BACTERIAL ENDOTOXINS TEST <85USP35
*Porti ons of this gen eral chapter have bee n harm oni zed with the corresp onding texts of
the European Pharmacopoeia and/or the Japanese Pharmacopoeia. Those portions that are not harmonized are marked with symbols ( **) to specify this fact. +
这一章节已经和欧洲药典(EP)与日本药典(JP)统一。没有统一的部分已经用**标记出来。
The Bacterial En dotox ins Test (BET) is a test to detect or qua ntify en dotox ins from Gram-n egative bacteria using amoebocyte lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tride ntatus).
细菌内毒素检查法(BET)是通过鲎的阿米巴细胞溶解产物来检测或定量来自革兰氏阴性菌的内毒素。
There are three tech niq ues for this test: the gel-clot tech niq ue, which is based on gel formati on; the turbidimetric tech niq ue, based on the developme nt of turbidity after cleavage of an en doge nous substrate; and the chromoge nic tech niq ue, based on the developme nt of color after cleavage of a syn thetic peptide-chromoge n complex. Proceed by any of the three tech niq ues for the test. In the eve nt of doubt or dispute, the final decisi on is made based upon the gel-clot tech nique uni ess otherwise in dicated in the mono graph for the product being tested. The test is carried out in a manner that avoids en dotox in con tam in ati on.
细菌内毒素检查法有3种：凝胶法，基于凝胶的形成；浊度法，
BACTERIAL ENDOTOXINS TESTUSP32
^Portions of this gen eral chapter have bee n harm oni zed with the corresp onding texts of the Europea n Pharmacopeia an d/or the Japa nese Pharmacopeia. Those portions that are not harm oni zed are marked with symbols (*■?■) to specify this fact. +
This chapter provides a test to detect or qua ntify bacterial en dotox ins that may be prese nt in or on the sample of the article(s) to which the test is applied. It uses Limulus Amebocyte Lysate (LAL) obta ined from the aqueous extracts of circulati ng amebocytes of horseshoe crab ( Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus ) which has been prepared and characterized for use as an LAL Reage nt 余1+
There are two types of tech niq ues for this test: the gel-clot tech niq ues, which are based on gel formation, and the photometric techniques. The latter include a turbidimetric method, which is based on the developme nt of turbidity after cleavage of an en doge nous substrate, and a chromoge nic method, which is based on the developme nt of color after cleavage of a syn thetic peptide-chromoge n complex. Proceed by any one of these tech niq ues, uni ess otherwise in dicated in the mono graph. In case of dispute, the final decisi on is based on the gel-clot tech niq ues, uni ess otherwise in dicated in the mono graph.
In the gel-clot tech niq ues, the react ion en dpo int is determ ined from diluti ons of the material un der test i n direct comparis on with parallel diluti ons of a reference en dotox in, and qua ntities of endotoxin are expressed in USP Endotoxin Units (USP-EU). [NOTE—One USP-EU is equal to one IU of en dotox in.]
Because LAL Reage nts have bee n formulated to be used also for turbidimetric or colorimetric tests, such tests may be used to comply with the requireme nts. These tests require the establishme nt of a sta ndard regressi on curve; the en dotox in content of the test material is determ ined by in terpolati on from the curve. The procedures in clude in cubati on for a preselected time of react ing en dotox in and con trol soluti ons with LAL Reage nt and readi ng of the spectrophotometric light absorba nee at suitable wavele ngths. In the en dpo int turbidimetric procedure the reading is made immediately at the end of the incubation period. In the endpoint colorimetric procedure the react ion is arrested at the end of the preselected time by the additi on of an en zyme react ion-term in at ing age nt prior to the readi ngs. In the turbidimetric and colorimetric kin etic assays the absorba nee is measured throughout the react ion period and rate values are determ ined from those read in gs.
APPARATUS AND GLASSWARE
Depyrogenate all glassware and other heat-stable materials in a hot-air oven using a validated * 口process. 稣Commonly used minimum time and temperature settings are 30 minutes at 250 .
If employing plastic apparatus, such as microplates and pipet tips for automatic pipetters, use only that which has bee n show n to be free of detectable en dotox in and not to in terfere with the
论文关键词: 抗菌药内毒素青霉素结合蛋白 论文摘要: 一些实验研究及临床资料证明,有些抗菌药尤其是β-内酰胺类抗生素在治疗革兰氏阴性菌感染时,有诱导大量内毒素释放的副作用,在临床上可能引起或加重内毒素血症。不同类型抗菌药诱导内毒素释放的程度与其对不同类型青霉素结合蛋白(pbp)的亲和性有关,抗菌药与pbp3或pbp2结合所造成的内毒素释放的量较高。因此在抗菌药的研究设计中,除了要考虑其杀菌效力外,还应考虑可能诱导内毒素释放的问题。在败血症治疗中也应采取合理的治疗方案,以防止或减轻内毒素血症的发生。 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖成分,具有广泛的生物活性。内毒素对机体造成双重影响:少量内毒素刺激机体时,能增强特异性及非特异性免疫力,诱导产生干扰素等;而大量内毒素进入机体循环时,可造成广泛而强烈的病理反应,如弥漫性血管内凝血、多器官功能衰竭及休克等。内毒素在革兰氏阴性杆菌引起的感染性休克中起着关键作用[1－3]。对于革兰氏阴性菌败血症病人,有些广谱抗菌药能有效地控制菌血症,但是临床资料证明病人的死亡率仍然很高,其原因可能与抗菌药诱导细菌释放内毒素有关[4,5]。由于在抗菌药治疗的过程中,随着细菌的裂解,内毒素从细菌的细胞壁外膜释放后进入血液循环,因而可能加重内毒素血症,从而促进一系列的炎症反应,造成机体严重而广泛的病理损伤。 1 抗菌药诱导的内毒素释放 在体外细菌培养系统中,已发现多种抗菌药如β-内酰胺类[6~8]、氨基糖苷类[9]、氟喹诺酮类药物[10]等均能引起不同程度的内毒素释放,其中β-内酰胺类抗生素(如氨苄西林,头孢噻肟,头孢他啶,氨曲南等)能诱导多种细菌包括野生菌和突变菌(如大肠埃希氏菌,铜绿假单胞菌[6~8],肺炎克雷伯氏菌[11],流感嗜血菌[12]等)释放大量的内毒素,在这些抗菌药处理的细菌培养上清液中能检测到内毒素含量比无抗菌药处理者高几倍甚至几十倍。β-内酰胺类抗生素诱导的内毒素释放常常与其造成的细菌溶解伴随发生,并与细菌溶解程度有一定关系。内毒素-细胞因子级联反应所造成的全身炎症过程是发生内毒素休克的重要环节。抗菌药作用于细菌后,由于细菌裂解及伴随的内毒素释放到培养上清液中,其上清液可刺激巨噬细胞及血管内皮细胞等产生大量的肿瘤坏死因子(tnf)和白细胞介素-6(il-6)[13~15],这些炎性因子的大量产生可促进内毒素休克的发生。 有些动物体内实验可观察到与体外实验一致的结果。给大肠埃希氏菌性腹膜炎家兔注射庆大霉素后,动物血液中细菌数量急剧减少,但血浆中内毒素含量较未治疗者明显增高[9]。用氨苄西林治疗幼年大鼠流感嗜血菌性腹膜炎,造成较多的内毒素释放入血液循环[12]。烧伤后感染肺炎克雷伯氏菌的败血症小鼠,经头孢他啶、氨曲南、亚胺培南治疗后,小鼠血液中内毒素含量明显增高,同时内毒素激活巨噬细胞产生大量的il-6[16]。大肠埃希氏菌性脑膜炎家兔,经美罗培南和头孢噻肟治疗后,在脑脊液中可检测到高含量的内毒素,同时脑脊液中tnf 浓度也增高[17]。不同类型的抗菌药所诱导的内毒素释放水平有所不同,如拉氧头孢对菌血症的清除作用与庆大霉素相似,但其诱导内毒素释放的量比庆大霉素高20倍[18]。用d-半乳糖胺处理小鼠后,再造成大肠埃希氏菌性腹膜炎模型,发现用头孢他啶治疗比用亚胺培南治疗引起更多的小鼠死亡,推测头孢他啶诱导更多的内毒素释放[19]。 虽然动物体内的研究结果不能外推到人,但这些研究证据提示了抗菌药促进内毒素释放,加重内毒素血症的可能性。有些革兰氏阴性菌败血症患者在接受抗菌药治疗后,尽管血液中细菌数减少或消失,但大部分病人呈现血浆中游离及总内毒素含量增高(游离内毒素含量升高2~50倍)[5,20]。流感嗜血菌感染的脑膜炎患儿,在接受头孢他啶治疗后,所有患儿脑脊液中游 离内毒素含量均增高,同时脑脊液中乳酸盐及乳酸脱氢酶增高及葡萄糖下降,提示内毒素增高导致炎症加重[21]。用抗菌药治疗泌尿系感染后,尿液培养显示细菌数下降,但尿中内毒素含量却明显增高。内毒素释放的程度与所用的抗菌药种类有关,其中β-内酰胺类抗生素所
目的：规细菌毒素检验操作程序。 围：适用于细菌毒素检查操作。 责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。 容 1准备工作 1.1实验设备及用具 1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时。 1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。 1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管 1.2毒素标准品与实验试剂 1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。 1.2.2细菌毒素检查用水（毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）。 1.2.3细菌毒素国家标准品和工作标准品。 1.2.4 75%乙醇、铬酸洗液。 1.3实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。 1.4恒温水浴箱水浴温度调节到37±1℃。 2鲎试剂灵敏度复核 2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌毒素工作标准品加入1ml 细菌毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。 2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的毒素标准溶液，备用。
例：工作标准品为160 EU/ml 时 30 秒。 2.3取18支0.25 EU/ml 鲎试剂，每支中加入0.1mlBET 水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入0.1mlBET 水作阴性对照。 2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。再次检查温度是否在所要求的围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。 2.5保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到180°，若关形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。（注意：保温盒拿取试管过程应避免受到震动而造成的假阴性结果） 2.6 结果判定 当最大浓度2λ4支管均为阳性，最低浓度0.25λ4支管均为阴性，阴性对照2支管为阴性，实验方有效。如图1
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
内毒素和外毒素
1．外毒素产生菌主要是革兰阳性菌中的破伤风梭菌、肉毒梭菌、白喉杆菌、产气荚膜梭菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌等。某些革兰阴性菌中的痢疾志贺菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肠产毒素型大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等也能产生外毒素。大多数外毒素是在菌细胞内合成后分泌至细胞外；也有存在于菌体内，待菌溶溃后才释放出来的，痢疾志贺菌和肠产毒素型大肠埃希菌的外毒素属此。 外毒素的毒性强。1mg肉毒毒素纯品能杀死2亿只小鼠，毒性比KCN大1万倍。不同细菌产生的外毒素，对机体的组织器官具有选择作用，各引起特殊的病变。例如肉毒毒素能阻断胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，使眼和咽肌等麻痹，引起眼睑下垂、复视、斜视、吞咽困难等，严重者可因呼吸麻痹而死。又如白喉毒素对外周神经末梢、心肌等有亲和性，通过抑制靶细胞蛋白质的合成而导致外周神经麻痹和心肌炎等。 多数外毒素不耐热。例如白喉外毒素在58—60℃经1—2h，破伤风外毒素在60℃经20min可被破坏。但葡萄球菌肠毒素是例外，能耐100℃30min。大多外毒素是蛋白质，具有良好的抗原性。在0.3%—0.4%甲醛液作用下，经一定时间，可以脱去毒性，但仍保有免疫原性，是为类毒素（toxoid）。类毒素注入机体后，可刺激机体产生具有中和外毒素作用的抗毒素抗体。类毒素和抗毒素在防治一些传染病中有实际意义，前者主要用于人工主动免疫，后者常用于治疗和紧急预防。 多数外毒素的分子结构为A-B模式，即由A和B两种亚单位组成。A亚单位是外毒素活性部分，决定其毒性效应。B亚单位无毒，能与宿主靶细胞表面的特殊受体结合，介导A亚单位进入靶细胞。A或B亚单独对宿主无致病作用，因而外毒素分子的完整性是致病的必要条件。利用B亚单位能与靶细胞受体结合后阻止受体再与完整外毒素分子结合，且B亚单位抗原性强；将B亚单位提纯制成疫苗，有可能预防相关的外毒素性疾病。 根据外毒素对宿主细胞的亲和性及作用方式等，可分成神经毒素、细胞毒
细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 2、实验试剂： ①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。 4、检验方法概述 ①凝胶法：限量法、半限量法 ②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法） 凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式：L≡K／M 式中： L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
For personal use only in study and research; not for commercial use 内毒素和外毒素
1．外毒素产生菌主要是革兰阳性菌中的破伤风梭菌、肉毒梭菌、白喉杆菌、产气荚膜梭菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌等。某些革兰阴性菌中的痢疾志贺菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肠产毒素型大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等也能产生外毒素。大多数外毒素是在菌细胞内合成后分泌至细胞外；也有存在于菌体内，待菌溶溃后才释放出来的，痢疾志贺菌和肠产毒素型大肠埃希菌的外毒素属此。 外毒素的毒性强。1mg肉毒毒素纯品能杀死2亿只小鼠，毒性比KCN大1万倍。不同细菌产生的外毒素，对机体的组织器官具有选择作用，各引起特殊的病变。例如肉毒毒素能阻断胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，使眼和咽肌等麻痹，引起眼睑下垂、复视、斜视、吞咽困难等，严重者可因呼吸麻痹而死。又如白喉毒素对外周神经末梢、心肌等有亲和性，通过抑制靶细胞蛋白质的合成而导致外周神经麻痹和心肌炎等。多数外毒素不耐热。例如白喉外毒素在58—60℃经1—2h，破伤风外毒素在60℃经20min可被破坏。但葡萄球菌肠毒素是例外，能耐100℃30min。大多外毒素是蛋白质，具有良好的抗原性。在0.3%—0.4%甲醛液作用下，经一定时间，可以脱去毒性，但仍保有免疫原性，是为类毒素（toxoid）。类毒素注入机体后，可刺激机体产生具有中和外毒素作用的抗毒素抗体。类毒素和抗毒素在防治一些传染病中有实际意义，前者主要用于人工主动免疫，后者常用于治疗和紧急预防。多数外毒素的分子结构为A-B模式，即由A和B两种亚单位组成。A亚单位是外毒素活性部分，决定其毒性效应。B 亚单位无毒，能与宿主靶细胞表面的特殊受体结合，介导A亚单位进入靶细胞。A或B亚单独对宿主无致病作用，因而外毒素分子的完整性是致病的必要条件。利用B亚单位能与靶细胞受体结合后阻止受体再与完整外毒素分子结合，且B 亚单位抗原性强；将B亚单位提纯制成疫苗，有可能预防相关的外毒素性疾病。 根据外毒素对宿主细胞的亲和性及作用方式等，可分成神经毒素、细胞毒素和肠毒素三大类。细菌的外毒素多数为A-B型分子结构，这类外毒素的作用机制不完全相同，又可分为几种类型：（1）具腺苷二磷酸核糖基转
. 目的：规范细菌内毒素检验操作程序。范围：适用于细菌内毒素检查操作。责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。内容1准备工作 1.1实验设备及用具小时。250℃烘烤1、药匙、1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。1.1.2 剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管1.1.3 内毒素标准品与实验试剂1.2 鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。1.2.1 灭菌注射用水）。1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL 细菌内毒素国家标准品和工作标准品。1.2.3 乙醇、铬酸洗液。1.2.4 75%实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细1.3 60分钟。菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少℃。1371.4恒温水浴箱内水浴温度调节到±. . 2鲎试剂灵敏度复核 2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌内毒素工作标准品
加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。 2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的内毒素标准溶液，备用。 例：工作标准品为160 EU/ml时 0.9ml 0.9ml 0.06EU/ ml 0.125EU/ ml 0.9ml 0.9ml
30注意：每稀释一步均应在混合器上混匀秒。中制0.1ml2.2取2.3180.25 EU/ml 支鲎试剂，每支中加入水，然后分别加入0.1mlBET 支加入4备好的个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加；最后24支，水作阴性对照。0.1mlBET 分钟。放入1372.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入℃±℃水浴锅中，保温±260水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和. . 取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。°，若关内形成凝胶，不变形、不从管壁保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到1802.5（注意：保温盒拿取试滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。管过程应避免受到震动而造成的假阴性结果） 2.6 结果判定支管支管均为阴性，阴性对照2支管均为阳性，最低浓度0.25λ当最大浓度2λ44为阴性，实验方有效。如图1 山东天力药业有限公司 标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B 页码：3/9
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。 3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。按内毒素测量方法检测这些溶液。（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。必要时，重复操作，去除内毒素。用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。 3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。选取有效的滤过膜，确保去内毒素后，培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3—log。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定？ 历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。 8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：
批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱
去内毒素的方法及检查方法 注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。 热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。 【相关链接】热原的危害 一、热原的性质及除去热原的方法 1．高温法 热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 2．吸附法 热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。 3．超滤法 热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法 热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。 5．酸碱法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。 6．其它 包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。 二、热原的检查方法 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。 1．热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。