1.目的 规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。 2.依据标准 《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G 《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五> 3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定 4.实验室生物安全级别及个人防护 对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。 5.标本的采集、处理和储存 5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择 发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。 标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。 5.2标本处理 实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。 收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。 标本经以上处理后置4℃，待其自然沉淀5～10分钟，取上清液直接接种或低温保存。如采样液中未加抗菌素，接种前应补加庆大霉素终浓度为0.1mg/ml，抗真菌药物终浓度为2mg/ml。混匀
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据
流感有关知识 流感是有季节性的，大家常说的季节性流感指的是人流感病毒，也就是甲型流感病毒中的H1，H2和H3型。 季节性流感每年都有一个高发期，一般在冬季和冬春交际的时候，换句话说就是天冷的时候高发。 原因有很多，我把它们按照传染病传播的三要素分别说一下： 1. 传染源 导致流感的病原体是流感病毒，流感病毒的主要宿主是禽类，另外，人、猪、猫、马、鲸、雪貂和海豹等也可以感染流感病毒。不过，人流感（甲型流感中的H1，H2和H3型）的主要传染源是感染流感病毒的病人。 天气冷的时候，人们更喜欢呆在屋子里，同时天气寒冷的时候人们更喜欢关闭窗户，导致室内外空气缺乏流通。如果同一间屋子里有一个传染源，那么他排出的流感病毒在密闭的环境中更容易聚积，这便增加了同屋中易感人群的感染率。 2. 传播途径 流感病毒主要通过两个途径传播，空气传播和接触传播。 人流感病毒在人类之间的传播主要通过空气传播，而目前仅发现禽流感病毒通过接触途径在禽与人和人与人之间传播的病例。
有研究专门比较了温度和湿度对于这两种传播途径的影响，结论很简单： 1）通过空气传播的人流感病毒，高温传播效率低，低温传播效率高；高湿传播效率低，低湿传播效率高。 2）对于通过接触途径传播的禽流感病毒，温度和湿度都不影响其传播能力。 关于温度和湿度影响人流感病毒传播效率的机制，科学家们已经有一定的认识： 科学家在豚鼠中研究发现，人流感病毒在空气湿度为20%-35%的时候传播最为有效；而在空气湿度达到80%的时候，传播基本上被阻止。同时，较低的温度较适于病毒的传播，如在一些空气湿度条件下，病毒在20℃时的传播效果不如在5℃的时候，而温度一旦上升到30℃，传播就基本被阻止了。研究者认为，低温和低湿度让流感病毒更易传播，可能是因为较低的温度会使得病毒颗粒更为稳定，从而使得病毒颗粒能够传播较远的距离。 湿度也会影响流感病毒的感染性。有研究表明当空气湿度在20%-40%的时候，流感病毒的颗粒感染能力最强；在空气湿度为50%左右的时候，感染性降至最低；而当空气湿度度上升到60%-80%，感染性再次提高。 人咳嗽或打喷嚏排出的流感病毒主要通过空气中的气溶胶进行传播。在较低湿度的时候，气溶胶中的水分很快会丢失而形成飞沫核（droplet nuclei）。飞沫核的直径小于5 μm，质量很轻，能够稳定
禽流感的研究进展 谭飞虎，刁小龙，朱玉娟，张尚弟，张连团，祁越，刘卫军，吴頔 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail：tanfeihu521@https://www.doczj.com/doc/6e16856933.html, 摘要：禽流感（Avian Influenza,AI），1878年首次发现与意大利，目前在美洲、非洲、亚洲、欧洲一些国家广泛发生。禽流感（AI）是由是由A型禽流感病毒(av ian in fluenza virus,AIV) 引起的禽类烈性传染病，主要在禽类中传播。AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。它可通过多种途径传播，且临床症状多样。本文主要从AIV的结构特征，致病机理，防治措施等方面论述了AIV 的研究进展 关键词：禽流感，结构特征，致病机理 引言 禽流感（Avian Influenza，AI）又名真性鸡瘟、欧洲鸡瘟，1878年首次发现于意大利。禽流感是由正粘病毒科甲型流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类感染和疾病综合症。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）亚型众多，变异频繁，根据病毒的血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的差异，将A型流感病毒分为不同的血清型，目前已发现16种HA亚型和9种NA亚型。其分子机制涉及点突变引起的抗原漂移（Antiyentil drife）和不同亚型毒株同源性产生新亚型所引起的抗原转变(Antiyentic shift)。该病在临床上所表现的症状变化从亚临床感染，重轻度的呼吸系统疾病，产蛋下降到严重的致死性疾病，其严重程度取于病毒的毒株以及被感染禽的种类，日龄和有无并发症等因素。禽流感病毒仅有H5和H7了两个血清型可引起高致病力禽流感（High Pathogentic Avian Influenza，HPAIV），以突然死亡和高死率为特征，在火鸡和鸡种引起的危害最为严重，常可导致感染鸡群的全军覆没，造成严重的经济损失，所以被国际兽医局列为A类烈性传染病。 1 流感病毒的分类 由于禽流感造成的损失巨大，引起国际社会的广泛关注，并对其分类进行了更为详尽的研究。根据国际病毒分类学（ICTV）第六次分类报告（1995年）规定，正粘病毒科分 3个病毒属：A，B型病毒属（Influenza Virus），A,B,C型流感病毒属（Influenza Virus C），类托高土病毒属（Thogotoline Virus），各属的代表中分别为A型流感病毒，C型流感病毒，托高土病毒，但是习惯上仍将A,B,C型流感病毒都归属亚流感病毒属的3个型[1]。这3个型的流感病毒没有共同的抗原，在内部核蛋白和基质蛋白的抗原性上有很大差异，在致病性和基因结构上也有所不同，其中的A型流感病毒感染的范围最大，危害最大，它可以感染人，猪，马，海洋哺乳动物，禽类等，是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。而B，C型流感病毒却只能感染人，所以禽流感可感染人类，引起以呼吸系统症状为主的急性传染病，部分患者可发展为全身多脏器功能衰竭而死亡。2005年1月新英格兰医学杂志上确认了第一例在人与人之间传播的禽流感病例，由于猪既有人类病毒的受体，又具有禽类病素的受体，所以猪可以同时感染两种病毒，并发生重配进而感染人类，这是禽流感病毒传染的最可能途径[ 2 ]。 -1-
甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用说明书 【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料
流感的小知识 1.流感不是普通感冒 普通感冒常由于受凉或鼻病毒、冠状病毒、细菌等病原引起的呼吸道疾病，传染性不强，症状较轻，呈自限性。 流感是由流感病毒（甲型和乙型流感病毒）感染引起的急性呼吸道传染病，主要通过其近距离呼吸道飞沫传播，也可以通过口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触传播，在人群聚集的场所发生聚集性疫情。 2.怎么判断是否得了流感？ 流感起病急，大多为自限性，但部分因出现肺炎等并发症可发展至重症流感，少数重症病例病情进展快，可因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和/或多脏器衰竭而死亡。 流感的症状是临床常规诊断和治疗的主要依据，流感一般表现为急性起病、发热（部分病例可出现高热，达39-40℃）、咳嗽、咽痛、流涕、鼻塞、身体疼痛、寒颤、疲乏、腹泻、呕吐等症状。 流感的症状、体征缺乏特异性，易与普通感冒和其他上呼吸道感染相混淆。流感确诊有赖于实验室诊断，检测方法包括病毒核酸检测、病毒分离培养、抗原检测和血清学检测。 3.哪些人容易得流感? 流感对人群普遍易感。重症流感主要发生在老年人、年幼儿童、孕产妇或有慢性基础疾病者等高危人群，亦可发生在一般人群。 4. 得了流感会怎样？ 多数人表现为轻症，可在一周内自愈。 部分人群特别是孕妇、儿童、老年人、慢性病患者等高危人群感染流感后可导致并发症，出现严重临床后果甚至死亡，要密切关注重症患者和高危人群的病情变化。 5.每年接种流感疫苗是预防流感的最有效手段。 每年接种流感疫苗是预防流感最有效的手段，可以显著降低接种者罹患流感和发生严重并发症的风险。流感病毒易发生变异，疫苗接种的免疫力会随时间推移逐渐减弱，因此流感疫苗需要每年接种。 6.流感疫苗安全有效吗？ 流感疫苗安全有效，是预防流感的最佳手段。在大多数年份，流感疫苗与流感流行毒株
流行性感冒
流行性感冒 流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。甲型H1N1也就是甲型一种。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。 病因 流感病毒所致，该病毒不耐热，100℃1分钟或56℃30分钟灭活，对常用消毒剂敏感（1%甲醛、过氧乙酸、含氯消毒剂等）对紫外线敏感，耐低温和干燥，真空干燥或-20℃以下仍可存活。其中甲型流感病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。 临床表现 1.潜伏期 潜伏期一般为1～7天，多数为2～4天。 2.表现 （1）单纯型流感常突然起病，畏寒高热，体温可达39℃～40℃，多伴头痛、全身肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽喉痛、干咳，可有鼻塞、流涕、胸骨后不适等。颜面潮红，眼结膜外眦轻度充血。如无并发症呈自限性过程，多于发病3～4天后体温逐渐消退，全身症状好转，但咳
嗽、体力恢复常需1～2周。轻症流感与普通感冒相似，症状轻，2～3天可恢复。 （2）肺炎型流感实质上就是并发了流感病毒性肺炎，多见于老年人、儿童、原有心肺疾患的人群。主要表现为高热持续不退，剧烈咳嗽、咳血痰或脓性痰、呼吸急促、发绀，肺部可闻及湿啰音。胸片提示两肺有散在的絮状阴影。痰培养无致病细菌生长，可分离出流感病毒。可因呼吸循环衰竭而死亡。 （3）中毒型流感表现为高热、休克、呼吸衰竭、中枢神经系统损害及弥漫性血管内凝血（DIC）等严重症状，病死率高。 （4）胃肠型流感除发热外，以呕吐、腹痛、腹泻为显著特点，儿童多于成人。2～3天即可恢复。 （5）特殊人群流感临床表现①儿童流感在流感流行季节。一般健康儿童感染流感病毒可能表现为轻型流感，主要症状为发热、咳嗽、流涕、鼻塞及咽痛、头痛，少部分出现肌痛、呕吐、腹泻。婴幼儿流感的临床症状往往不典型，可出现高热惊厥。新生儿流感少见，但易合并肺炎，常有败血症表现，如嗜睡、拒奶、呼吸暂停等。在小儿，流感病毒引起的喉炎、气管炎、支气管炎、毛细支气管炎、肺炎及胃肠道症状较成人常见。②老年人流感65岁以上流感患者为老年流感。因老年人常存有呼吸系统、心血管系统等原发病，因此老年人感染流感病毒后病情多较重，病情进展快，发生肺炎率高于青壮年人，其他系统损伤主要包括流感病毒性心肌炎导致的心电图异常、心功能衰竭、急性心肌梗死，也可并发脑炎以及血糖控制不佳等。③妊娠妇女流感中晚期妊娠妇女感染流感病毒后除发热、咳嗽等表现外，易发生肺炎，迅速出现呼吸困难、低氧血症甚至急性呼吸窘迫综合征可导致流产、早产、胎儿窘迫及胎死宫内。
一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。 （二）病毒核酸提取 1.实验材料及仪器
流感防治知识宣传单
流行性感冒防控知识宣传单 流行性感冒是流感病毒引起的一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道传染病。典型的临床症状是：起病急骤，畏寒、发热，体温达39-40℃甚至更高。伴头痛，全身酸痛等，以全身中毒症状重而呼吸道卡它症状较轻为特征，常有咽痛，少数有鼻塞、流涕、呕吐、腹泻等。流感病毒的特性是易发生变异，传染性强，传染源为流感患者及隐性感染者，发病后1~7天有传染性，传播途径以空气飞沫传播为主，人普遍易感。流感与普通感冒的鉴别诊断：普通感冒为多种病毒引起，多为散发，起病较慢，上呼吸道卡他症状如（喷嚏、鼻塞、流清水样鼻涕，咽痛等）明显，也可出现流泪、味觉迟钝、呼吸不畅、声嘶、少量咳嗽等。一般无发热及全身症状，或仅有低热、轻度畏寒和头痛，一般5~7天痊愈。 一、怎样预防流感 ★预防接种：流感疫苗的免疫效果极好，接种对象为老人、儿童、免疫力低下及可能密切接触患者的人员；接种时间为每年9-11月，每年接种1次。 ★平时养成良好的个人卫生习惯。勤洗手、勤晒衣被，多饮开水，多吃清淡食物。★均衡饮食、加强营养、适量运动、充足休息，增强抵抗力。 ★室内经常开窗通风，保持空气流通。 ★流行高发期避免孩子到人多拥挤的公共场所，不到病人家串门，减少患病机会。★十五字防病口决：勤洗手、勤晒被、多通风、喝开水、吃熟食。 二、学校发生流感疫情后应采取的控制措施 1、及时采取措施做好流感病人的隔离工作。一旦学校发现流感个案病例发生，校方要立即启动晨检制度，由校医或各班班主任负责，凡发现疑似流感的学生，一律通知家长带患者到医院诊治，确诊后则要求患者马上离校，居家隔离休息治疗（病人隔离期为发病之日起满7天），凡未到隔离期的决不允许复课，坚决控制传染源，保护更多学生不被传染。 2．开展环境通风和消毒工作。有疫情的学校所有教室、宿舍、食堂、厕所等公共场所由校方组织人员开展卫生大扫除，进行环境密闭消毒30分钟（可用食醋薰
?专题笔谈?病 毒 感 染 流感病毒分子生物学研究进展 中日友好医院(100029) 安 菁 林江涛 流感病毒是研究最早的病毒之一,主要原因与流感的严重危害有关。流感发作快、传播迅速,短时间内可造成局部地区的爆发或全球范围的流行,导致灾难性的后果。从19世纪以来,已出现四次全球性的流感大流行,最严重的一次(1918～1919年)全世界死于流感的人数超过20万。几十年来,人们作了大量的工作,试图运用分子生物学的手段从机理上揭示流感病毒感染性与致病机制,以研究有效的防治(如监测、疫苗)手段。 1 流感病毒的基因组结构 流感病毒属于正粘病毒科,是RNA病毒。依据其核蛋白(NP)抗原性的差异分成A、B、C三型,这三个型分别在基因组结构、多肽组成、感染性和致病性等方面存在差异。 流感病毒为有包膜的病毒,包膜分内、外两层。内层包膜由基质蛋白M1构成,M1在颗粒核蛋白体(vRNP)的胞质、胞核间的有序转移及病毒体的成熟过程中具有重要的调节作用。外层包膜由一脂质双层构成,其上面嵌有三种病毒蛋白:具有血凝素活性的蛋白质H A、具有神经氨酸酶活性的蛋白质NA和基质蛋白M2。包膜内为病毒基因组与病毒RNA聚合酶亚单位P B1、P B2、PA以及NP形成的具有特定空间构象的结构,称为vRNP,具有依赖RNA的RNA 聚合酶活性。 流感病毒基因组由7个(C型病毒)或8个(A、B 型)分节段的单股负链RNA构成,每个RNA节段的两端都有相对保守的非编码序列,如5′端存在13个核苷酸,3′端存在12个核苷酸,且5′端与3′端反向互补形成锅柄结构。这些结构参与病毒vRNA的复制和mRNA的转录,在RNA聚合酶结合活性、启动子活性、poly(A)化作用以及激活核酸内切酶活性中具有重要作用,是流感病毒复制、转录、包装的重要调控成分。每个RNA节段包括至少一个开放阅读框架(ORF),如:A型流感病毒的各RNA节段及其编码的病毒蛋白为RNA1-P B2、RNA2-P B1、RNA32PA、RNA4-H A、RNA5-NP、RNA6-NA、RNA7-M1和M2、RNA32PA、RNA8-NS1和NS2等。 2 流感病毒的复制及调控 流感病毒大多在宿主细胞核中复制其基因组,通过质膜或细胞器膜芽生形成成熟的病毒颗粒。流感病毒基因组为负链RNA,与具有活性的转录酶复合物和其他负链RNA病毒相同,vRNA、cDNA和cD2 NA转录形成的RNA均不具有感染性,只有形成RNP并转染宿主细胞后才能在宿主细胞内起始病毒基因的复制和表达。 流感病毒侵入宿主细胞依赖于H A的凝集素位点与宿主细胞表面的唾液酸的结合。H A介导病毒包膜与内体膜的融合,使病毒壳衣壳释放进入胞质。流感病毒的脱壳与内体的低pH环境引发的病毒核衣壳结构改变有关,但低pH诱导核衣壳结构改变的分子机制尚不清楚。当病毒脱壳,vRNP在ATP供能的条件下,很快通过宿主细胞核孔复合物(NPC)向核内转运。vRNP向宿主细胞核内转运的调控与NP 和胞质因子NPI21、核转运受体、Ran(T C4)及P10 (NTF2)有关。只有当vRNA与NP同时存在时,vRNA 才可转运到细胞核内。流感病毒蛋白的合成分两个时项。NP、RNA聚合酶亚基和NS1在感染后最初2～3小时即生成。其他蛋白质如H A、NAM1、M2和NS2合成较晚。病毒蛋白的合成可能受到病毒mR2 NA向核外运输的调节,并可能与病毒蛋白NS1的功能有关。对病毒蛋白合成时间的控制在病毒感染周期中具有重要作用,与病毒核衣壳的组装、vRNP的成熟和释放等相关。流感病毒在特定时间内合成的蛋白成分均要通过宿主细胞的介导进入核内以完成vRNP的组装。构成vRNP的主要蛋白成分是NP,为子代vRNA的合成所必需,在RNA复制的同时,子代vRNA随即与NP形成具高级结构的子代vRNP。病
【产品名称】 通用名称：甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法） 英文名称：Alere BinaxNOW? Influenza A＆B Card 【包装规格】 22人份/盒。 【预期用途】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）是一种体外免疫层析试验，用于定性检测鼻咽拭子样本中的甲、乙型流感病毒核蛋白抗原，可快速地对甲、乙型流感病毒感染做出辅助鉴别诊断。 试验简介 流感是发生在呼吸道的具有高度传染性的急性病毒感染，它属于传染病范畴，可通过咳嗽或打喷嚏时排出的带有活病毒的气溶胶而在人与人之间传播。每年的秋季和冬季都可爆发流感1.甲型流感病毒的流行性比乙型流感病毒流行性要强，造成的病情也更严重，并且大多数严重的流感也都是由它引起的，而乙型流感则相对比较缓和。 针对甲、乙型流感的快速诊断试验对获取有效的抗病毒治疗是很有意义的。对流感做出快速诊断不但可减少病人住院的天数，减少抗菌素的使用，而且可减少病人的住院费用1。 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）提供了一种用鼻咽拭子标本对甲型和乙型流感进行简便快速诊断的方法，使用方便，结果快速，在急诊检验中提供的信息可帮助医生选择治疗方案并做出是否需要收住院的决定。 甲型流感病毒有许多亚型，有些亚型可在鸟类中发现3。1997年首次报道人类甲型禽流感（H5N1，主要发生于鸟类的一种流感病毒亚型），此后，在人群中出现了H5N1病例，使人们对H5N1关注起来，H5N1的变异使得它更易在人群间传播4，由于备案的禽流感感染病人比例很低，快速试验在该类病人治疗中利用度尚不得知。 【检验原理】 甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）使用的是薄膜免疫层析技术，它利用具有高度敏感性的单克隆抗体来检测鼻咽拭子标本中的甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原这些单克隆抗体连同一种对照抗体分别被固定到膜支持物上，形成三条独特的线。膜支持物跟其他试剂/垫结合在一起构成检测条。检测条位于一个称作检测卡的书型铰链状的纸板中。 拭子标本需要进行预处理：用洗脱液、盐水或转移介质等将标本从拭子中洗脱出来，将标本加到检测条顶端，闭合检测卡，15分钟时根据是否出现紫红色样品线来报告结果。在有效试验中，蓝色对照线变为粉红色。 【主要组成成分】 提供的材料 1.检测卡：22人份。包含对甲型流感病毒核蛋白抗原具有高度特异性的单克隆抗体、结合
株洲市中心医院 流感防治知识培训考试试题 科室：姓名：得分： 一、判断题（每题1分，共10分） 1.血凝素是流感病毒的主要表面抗原，诱导机体产生中和抗体。（√） 2.流感病毒不断引起流感流行，主要是其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性容易发生 变异所致，HA变异更快（√） 3.乙型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行。（×） 4.流感患者气管深部咳痰或气管吸出物检测阳性率明显高于上呼吸道标本。（×） 5.人感染流感病毒时血常规化验，白细胞总数一般不高或降低，重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低。（√） 6.甲型流感血生化检查可伴有酶学的改变及C反应蛋白升高，肌红蛋白升高。（√） 7.血凝素能水解细胞膜上各种多糖受体末端的唾液酸，促使流感病毒的释放（×） 8.目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的 Yamagata系。（√） 9.流感病毒可以说是世界上变异最快的病毒，而乙型流感病毒是变异最为频繁的一个类型（×） 10.甲型流感抗病毒治疗有效，抗病毒药物应尽量在发病48小时内使用。（√） 二、单选题（每题3分，共30分） 1、容易感染人类的流感病毒亚型是（） A、H7N9 B、H1N1 C、H5N1 D、H5N6 2、属于高致病性禽流感病毒的亚型是（） A、H7N9 B、H10N8 C、H5N1 D、H1N1
3、流感病毒侵入人体后，主要与（）结合进入细胞 A、上呼吸道的唾液酸α2-6受体 B、下呼吸道的唾液酸α2-6受体 C、上呼吸道的唾液酸α2-3受体 D、下呼吸道的唾液酸α2-3受体 4、对于甲型流感传染性，描述正确的是（） A、容易感染人类，容易在人际间传播 B、不容易感染人类，有限的人传人 C、容易感染人类，有限的人传人 D、不容易感染人类，但容易在人际间传播 5、流感病毒的主要传播途径（） A、呼吸道传播 B、消化道传播 C、血液传播 D、垂直传播 6、对疑似或确诊禽流感患者进行气管插管操作时，医务人员应戴（）、护目镜及穿隔离衣。 A、外科口罩 B、一次性医用口罩 C、医用防护口罩 D、脱脂棉纱布口罩 7、.对疑似或确诊人感染H7N9禽流感患者应采取的措施不适宜的是（） A、及时进行隔离，并按照指定路线由专人引导进入病区 B、病情允许时，患者应戴一次性口罩 C、指导患者注意呼吸道卫生和手卫生 D、患者出院后，需进行终末消毒 8、流感病毒感染后发病几天内应用奥司他韦疗效最佳( ) A、2天内 B、6天内 C、4天内 D、3天内 9、1、不明原因肺炎病例的定义描述不正确的是：（） A发热(腋下体温≥38℃)； B.具有肺炎的影像学特征； C.发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少； D.经抗生素规范治疗3~5天,病情无明显改善。
流感防治知识 什么是流感？ 流行性感冒（简称流感）是由流行性感冒病毒（简称流感病毒）引起的急性呼吸道传染病，临床表现为发热、头痛、肌痛、乏力、鼻炎、咽痛和咳嗽，可有肠胃不适，早期与传染性非典型肺炎的鉴别诊断困难。流感能加重潜在的疾病（如心肺疾患）或者引起继发细菌性肺炎或原发流感病毒性肺炎，老年人以及患有各种慢性病或者体质虚弱者患流感后容易出现严重并发症，病死率较高。 流感如何预防？ 由于流感是病毒性传染病，没有特效的治疗手段，因此预防措施非常重要。主要预防措施包括： （一）保持良好的个人及环境卫生。 （二）勤洗手，使用肥皂或洗手液并用流动水洗手，不用污浊的毛巾擦手。双手接触呼吸道分泌物后（如打喷嚏后）应立即洗手。
（三）打喷嚏或咳嗽时应用手帕或纸巾掩住口鼻，避免飞沫污染他人。流感患者在家或外出时佩戴口罩，以免传染他人。 （四）均衡饮食、适量运动、充足休息，避免过度疲劳。 （五）每天开窗通风数次（冬天要避免穿堂风），保持室内空气新鲜。 （六）在流感高发期，尽量不到人多拥挤、空气污浊的场所；不得已必须去时，最好戴口罩。 （七）在流感流行季节前接种流感疫苗也可减少感染的机会或减轻流感症状。卫生部制定了《中国流行性感冒疫苗预防接种指导意见》，已刊登在卫生部官方网站。 哪些人应该接种流感疫苗？ 流感疫苗由公民自费并自愿接种。但由当地卫生行政部门根据有关规定组织的群体性接种或应急接种的疫苗由政府免费向 公民提供。一般来说，年龄在6个月以上，没有接种禁忌者均可自愿自费接种流感疫苗。以下人群推荐接种： 1、60岁以上人群； 2、慢性病患者及体弱多病者；
3、医疗卫生机构工作人员，特别是一线工作人员； 4、小学生和幼儿园儿童； 5、养老院、老年人护理中心、托幼机构的工作人员； 6、服务行业从业人员，特别是出租车司机，民航、铁路、公路交通的司乘人员，商业及旅游服务的从业人员等； 7、经常出差或到国内外旅行的人员。 什么人不能接种流感疫苗？ 怀孕3个月以上的孕妇应慎用流感疫苗。此外，以下人群禁止接种流感疫苗： 1、对鸡蛋或疫苗中其他成分过敏者； 2、格林巴利综合症患者； 3、怀孕3个月以内的孕妇； 4、急性发热性疾病患者； 5、慢性病发作期； 6、严重过敏体质者；
一、目的 流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。 二、范围 适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。 三、程序 （一）生物安全要求 H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。 其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。 （二）材料 1．9～11日龄SPF 鸡胚 2．照卵灯 3．70%～75％酒精 4．一次性注射器 5．鸡蛋开孔器 6．蜡或医用胶布 7．液体石蜡 8．15mL 无菌离心管、试管架 标准操作规程（SOP ）——分离方法
9．10mL无菌移液管 10．无菌镊子。 （三）实验步骤 1．验卵 （1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。 （2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。 （3）如何判断鸡胚状态 1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块 2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。 3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。 2．鸡胚接种 （1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。 （2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。 （3）用注射器吸200μL处理过的临床标本，装上16号针头。 （4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位 置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进 入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μL临床标 本。将针头退出至1/2寸，将另外100 μL临床标本注入鸡胚尿囊腔。 （5）用同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。 （6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器桶中。 （7）用蜡或者消毒过的医用胶布封口。 （8）35℃或37℃温箱（哺乳动物流感病毒35℃培养）培养鸡胚2～3天。 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。
流感病毒的快速检测方法一、.................................................................. RT-PCR快速诊断方法 ( 一) 生物安全要求 ( 二) 病毒核酸提取 ( 三) RT-PCR ( 四) PCR 产物纯化 ( 五) 流感病毒RT-PCR检测引物二、........................................................ 免疫荧光方法检测流感病毒 ( 一) 原理 ( 二) 标本处理 ( 三) 间接免疫荧光法 ( 四) 结果判断 三、................. 实时荧光定量PCR( Real-Time PCR) 快速诊断检测 ( 一) 基本原理 ( 二) 实验试剂 ( 三) 实验步骤四、............................................................................. 快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法, 与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、
Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法, 即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应( PCR) 。 流感病毒的基因组是负链RNA, 在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA, 即为cDNA。逆转录酶( RT) 就是用于合成cDNA的多聚酶, 因此, 扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物, 四种脱氧核苷酸( dNTPs) , RNA模板, 逆转录酶及Taq DNA 多聚酶; 首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA, 然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环, 使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求: 生物安全二级实验室, 防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时能够在生物安全二级实验室里进行, 核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。（二）病毒核酸提取
流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。