本甲状腺炎在中医里主虚证，由脾肾阳虚引起的，所以患者常常表现为乏力、倦呆，记忆下降等症状。在临床上，我们通过健脾气、温肾阳的方法，可达到扶弱固本，增强后天禀赋的效果，从而使甲状腺过氧化物酶指标恢复正常。
过氧化物酶染色Washburn法 1.实验原理 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，pox能分解H2O2释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。 2.标本采集 2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史。凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠妇女作骨髓穿刺时要慎重。 2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液 2.3标本采集要求 2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。 2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘；翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部分。小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。 3.标本储存：室温避光处保存，若不能及时测定，可采用95％乙醇固定2分钟，可保存数天。 4.标本运输：室温运输 5.标本拒收的标准：溶血、稀释标本不能作测定。 6.试剂
6.1试剂名称：血细胞pox染色试剂 6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司 6.3试剂组成 试剂1：poxⅠ液（紫红色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。 试剂2：poxⅡ液（无色）2℃-8℃避光保存，有效期六个月。 试剂3：95％乙醇，室温避光保存。 试剂4：瑞氏染液，室温避光保存。 7.操作步骤 7.1新鲜涂片滴加Ⅰ液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加Ⅱ液数滴，混合后室温放置5分钟，流水冲洗。 7.2滴加95％乙醇脱色，水洗后瑞氏染色，复染后镜检观察结果。 8.结果判断 8.1阳性—细胞内出现棕黄或蓝黑色颗粒沉淀物质，定位于胞质。 8.2阴性—细胞内无棕黄色或蓝黑色颗粒。 9.临床意义 9.1粒细胞系统呈集中状粗颗粒强阳性反应，单核细胞系统呈弥散状颗粒弱阳性反应，部分原始单核细胞可呈阴性反应。网状细胞及吞噬细胞有不同程度的阳性。 9.2淋巴细胞系、红细胞系、巨核细胞系、浆细胞系等均为阴性反应。 10.操作性能：快速简便，特异性强，灵敏度高。 11.方法局限性 11.1标本应新鲜，且未受其他化学物的污染。若标本采集后不能及
锰胁迫下美洲商陆CAT, POD活性的变化以及同工酶谱分析 专业：生物科学 作者：范英姿指导老师：彭喜旭，王海华 (湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201) 摘要:采用室内培养及生理指标测定方法，研究了不同锰胁迫水平（0.005，0.010，0.015 mol/L）下，美洲商陆幼苗中过氧化氢酶（CAT）活性、CAT和过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化，结果表明：随着锰浓度的增加，美洲商陆幼苗中CAT活性呈一个先增大后降低的趋势，CAT同工酶电泳分析表明，处理和对照中，CAT谱带均为一条，迁移率相同(Rf=0.41)；CA T谱带亮度变化表明，第2d的10000 mmol/L CAT同工酶活性最强，而到第4d美洲商陆CA T活性降低，与CA T紫外光光度计测活性结果一致；POD同工酶电泳分析表明，POD活性变化趋势与和CA T一致，提示在0.005～0.015 mol/L浓度范围的锰胁迫下，美洲商陆的活性氧清除能力增强，而0.015 mol/L时，美洲商陆活性氧清除能力下降。 关键词:锰胁迫；美洲商陆；CA T；POD；同工酶谱分析 Manganese to deal with excessive land CAT, POD and changes in the activity of the isozyme spectrum analysis Major：Life Sciences Author: Fan Yingzi Director: Peng Xixu, Wang Haihua (School of Life Science, Hunan University of Science and Technology Xiangtan 411201, Hunan) Abstract: Indoor cultivation and use of physiological indicators of method to study the different stress levels of manganese (0.005,0.010,0.015 mol / L), Phytolacca americana seedlings in the catalase (CAT) activity, CAT and peroxidase (POD) Isozyme bands change, The results showed that: With the increasing concentration of manganese, Phytolacca americana seedlings in the CAT activity increased after the first was a decreasing trend, CAT isoenzyme electrophoresis analysis showed that the treatment and control of, CAT are a band, the same rate of migration (Rf = 0.41); CAT bands brightness changes show that the first 2 d of 10000 mmol / L CAT isozyme of the strongest, and to the first American to land 4 d CAT activity decreased, and CAT ultraviolet spectrometer measurement of results are consistent; POD isoenzyme electrophoresis analysis showed that, POD activity of CAT and consistent with the trend, Tip in the 0.005 ~ 0.015 mol / L manganese concentration of the stress, the Inter-American to land the ability to enhance the removal of reactive oxygen species, and 0.015 mol / L, Phytolacca americana active oxygen scavenging ability. Key words: manganese stress; Phytolacca americana; CAT; POD; isozyme spectrum analysis.
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种重要的含 铁溶酶体，存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗 粒中，是髓细胞的特异性标志，随着对 MPO 研究的深入，人们发现 MPO 基 因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发 展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。 髓过氧化物酶 MPO 研究 1.MPO 的结构髓过氧化物酶(MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些组 织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶 超家族成员之一。MPO 是 I 相代谢酶。每个酶分子有两个铁素基团，顺磁共 振波谱表明血红素中的铁是在甲酰基血红素部分。 MPO 的合成是粒细胞进入 循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细 胞聚集，释放髓过氧化物酶(MPO)。在成熟的粒细胞中，MPO 是含量最丰富 的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞(PMNs)内总蛋白质含量的 5%，血 液中 95%的 MPO 来源于 PMNs。MPO 的相对分子质量为 150×103，是由 2 个 亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(α 链,相对分子质量 约 60×103)和一条轻链(β 链,相对分子质量约 15×103)所构成。2 个亚单 位在 α 链处由 1 个二硫键相连。重链具有亚铁卟啉基团，说明 MPO 是铁依 赖性的。MPO 以 3 种亚形存在于髓系细胞中，分别为 MPOⅠ、Ⅱ、Ⅲ。3 种 亚型主要是重链有差异，轻链的差异较小，导致它们在相对分子质量及疏 水性等方面不同，3 种亚型在功能上的差异还不明确，有待进一步研究。 2.MPO 基因及其多态性人髓过氧化物酶基因位于染色体 17q23?q24，含 有 12 个外显子和 11 个内含子，长约 14 638 bp，调控其基因表达的是生长 因子。MPO 的 mRNA 在早幼粒细胞的表达水平最高，其次是原始粒细胞、幼 稚和原始单核细胞；当细胞分化到成熟时期，MPO 基因表达水平迅速下降。 现已知 MPO 基因首先表达的是一条相对分子质量为 89×103 的前体蛋白 (precursor protein)，经过翻译后加工，切割成 α 和 β 两种亚基，再聚 合为成熟的 MPO 分子，加上糖链，最后形成有功能的 MPO。MPO 在基因表达 过程中存在的缺陷，造成 MPO 基因 DNA 序列发生改变，影响其活力。MPO 基 因的多态性影响其基因的转录和表达，对机体的疾病易感性有一定的影响。 Chevrier 等发现了外显子 11 处和启动子区域的 V53F、A332V、I642L 和 IVS11? 2A→C4 个新的基因多态性位点， 它们的作用与功能需要进一步研究。 Piedrafita 等研究发现与疾病有关的位点有 5 个：463G/A，R569W，Y173C， M251T 和外显子 9 的碱基缺失。目前研究最多的是 MPO 基因启动子区第 463 位核苷酸 G/A 的突变，该位点位于 SP1 转录因子识别结合的顺式作用元件 中，内含 4 个 Alu 重复序列。G/A 的突变导致位于 Alu 反应元件的 SP1 转录 因子结合位点消失，从而使 MPO 转录水平显著下降。也有报道发现外显子 10 的密码子 569 存在 C 被 T 替代，使 CGG→TGG，导致遗传性 MPO 缺陷性疾
过氧化物酶peroxidase 简介 peroxidase 氧化还原酶的一种。 过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应. 过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。 过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡, 直径约为0.5～1.0μm, 通常比线粒体小。普遍存在于真核生物的各类细胞中,在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。 植物体中含有大量过氧化物酶，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视. 催化从底物移去电子，并转给过氧化氢反应。 即：供体+H2O2→氧化的供体+2H2O，是一种血红素蛋白(hemoprotein)。 如过氧化氢酶便是过氧化物酶的一种。过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶配合使用，脱除蛋清中的葡萄糖，代替了传统的自然发酵的方法，从而提高产品质量，缩短生产周期。 在医学上，也可作为工具酶，用于检验尿糖和血糖。 现代医学上认为机体衰老与氧化有关，例如染色体、酶等的氧化。所以，一些有还原性功能的物质可以在某种程度上抗衰老，如过氧化物酶体，维生素C、E也有抗衰老作用。
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法) 简介： 过氧化物酶(peroxisome ，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。 Leagene 植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)检测原理是以愈创木酚(又称2-甲氧基酚)作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性，尤其适用于检测水果中过氧化物酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 研钵或匀浆器 3、 离心管或试管 4、 低温离心机 5、 水浴锅或恒温箱 6、 比色杯 7、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①植物样品：取2g 植物组织或水果中层果肉加入4ml 预冷的POD Lysis buffer 研磨或匀 编号 名称 TE0425 50T Storage 试剂(A): POD Lysis buffer 250ml 4℃ 试剂(B): POD Assay buffer 100ml 4℃ 避光 试剂(C): POD 氧化剂 4ml RT 使用说明书 1份
浆离心，留取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用POD Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。 ④高活性样品：如果样品中含有较高活性的过氧化物酶，可以使用POD Lysis buffer进行恰当的稀释。 2、配制POD Assay buffer工作液：取适量POD氧化剂和POD Assay buffer，POD氧 化剂：POD Assay buffer按一定比例混合，即为POD Assay buffer工作液，即配即用，不宜久置。 3、加样：按照下表设置对照管、测定管，注意：对照管、测定管中为同一待测样品，但对 照管中为提前加热煮沸的样品。溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的POD活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行管，求平均值。 加入物(ml) 对照管测定管 待测样品0.05 0.05 POD Lysis buffer 1.45 1.45 POD Assay buffer工作液 1 1 4、POD检测：立即以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的 吸光度(A测定0)。准确孵育后，立即加入POD终止液终止反应(备选方案)，以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。注意：加入POD终止液终止反应不是必须步骤，可准确孵育后直接以分光光度计，比色杯光径 1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。 计算： POD活性单位的定义：在该实验条件下，每1min吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。 组织样本POD(U)={(A测定1-A测定0)×V T}/(W×V S×0.01×t) 式中：A测定1=孵育3min后测定管的吸光度值 A测定0=加入POD Assay buffer工作液后立即测定的测定管吸光度值 W=组织样本的重量(g) V T=提取酶液的总体积(ml) V S=测定时所用酶液体积(ml)
酯酶同工酶的醋酸萘酯-铁氰化钾染色法的研究 摘要：酯酶可将＠-醋酸萘酯和?-醋酸萘酯水解生成醋酸和萘酚，利用萘酚能与铁氰化钾反应生成有色物质萘醌的性质可对电泳凝胶上的酯酶同工酶进行染色。 关键词：酯酶同工酶；醋酸萘酯；铁氰化钾；染色法 经典的酯酶同工酶的染色方法的原理是，酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可与坚牢蓝反应生成蓝紫色物质，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出蓝紫色的酶带。 经过摸索，本文介绍一种新的酯酶同工酶的染色方法———醋酸萘酯N 铁氰化钾染色法，其原理是酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可被铁氰化钾氧化成萘醌，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出酶带。 一 材料与方法 1.1实验材料 以新鲜的肉鸡肝脏为材料。 1.2试剂 Acr 为广东省汕头化学试剂厂产品，Bis 、坚牢蓝RR 盐为上海化学试剂公司产品，TEMED 为上海前进试剂厂产品，溴酚蓝为上海试剂三厂产品，＠-醋酸萘酯为上海青浦合成试剂厂产品，?-醋酸萘酯为上海试剂一厂产品， Tris,HCL,NaCL,2Na HP 4o ,磷酸二氢钠，三氯醋酸，乙醇，甘油，丙酮，丙酮、铁氰化钾、过硫酸铵等均为国产分析纯。 1.3仪器设备 研钵、电泳仪与电泳槽、冰箱、离心机、微量加样器、恒温水浴锅、染色盒、67$紫外光栅分光光度计等。 1.4实验方法 （1）样品制备：取一定量的新鲜鸡肝，按一定比例加入8*9:1的磷酸缓冲液后进行研磨，经4000r/min,15min 离心后取上清液，置于1?冰箱中保存备用。 （2）酯酶活力的测定：参照禹邦超等人的方法进行。 （3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照赵永芳的方法进行。 （4）酯酶同工酶的染色方法有： 经典法：（即醋酸萘酯-固蓝RR 盐染色法）染色液：称取?-醋酸萘酯与＠-醋酸萘酯、坚牢蓝RR 各200mg ，分别用10mL 丙酮溶解后，混合，再用磷酸缓冲液定容至200mL 。 电泳后，将凝胶条浸入染色液中，于37摄氏度保温直至酶带出现。 染色新法（即醋酸萘酯B 铁氰化钾染色法）染色液G ：仅将经典法染色液中的坚牢蓝RR 除去；染色液B ：4%的铁氰化钾溶液。电泳后将凝胶条浸入染色液A 中，于37摄氏度保温2min 后弃去染色液A ，用蒸馏水稍加漂洗，再用染色液B 染色，直至显出酶带。 二 结果与讨论 电泳前，将完整的一块凝胶按计划等分为$部份，每部份都按相同的酶活力梯度进行点样。电泳结束后，将该凝胶按计划等分切为2块凝胶。1块用经典法进行染色，1块用染色新法进行染色 通过观察实验现象，我们发现这2种染色方法所得的酶谱是相同的。前文已再次证实鸡
第四节过氧化物酶体（Peroxisome） 1954年，Rhodin在研究大鼠肾小管上皮细胞时发现一种膜结合的颗粒，直径约为0.5～1.0μm。由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)。微体有两种主要类型∶过氧化物酶体和乙醛酸循环体(glyoxysomes)，后者只在植物中发现。 一、过氧化物酶体的形态结构和化学组成 过氧化物酶体的形态、大小多样。多为圆形或卵圆形，直径0.01～0.15nm。常含有类核体（类晶体）结构，为尿酸氧化酶，有些含有边缘板，与形态有关（图3-2-7）。 图3-2-7动物细胞中的过氧化物酶体 过氧化物酶体含有丰富的酶类，目前已知的有40余种，主要是氧化酶(oxidase)、过氧化氢酶(catalase)和过氧化物酶。氧化酶作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢:RH2 + O2→ R + H2O2。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，它的作用是使过氧化氢还原成水: 2H2O2→ O2 + 2H2O。过氧化物酶类仅存在于血细胞等少数细胞。 二、过氧化物酶体的功能 1、使毒性物质失活 这种作用是过氧化氢酶利用过氧化氢氧化各种底物，如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的结果使这些有毒性的物质变成无毒性的物质，同时也使H2O2进一步转变成无毒的H2O。这种解毒作用对于肝、肾特别重要，例如人们饮入的乙醇几乎有一半是以这种方式被氧化成乙醛的，从而解除了乙醇对细胞的毒性作用。 2、对氧浓度的调节作用 过氧化物酶体与线粒体对氧的敏感性是不一样的，线粒体氧化所需的最佳氧浓度为2%左右，增加氧浓度，并不提高线粒体的氧化能力。过氧化物酶体的氧化率是随氧张力增强而成正比地提高（图3-2-8）。因此，在低浓度氧的条件下，线粒体利用氧的能力比过氧化物酶体强，但在高浓度氧的情况下，过氧化物酶体的氧化反应占主导地位，这种特性使过氧化物酶体具有使细胞免受高浓度氧的毒性作用。
高级植物生理实验报告 2014 年12 月28 日
植物同工酶凝胶电泳实验 一、实验目的和意义 同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。 本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。提高学生的实际操作及动手能力。培养学生对实验结果的分析能力。 二、实验原理 带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。 三、材料 不同品种的燕麦
髓过氧化物酶指数在57例急性冠状动脉综合征患者的临床应用 髓过氧化物酶(MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一。分子量为150KDa。MPO基因位于人第17号染色体,其编码蛋白翻译修饰后形成2条轻链和2条重链,构成四聚体糖基化蛋白。在早期由北京协和洛克和美国克利夫兰医院共同研究发现出来,它具有早期预警和提前筛查心脑血管疾病一个标记物。另一方面血液中95%的MPO来源于多形核白细胞。尽早明确急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS的诊断、危险分层及正确地评估个体近期发生ACS的危险性,对尽早干预治疗ACS至关重要。有研究表明,血浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MP0是早期诊断ACS的重要指标,与心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI联合应用更能增加ACS诊断的灵敏度[1]。尤其是当cTnI正常时,血浆MPO升高可预测心脏事件的发生[2]。但血浆MPO检测方法繁琐,目前无法自动化,临床应用受到限制。Unionluck全自动血细胞分析仪是一种基于流式细胞分析原
理的仪器,现在广泛应用于大中型医院实验室,在计数全血细胞的同时可根据细胞内MPO染色的情况得出中性粒细胞过氧化物酶活性指数(myeloperoxidase index,MPXI,用于评价炎症状况和白血病[3-4]。现将本院分析MPXI在57例ACS患者的临床应用报道如下。 1资料与方法 1.1一股资料选择2011年5~8月本院收治的ACS患者57例。其中,不稳定型心绞痛(UAP20例为UAP组,其中,男12例,女8例,年龄(70.00±10.10岁。非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI20例为NSTEMI组,其中,男12例,女8例,年龄(67.00±18.10岁。ST段抬高型心肌梗死(STEMI17例为STEMI组,其中,男8例,女9例,年龄 (69.90±15.20岁。选取同期本院体检中心健康体检者20例为对照组,其中,男10例,女10例,年龄(63.3±3.0岁。根据病史和辅助检查,ACS的临床诊断标准参照美国心脏病学会(美国心脏病协会制订的标准[5]。排除标准:(1近期罹患感染性疾病或慢性炎症疾病;(2严重血液性疾病;(3骨髓移植术;(4结缔组织病和风湿病;(5应用炎症抑制药物如非固醇类消炎镇痛药、类固醇类药物等;(6创伤、肿瘤;(7严重肝肾功能不全。4组年龄、性别等方面比较差异无统计学意义,具有可比性。
实验四同工酶分析 同工酶概述 酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。 同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。 从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因： （一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个 学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基， 按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、 LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。 （二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于 同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族 中。 （三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体 （26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。 （四）多肽链的续发变化多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产 生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、 磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。 （五）酶空间构象的差异组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。 从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。 同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种： （一）呈色法直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。 （二）化学反应显色法采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显
1. 线粒体(mi tochondri on) 线粒体是1850年发现的,1898年命名。线粒体由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴,两层膜之间有腔,线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类,内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞"动力工厂"(power plant)之称。另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系, 但线粒体基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。 线粒体的形状多种多样, 一般呈线状,也有粒状或短线状。线粒体的直径一般在0.5～1.0 μm, 在长度上变化很大, 一般为1.5～3μm, 长的可达10μm ,人的成纤维细胞的线粒体则更长,可达40μm。不同组织在不同条件下有时会出现体积异常膨大的线粒体, 称为巨型线粒体(megamitochondria) 在多数细胞中,线粒体均匀分布在整个细胞质中,但在某些些细胞中,线粒体的分布是不均一的,有时线粒体聚集在细胞质的边缘。在细胞质中,线粒体常常集中在代谢活跃的区域,因为这些区域需要较多的ATP,如肌细胞的肌纤维中有很多线粒体。另外, 在精细胞、鞭毛、纤毛和肾小管细胞的基部都是线粒体分布较多的地方。线粒体除了较多分布在需要ATP的区域外,也较为集中的分布在有较多氧化反应底物的区域,如脂肪滴,因为脂肪滴中有许多要被氧化的脂肪。 2. 外膜(o ute r membrane) 包围在线粒体外面的一层单位膜结构。厚6nm, 平整光滑, 上面有较大的孔蛋白, 可允许相对分子质量在5kDa左右的分子通过。外膜上还有一些合成脂的酶以及将脂转变成可进一步在基质中代谢的酶。外膜的标志酶是单胺氧化酶。 3. 内膜(inner memb rane) 位于外膜内层的一层单位膜结构, 厚约6nm。内膜对物质的通透性很低, 只有不带电的小分子物质才能通过。内膜向内折褶形成许多嵴, 大大增加了内膜的表面积。内膜含有三类功能性蛋白:①呼吸链中进行氧化反应的酶; ②ATP合成酶复合物; ③一些特殊的运输蛋白, 调节基质中代谢代谢物的输出和输入。内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。 4. 线粒体膜间隙(in ter memb rane space) 线粒体内膜和外膜之间的间隙, 约6～8nm, 其中充满无定形的液体, 含有可溶性的酶、底物和辅助因子。膜间隙的标志酶是腺苷酸激酶。 5. 线粒体基质( ma tr ix) 内膜和嵴包围着的线粒体内部空间, 含有很多蛋白质和脂类,催化三羧酸循环中脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类, 也都存在于基质中。此外, 还含有线粒体DNA、线粒体核糖体、tRNAs、rRNAs以及线粒体基因表达的各种酶。基质中的标志酶是苹果酸脱氢酶。 6. 嵴(c ris tae)
(niacin),纤维酸类,雌二醇,他汀类。 烟酸是最常用最有效的药物,其代表药物为N-i aspan,可抑制肝脏对Apo -AI 的清除,促进C H 的逆转运,因此能提高血HDL -C H (25%~30%),Apo -AI,HDL2,HDL3水平,降低TG 及LDL,此药安全性好,副作用少,能够被患者较好耐受,也适用于II 型糖尿病患者。 纤维酸主要通过促进Apo -AI,AII 基因表达来提高血浆HDL 浓度;同时,它还可以减轻静脉壁炎症反应,抑制血栓形成。临床实践表明gemfibrozil,bezafibrate 及fenofibrate 可以有效缓解高脂血症及II 型糖尿病患者动脉硬化进展,gemfibrozil 尤其适用于低HDL 正常TG 及LDL 患者 [14] 。 雌二醇促进Apo -AI 基因的转录,因而刺激Apo -AI 的合成,故理论上其与烟酸、纤维酸合用效果更 好,但目前尚未用之于临床。 他汀类(Lovastatin,Pravastatin 及Simvastatin)已广泛用于治疗高脂血症,但提高HDL 效果不如前述药物,因此,临床提倡与前述药物联合应用[15]。4.3 基因疗法 将人Apo -AI,Apo -AIV,Apo -E,LC AT,LPL,SR -BI 基因注入转基因小鼠,可使HDL -C 浓度明显增高,缓解高脂血症;导入CETP 的反义寡聚核苷酸(ODNS),可通过降低LDL 及VLDL 、增高HDL -C 水平,对AS 的发生产生抑制作用。应用基因 疗法提高HDL 治疗高脂血症将是本世纪重点研究课题,而且将由动物实验过度到临床[16,17]。 参 考 文 献 01 Colvi n PL,Parks J S.Curr Opin Lipidol,1999,10(4):309-314.02 Kerry -Anne R,Moira AC,Philip J.Atherosclerosi s,1999,145(2):227-238. 03 Phillips MC,Gillotte KL,Haynes MP et al .Atherosclerosis,1998,137: 13-17. 04 Silver D L,Jiang XC,Arai T,et al .Ann NY Acad Sci,2000,902:103-111. 05 Moes trup SK,Kozyraki R.Curr Opin Lipi dol,2000,11(2):133-140.06 Kas hyap ML.Am J Cardiol,1998,82:42-48. 07 Hargruve G M ,Junc o A,Wong NC.J Mol Endocrinol,1999,22(2):103-111. 08 Chen Hua,Yu Qing -Sheng,Guo Zhao -Gui,et al .Ac ta Physi ol Scand, 2000,52(1).81-84. 09 Boden WE,Pearson TA.Am J Cardiol,2000,85(5):645-650.10 Saffer RS,Cornell MO.Pos tgrad Med,2000,108(7):87-90.11 Bowen PH,Guyton JR.Curr Atheroscler Rep,2000,2(1):58-63.12 De Lorimier AA.Am J Surg,2000,180(5):357-361. 13 Tavintharan S,Kashyap ML.Curr Atheroscler Rep,2001,3(1):74-82.14 Fruchart JC,Staels B,Duriez P,et al .Curr Atheroscler Rep,2001,3 (1):83-92. 15 Stei n EA.Curr Atheroscler Rep,2000,2(1):11-13. 16 Rader DJ,Tie tge UJ.Curr Atheroscler Rep,1999,1(1):58-69.17 Ka washiri M,Maugeais C,Rader DJ,e t al .Curr Atheroscler Rep, 2000,2(5):363-372. 过氧化物酶体增殖物激活受体研究的新进展X 刘美莲 综述 宋惠萍 审校 (中南大学湘雅医学院生物化学教研室,湖南长沙410078) 摘要:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一种核内受体转录因子,具有多种生物学效应。除能调节脂肪分化和脂代谢外,PPARs,尤其是PPAR C 还能调控细胞因子生成,增强机体对胰岛素的敏感性,具有调节体内糖平衡,控制炎症形成和影响肿瘤生长等作用。 关键词:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs); PPARs 的配基; 微体; 脂质过氧化作用; PPARr 中图分类号:R34 文献标识码:A 文章编号:1001-1773(2001)05-0413-03 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员[1]。1990年,PPARs 作为过氧化物酶体增殖的关键分子第一次被发现[2],因具有由过氧化物酶体增殖物激 活而得名。PPARs 具有多种生物学效应,可促进脂肪细胞分化和脂肪生成,增强机体对胰岛素的敏感性[3] ,调节体内糖平衡,抑制炎症因子生成及炎症形成,影响肿瘤生长,对心血管产生保护效应[4]。 413 X 收稿日期:2000-12-06 修回日期:2001-05-09 作者简介:刘美莲(1971-),女,湖南人,中南大学湘雅医学院生化教研室讲师,博士,从事糖尿病及并发症的发病机制方面的研究。 第21卷第5期2001年10月 国外医学#生理、病理科学与临床分册 Foreign M edical Sci ences #Sec tion of Pathophysi ology and Clinical M edici ne Vol.21 No.5 Oct. 2001
过氧化物酶(POX)染色 [原理] 粒细胞和单核细胞脑浆内含过氧化物酶，能借助受体(联苯胺)脱氢催化过氧化氢而释放新生氧。受体被氧化成联苯胺蓝。再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于脑浆内。 [试剂] 1．联苯胺溶液：联苯胺0．38，加36％亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95％乙醇加到100ml，水浴加热助溶。贮于棕色瓶中，可保存数月。工作时应小心溶液污染皮肤。 2.稀双氧水：临用前将30％双氧水用蒸馏水1：80稀释。 [操作] (1)新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5—8滴，使布满整张涂片，固定1—2 分钟。 (2)加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4—8分钟。 (3)涂片用流水冲洗。待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30分钟。 [结果观察] 可报告阳性程度或阳性细胞％。 阴性：无蓝色颗粒和蓝色物质。 弱阳性：蓝色颗粒量少且细小，相当于(十)。 阳性：‘蓝色颗粒量多，粗细不一。相当于(++)。 强阳性：细胞充满粗大紧密蓝色颗粒。相当于(+++）。 [临床意义] (1)粒系统细胞除早期原粒细胞阴性外，晚期原粒细胞及以下各阶段细胞均含 有不同程度的蓝色颗粒。嗜酸性粒细胞颗粒更粗大，呈深蓝色。嗜碱性细胞为阴性。 (2)单核细胞中，除早期原始阶段外，皆呈弱阳性反应，其颗粒细小稀疏。 (3)某些网状细胞及吞噬细胞可呈不同程度的过氧化物酶阳性反应。 (4)所有淋巴细胞过氧化物酶染色皆为阴性。 (5)该化学染色是区别急性淋巴细胞性白血病和急性非淋巴细胞性白血病的 关键化学染色。FAB分型规定前者阳性率＜3％。 编写：谢平制定日期：2011.12.1
[附注] (1)联苯胺溶液若明显变色发绿，应重新配制。 (2)亚硝基铁氰化钠溶液也可在临用前取0．368溶解于1ml蒸馏水中，加热 助溶后应用。 (3)双氧水浓度若过高，则有抑制酶作用。双氧水浓度太高、制片太厚、涂片冲洗不净以及粒细胞破坏过多，可造成假阳性。涂片中粒细胞若看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即示双氧水过浓。若双氧水加于血片上不产生气泡，则示失效，应重做试验。 (4)在涂片上两液混匀时，动作要轻，以免将阳性颗粒吹散到阴性细胞上； (5)制片不能太厚，涂片要新鲜。 编写：谢平制定日期：2011.12.1