溶菌酶综述
溶菌酶(Lysozyme，EC3.21.17)又称为胞壁质酶(Murami dase)．化学名称为N一乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-Acety1 muramidi Glrcanohy．dralase)。它于1922年由英国细菌学家费莱明(A，Fleming)在人类的鼻粘液(有的材料为眼泪)中发现的，随后并给它命名为溶菌酶。1963年由乔利斯和坎菲尔德研究了溶菌酶的一级结构。1965年英国菲利普及其同事门用x衍射法解析了溶菌酶，是全世界第一个完全弄清了立体结构的酶，是近代酶化学研究的最太成果之一。它广泛存于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁及组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)，从术瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也分离出溶菌酶，其中，以蛋清中含量为最高．约含0.3％．而人乳、眼泪、唾液中的溶菌酶活性远高于蛋清中的溶菌酶的活力。
溶菌酶是一种碱性球蛋白，其分子由129个氨基酸组成，2200个原子，分子量
14388-18000(14388、14500、18000)，等电点为10.7-11.0，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000，一级结构尚未清楚。人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74％是相同的。Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的．是乳糖合成酶的辅酶。溶菌酶和d-La在生物学上是同源的，但它们的三级结构有很大的区别。它可溶解许多细菌的细胞膜．使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高，如色氨酸的比例较高。酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸，溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1，4)糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。
因此，溶菌酶是一种无毒、无害．安全性很高的高盐基蛋白质．且具有一定的保健作用。它不仅能选择性地分解微生物，而且又不作用于其它物质。该酶对革兰氏的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用，对大肠杆菌、普通变球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度的溶解作用．其最有效浓度为0.05％。其同植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等结合使用，可大大提高其防腐效果。由于溶菌酶对多种微生物有很好地抑菌作用，溶菌酶在食品保藏中的作用引起了广泛的重视，尤其是在日本、加拿大、美国等。
溶菌酶的分类：
溶菌酶的底物特异性很强，不同来源溶菌酶作用的底物不同。按溶菌酶的来源可分为蛋清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶。按作用细胞壁不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶又细分为两种，一种是作用于β-1,4糖苷键的细胞壁溶解酶，另一种是作用于肽链“尾”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。溶菌酶大体分为5种：(1)内N-乙酰己糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键。(2)酰胺酶,切断细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺与肽“尾”之间的N乙酰胞壁酸- L-丙氨酸键。(3)内肽酶,使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂。(4)β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母细胞的细胞壁。(5)壳多糖酶,这是分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶。
溶菌酶的应用：
溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，目前日本已生产出医用溶菌酶，其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。
溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。
目前实际应用的、业已商品化的是鸡蛋清溶菌酶。我国是采用蛋厂鸡蛋壳中残留的蛋清为原料生产的，为白色、无臭结晶粉末，味甜。近年来，人们正研究用微生物发酵法生产溶菌酶，同时还采用酶修饰法先后合成了溶菌酶-环糊精和溶菌酶一半乳甘露聚糖，经过修饰后的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能，应用于发酵饮料中防腐效果较好。此外，由于溶菌酶抗菌谱较窄，只对G+细菌起作用，为了加强其溶菌作用，人们常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用，以增强对G-细菌的溶菌作用，在食品防腐中效果显著。
有关溶菌酶的最新研究进展：
1、溶菌酶可以固定于一些包装纸上，如湿墙纸和玻璃纸上，应用于医院手术室及食品包装。如用提取的蛋清溶菌酶配制(2%～3%)的酶液，喷洒于包装纸上或将包装纸浸入酶液(2～3h)，取出后在温度50～60℃条件下烘干(酶活力基本不损失)，用溶菌酶处理过的包装纸包装煮熟的大豆和新蒸的馒头，结果在贮存近1周的时间内不变味；而用普通纸包装的这些食品贮存1d就会变味(常温下)
发黏。
2、采用固定化技术将溶菌酶固定在HEPA(空气过滤器)上，作为空调的空气净化系统，使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时，先滤集捕捉尘粒和细菌，然后将捕捉到的细菌杀灭。
3、用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖，使其成为能被人体吸收的、低分子量的、有独特的生理活性和功能性质的低聚壳聚糖。
4、海洋溶菌酶在化妆品中具有抑菌的作用。
目前，国内对溶菌酶的研究虽然也取得了一些成果，但由于起步较晚与发达国家之间仍有很大差距。溶菌酶的高端产品主要被美国、日本、加拿大等国公司垄断，我国的溶菌酶只能作为粗品原料出口，而且高端产品还要依赖进口，这些事实严重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。为了打破上述局面，开发应用价值高，具有自主知识产权的溶菌酶相关产品并实现产业国际接轨就显得尤为重要。
我国具有丰富的动植物资源可以为溶菌酶的研究提供更广阔的空间。溶菌酶可作为潜在的抗生素替代品添加剂具有较为广阔的前景。通过基因工程途径生产溶菌酶可能较大程度地降低成本，以推动其在医药业、食品加工业、畜牧业等领域中的应用。
溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
溶菌酶 ----新型免疫抗菌抗病毒药物、饲料添加剂 溶菌酶研发背景： 抗生素是人类应用最广泛的抗菌药物，不仅用于临床，也广泛用于畜禽饲养和农业方面。在过去的50多年中，由于饲用抗生素在养殖中的长期使用导致大量耐药菌株的产生，且病原菌抗药性逐年增强，致使疗效下降，剂量提高，造成动物疾病越防越难防，越治越难治，给养殖业造成很大的损失和危害。同时也给全人类的健康造成严重的影响。因此，世界卫生组织于1994年就细菌耐药性的监测结果给全世界提出了警示：细菌对抗生素产生的耐药性正在以惊人的速度增加，而现在的抗生素药物正在失去原来的疗效。因此寻求广谱、高效的新一代饲用抗菌药物已成为迫在眉睫的摆在人类面前的课题。 澳大利亚昆士兰大学医学系博士生导师、高级研究员王雯禾博士（1993年毕业于英国剑桥大学达尔文学院获微生物营养学博士学位），一直致力于生命科学的研究和发展，历经十多年的研究发现：酶广泛存在于生物体内，参与新陈代谢等多种生理功能，其中对微生物细胞壁具有水解功能的抗菌酶，如溶菌酶lysozyme能够溶解微生物细胞壁而使微生物死亡，而且溶菌酶lysozyme在人和动物的唾液、眼泪、乳汁以及肌体组织中大量存在，是人和动物自身重要的免疫因子，与人和动物的健康息息相关。 溶菌酶lysozyme的溶菌（杀菌）作用与传统的抗生素药物相比，具有对某一病原菌所有血清型都有效的优点，克服了一种抗生素只能预防一种或其中一种血清型病原菌的不足，更不存在药物残留和耐药性的问题。 王雯禾博士认为，溶菌酶lysozyme作为畜禽、水产饲料添加剂在替代抗生素，控制耐药菌，生产绿色肉蛋奶食品方面是最佳的选择。并多次鼓励和支持国内年轻的科学家、学者，致力于这一伟大的、划时代的、对全人类的健康有杰出贡献的产品的开发和研究。并于2003年10月推出最早用于防治动物疾病的产品--溶菌酶系列,由于它不但能溶解（杀死）细菌，增强动物的免疫能力，而且还能和病毒结合使病毒失活，所以它作为预防动物疾病的新型饲料添加剂，正在动物疾病防治的许多领域被广泛应用。·溶菌酶生产原理 ---- 一种基因克隆酶 早在上世纪九十年代早期，荷兰科学家就研制出phyA基因工程菌，成为全世界第一个基因克隆菌的研究成果，作为一个伟大的研究成果在生物领域被迅速推广和使用。 溶菌酶是我们澳洲的研究专家团将来源于健康动物体内的溶菌酶利用分子生物学技术对其进行基因克隆重组进入受菌体，筛选优选优良菌种，通过生物发酵和生物提取工艺以及冷冻干燥技术产生的一种水溶性溶菌（杀菌）蛋白酶。 ·溶菌酶的社会效益 溶菌酶在畜牧业中推广应用，一方面将降低疫病造成的产量下降，减少由此引起的巨大经济损失，大大提高畜牧水产业的经济效益（若按仔猪的死亡率达10-20％，鸡死亡率达20％左右，水产死亡率达30%左右，造成的直接经济损失分别达到2.8亿元以上，4.44亿左右和5.2亿元），另一方面的推广应用能很好的解决家畜家禽水产疫病防治中的药物残留问题，并能改善肉蛋奶的质量，确保食品安全。同时，我国加入WTO后，可促进我国畜禽水产肉蛋奶的出口，增加国家外汇收入。 ·溶菌酶的生态效益 本产品在充分利用自然资源的基础，采用现代生物技术对活性生物成分——溶菌酶进行分离提纯所得到的制剂易泰·溶菌酶，不含激素和化学防腐剂。因此本产品在生产中的应用无毒、无药物残留、不会产生耐药菌株，不但不会对生态环境带来不良影响，还将有利于改善生态环境。 ·溶菌酶系列产品
溶菌酶的研究及应用简介 摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。 关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展 溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。 1 溶菌酶的发现 1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年https://www.doczj.com/doc/744982217.html,schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus
lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。 2 溶菌酶的理化性质、空间结构 2.1溶菌酶的理化性质 溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3围剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下: 2.2 空间结构 溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直
1. 溶菌酶简介 溶菌酶，又称细胞壁水解酶，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1，4糖苷键，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。 2. 溶菌酶的理化性质（可要可不要） 溶菌酶是一种糖苷水解酶，是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白，相对分子质量为14 300，分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构，形成一个椭圆形的外形结构， 溶菌酶纯品为白色粉末结晶，无臭、甜味，易溶于水和低浓度的盐溶液，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃，最适pH为5～7，在低温干燥条件下可长期保存，热稳定性强，耐酸性强，pH为4—7时，100℃下处理45 min仍能保持其酶活性，但在碱性条件下化学性质不稳定，易变性。 3. 溶菌酶的作用 1．抗菌消炎 2．抗病毒：溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 3．增强免疫力：溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。 4．其它方面的药理作用：溶菌酶还具有激活血小板的功能。可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。 5．促进双歧乳酸杆菌增殖：溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细
内容 1：溶菌酶简介 1.1 溶菌酶 溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。 溶菌酶存在 在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。 从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。 溶菌酶生理作用 在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用 2：溶菌酶的种类 溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。 根据来源不同，将溶菌酶分为三类 （1）动物源溶菌酶 ?动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。 ?鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子 量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH 在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍 有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。 鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。 人溶菌酶分子量为14600，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。 （2）植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 （3）微生物源溶菌酶 上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
国内的溶菌酶的应用与发展 溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性{3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在2015%
的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol /L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:内- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内 - N - 乙酰己糖胺酶为例,内- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分
1922年，英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。 由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。 1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。 1.1 细菌溶菌酶细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。 1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。 1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichodermaharzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。 1.2.2 β-葡聚糖酶 β-葡聚糖酶(β-glucanases；EC 3．2．1．39)具有抗真菌作用主要是因为它能水解β(1→3)糖苷键。研究表明：β(1→3)葡聚糖酶对几丁质降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作用。因为许多植物性食品中含有β-葡聚糖成分，它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用，将β-葡聚糖酶加入这类食品，可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和β-葡聚糖，但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其他类型的多糖(甘露聚糖、α-葡聚糖和纤维素)，因此，甘露聚糖酶、α-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。 2 溶菌酶的结构
期 引言 英国细菌学家弗莱明最早在人体的唾 液、眼泪等分泌物中发现了溶菌酶，因为它 能溶解细菌，故称为溶菌酶，它的作用机制 是破坏细菌细胞壁肽聚糖层的N-乙酰胞 壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4 糖苷键，使细胞壁破裂，使细菌溶解。溶菌 酶作为安全的抑菌剂已被应用于食品加 工、疾病治疗等方面，需求量大，所以利用 生物技术大量生产迫在眉睫。此外，关于 “淀粉样纤维”形成基于溶菌酶的研究较为 热门，因此本文将从这两方面进行叙述。 1溶菌酶的结构及其与病理学相关 的研究 溶菌酶是蛋白质，具有高级结构，依靠 疏水作用、氢键等次级键折叠形成一定的 构象，发挥特殊功能。目前，人类最了解的 溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)，它包含一 条肽链，129个氨基酸。4对半胱氨酸残基 间形成4个二硫键，具有大量的α螺旋结 构。HEWL在体外一定条件的诱导下可以 形成“淀粉样纤维”，研究人员发现PH值较 低时，蛋白质逐渐去折叠，随着去折叠蛋白 质浓度的增大，蛋白质之间的疏水作用加 大，逐渐出现“淀粉样纤维”，具有成核效 应。另外在蛋白质变性剂的存在下，溶菌酶 的二级结构发生变化，可能出现“淀粉样纤 维”，但是不同浓度的变性剂对“淀粉样纤 维”的作用也不同，研究还有待深入。陕西 理工大学白瑜博士利用溶菌酶与朊蛋白结 构上的相似性来研究淀粉样纤维的形成机 制，为神经退行性疾病的研究带来福音[1]。 溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，材料 易取，一直被作为一种模型体系，用于研究 蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子 进化、分子免疫间的关系。为优化食品加工 过程、提高食品质量提供理论指导，并为神 经系统等疾病建立了相关蛋白质模型。 目前有研究人员利用溶菌酶为模型 研究盐浓度对蛋白质聚集的影响，对人类 疾病的研究具有重要意义。 2基因工程载体表达溶菌酶的新进展 溶菌酶的用处广泛，但直接从生物体 内提纯效率低，所以其基因的重组和表达 也成为研究热点。鸡溶菌酶的外显子及内 含子序列已经确定，人的溶菌酶基因也逐 渐被解析清楚，为重组表达载体的构建和 优化提供契机。溶菌酶的外源表达包括原 核表达和真核表达，王赞等人通过PCR获 得美洲大鲵i型溶菌酶的基因，并通过构建 原核表达栽体pET28a-pal，诱导表达了美 洲大鲵i型溶菌酶pal蛋白，并通过West- ern-blot和ELISA进行了验证，出现了特异 性条带和免疫反应[2]。李云龙等通过人工合 成奶牛LYZ基因的CDS序列，由于序列较 短，合成片段容易，且保真度较高，所以避 免了RT-PCR中可能会出现的问题，构建 重组表达载体pET32T，PCR克隆筛选出了 阳性菌株，并利用酶切验证成功地构建了 表达载体，SDS-PAGE实验分析重组蛋白 证明已成功实现了溶菌酶大肠杆菌的原核 表达。重组蛋白的表达形式以包涵体的形 式存在，避免了对大肠杆菌的毒性[3]。 考虑到原核表达系统缺少了翻译后修 饰等过程，重组蛋白表达形式为包涵体，其 变性和复性的过程较麻烦，且容易影响蛋 白质的功能，所以目前多使用真核表达系 统，溶菌酶的真核表达体系局限于酵母表 达系统，付世新等人做了牛乳溶菌酶在毕 赤酵母表达方面的分析，他实验已经涉及 了对溶菌酶的基因进行密码子优化，并且 他们进行了牛乳溶菌酶对乳房致病菌的抑 菌分析，实验证明重组牛乳溶菌酶对这些 致病菌均具有抑制作用[4]。宋增健等人利用 NCY-2型毕赤酵母发酵生产溶菌酶，以价 格低廉、营养丰富且稳定性好的麦芽汁为 发酵液，通过探究发酵温度，外加氮源以及 甲醇的添加方式等优化了毕赤酵母的发酵 条件，以期为溶菌酶的工业化生产做出贡 献[5]。黄鹏等人在前人的基础上又做了改 进，他们通过组成型启动子甘油醛三磷酸 脱氢酶（GAP）来代替诱导型醇氧化酶启动 子，获得了高纯度和高活性的rh LysG2，避 免了使用甲醇，因此可以避免碳源间的相 互转化，提高了产量和效率，其中rhLysG2 的酶学性质与普通的C型溶菌酶不同，弥 补了在高渗条件下不能发挥作用的缺陷， 其开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础[5]。 根据表达载体的密码子偏好性，以密 码子优化的方法来加强转基因动物的外源 基因表达是新的研究热点。考虑到蛋白质 分泌的“信号假说”，信号肽的翻译和切除 对蛋白的表达也有影响，已有科研人员通 过对信号肽和人溶菌酶基因的整体优化， 在溶菌酶基因的分泌量方面也有所提升。 3结果与展望 溶菌酶是一种结构清楚、化学性质稳 定、来源广泛的酶，已成为一种模式蛋白用 于研究生理条件的变化对于蛋白质结构功 能的影响，并逐渐应用于人类疾病的研究 上。基于基因工程的溶菌酶的生产目前已 有很多报道，通过将强启动子或者增强子 等调控原件与溶菌酶重组，构建新的表达 载体，或利用乳腺等生物反应器的方法来 扩大溶菌酶的生产有待进一步深入研究。 参考文献： [1]本刊编辑部.蛋清溶菌酶作为朊蛋 白错误折叠和淀粉样纤维形成机制的蛋 白模型研究[J].陕 [2]王赟等.美洲大蠊i型溶菌酶的原 核表达及多克隆抗体制备[J].生物技术通 报,2016,32(01):138~143. [3]李云龙等.奶牛溶菌酶基因的构建、 表达及活性研究[J].家畜生态学报,2018,39. [4]付世新等.牛乳溶菌酶在毕赤酵母 中的分泌表达及活性分析[J].中国预防兽 医学报,2010,32(06):428~431+454. [5]宋增健等.基因重组毕赤酵母产蛋 清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化[J].中 国酿造,2018,37(10):20~24. [6]黄鹏等.利用GAP启动子在毕赤 酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J].中 国生物工程杂志,2018,38(10):55~63. 浅谈溶菌酶的研究进展 河南师范大学生命科学学院王佳雯 摘要：溶菌酶作为一种天然的抗菌剂，广泛存在于人及哺乳动物等的多种组织器官中，良好的杀菌作用使其成为医疗、食品保鲜界的宠儿，应用广泛，为了高效表达溶菌酶，有关利用基因工程技术构建其基因表达载体的研究较多；鸡卵清溶菌酶的结构研究较为清晰，所以目前将其作为一种模式蛋白研究蛋白质的变性、聚集等特性上的报道较多，具有病理学上的意义。 关键词：溶菌酶；淀粉样纤维；原核表达；真核表达 HEBEINONGJI 62 2019年第8
实验一溶菌酶的溶菌作用 实验目的： 1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。 2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。基本原理： 正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富 的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。 溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的B - 1,4 糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对 象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构， 故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。实验材料： 1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。 2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml 原液， 并稀释为100、50、10 ug/ml 标准液，用前保存在冰箱中。 3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3 次，10 分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）； 4、其它：无菌打孔器（孔径2mm ），无菌毛细吸管、毫米尺等。实验方法： 1、制备含葡萄球菌的琼脂平板加热融化3%琼脂，冷至60C ~70C时， 加入1ml 葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。 2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径2mm 左右，孔距5- 20mm 。用针头挑出孔内琼脂， 3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。 4、置24-28 °C下12-18h观察结果。观察各孔周围溶菌情况，测量溶菌环直径。实验结果： 用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对
《食品安全国家标准食品添加剂溶菌酶》 （征求意见稿）编制说明 一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等） (一) 简要的起草过程 根据原卫生部办公厅关于印发《2011年食品安全国家标准制（修）订项目计划（第二批）》的通知，食品添加剂溶菌酶被列入2011年第二批食品安全国家标准制订计划项目。 标准任务下达后，中国食品发酵工业研究院和中国食品添加剂和配料协会针对制定溶菌酶食品安全国家标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工作方案，并于2012年12月组建了标准起草工作组，由中国食品发酵工业研究院负责起草标准文本及编制说明。起草工作组首先查阅相关的国内外技术标准资料，在研究参考这些标准资料的基础上，初步确定了产品的质量技术指标和相应的试验方法，通过进一步的讨论研究、试验比对，形成了行业内标准征求意见稿。 2014年9月开始，起草工作组将标准文本及编制说明的征求意见稿以信件及电子邮件的形式定向发给有关企业和专家，同时在单位网站上刊登了该标准的征求意见稿，广泛征求意见。标准起草工作组认真讨论研究了反馈的意见和建议，对标准文本及编制说明进行了修改和完善，形成了标准征求意见稿（公示稿），上报食品安全国家标准审评委员会秘书处。 （二）主要起草单位 本标准主要起草单位：中国食品发酵工业研究院、中国食品添加剂和配料协会等。 （三）主要起草人 本标准主要起草人：张蔚、潘宏涛、王首锋、王洪荣、卢亚萍、姚粟、陈生红、海瑞、文苓、杜建华、刘波、刘捷、田云翼。负责标准技术资料查询、收集及对比，检测方法的验证比对，样品检测及数据整理，标准文本及编制说明的起草、撰写，行业内征求意见，组织标准的讨论会及标准报送等。 二、标准的重要内容及主要修改情况 本标准的制定在原卫生部公告的基础上，主要参考了FCCⅦLysozyme（溶菌酶）和JECFA （1992）Lysozyme Hydrochloride（盐酸盐溶菌酶），同时结合国内产品的实际情况。表1是国内外食品添加剂溶菌酶质量规格指标对照表。表2为国内外食品添加剂溶菌酶标准试验方法对照表。
＊ “八五”国家科技攻关项目(No .85-722-05-02) 收稿日期:1997-07-18,修回日期:1997-12-25 工程菌人溶菌酶的纯化和性质＊ 叶 军 钱世钧 (中国科学院微生物研究所 北京 100080) 提 要 将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经Ex press -Ion S 阳离子交换柱层析,得到电泳纯的酶,比活达到48000u /mg 。此酶的最适pH 为6.5;等电点为8.91;对溶壁微球菌的米氏常数K m =0.0311mg /m L ;60℃保温30min ,酶活力剩余48.3%。N 末端氨基酸序列除了第一个M et ,其余4个与预期相符。一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同,在0.01mol /L 的浓度下Cu 2+可使该酶完全失活。关键词 重组人溶菌酶,纯化,性质 分类号 Q55 文献标识码A 文章编号 0001-6209(1999)01-0055-59 天然人溶菌酶主要存在于人奶、人胎盘和唾液等中,不易提取,且价格昂贵。而通过人工合成基因,用微生物发酵法生产人溶菌酶将为其在食品、医药等方面的广泛应用提供 有利条件。本实验室已经成功地合成了人溶菌酶基因并构建重组质粒[1～2],在E .coli 中得到了高水平表达[3]。本文在此基础上对该酶进行了纯化,得到SDS -PAGE 纯的酶,并对其性质作了一些研究。 1 材料和方法 1.1 菌种 工程菌株JBP -H LY ,由本课题组构建。1.2 仪器和试剂 Ex press -Ion S 阳离子交换剂、卵清溶菌酶、溶壁微球菌(M icrococcus lysodeikticus )均为Sigma 公司产品。测定等电点的标准蛋白及电泳装置为Pharmacia 公司产品,Ampho -line 为LKB 公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。1.3 菌体制备、粗酶液的提取及酶活性的测定方法见参考文献[3～4]。1.4 人溶菌酶的纯化 将粗酶液经冷冻干燥浓缩,对0.01moL /L ,pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析,再通过经上述缓冲液平衡的Express -Ion S 阳离子交换柱,用0～1moL /L NaCl 进行梯度洗脱。收集活性部分的下柱液,用聚乙二醇反透析浓缩,利用SDS -PAGE 检查纯度。1.5 蛋白含量和等电点测定 蛋白含量用Folin -phenol 法测定[5]。等电点测定参照文献[6]进行。 39卷 1期1999年2月微生物学报Acta Microbiologica Sinica Vol .39February No .1 1999 DOI :10.13343/j .cn ki .wsxb .1999.01.009
试论述噬菌体溶菌机制的研究进展 姓名：caohaichuan 学号：专业：微生物学 摘要：噬菌体（bacteriophage，简称phage）主要通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解及通过溶解酶作用破坏宿主细胞壁，以大肠杆菌单链RNA噬菌体Qβ，真菌线状单链DNA（ssDNA）微小病毒φX174噬菌体和单链DNA噬菌体MS2及大肠杆菌λ噬菌体为例，分别论述噬菌体的两种溶菌机制。λ噬菌体S和R基因分别编码穿孔素（holin）和内溶素（endolysin），形成穿孔素-内溶素（holin-endolysin）系统达到溶解宿主菌的目的。进一步揭示该系统溶解基因的协调作用及相关基因的调控机制。 关键词：噬菌体；溶解酶；细胞壁；穿孔素；内溶素 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌裂解，故称为噬菌体。它在宿主菌内可高效复制,迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒,每一个子代颗粒具备相同的侵袭、繁殖能力,重复4个感染周期后,一个噬菌体颗粒可杀灭数10 亿个细菌,这是噬菌体极具特色的一种生物学特性。其溶菌机制主要包括两个方面，一个是通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解；另外一个方面是通过溶解酶作用导致宿主细胞壁的破坏。这两个方面都能够有效的进行破坏宿主菌细胞壁的合成，从而达到溶菌的目的。基于噬菌体溶菌机制，在治疗细菌感染、消毒以及反生物武器等领域具有良好应用前景，本文从以下几个方面综述其最新研究进展。
1. 噬菌体溶菌机制的研究 噬菌体包括两种类型，温和噬菌体和烈性噬菌体。其中具有溶菌作用的是烈性噬菌体，亦称毒性噬菌体。噬菌体对其宿主菌的溶解是由专一溶解基因编码的特异性蛋白或噬菌体自身蛋白介导的溶解系统统一完成的，这一溶解系统具有一套完整、精密的调节机制和控制体系，而且其作用基质多集中宿主菌的细胞壁上，噬菌体蛋白通过不同的途径影响和破坏宿主菌胞壁质的生物合成及正常结构，从而导致噬菌体宿主菌细胞损伤、死亡。烈性噬菌体成功吸附宿主菌后，就开始穿入溶菌过程，因其结构和基因控制的不同而显示出不同的溶菌机制。 1.1.通过抑制宿主细胞细胞壁的合成导致宿主菌溶解 该机制实际上是小基因组噬菌体的溶菌机制。缺乏溶壁酶的小基因组噬菌体利用多肽在不同阶段抑制宿主菌的胞壁质合成酶，从而在不同阶段溶解宿主菌。例如大肠杆菌单链RNA噬菌体Qβ没有独立的溶解基因，主要利用衣壳蛋白A2参与宿主菌的溶解。A2蛋白是一种多功能的单拷贝蛋白质, 有吸附性菌毛、保护噬菌体RNA抵抗外部核糖核酸酶( RNA酶)、溶解宿主菌的作用。A2蛋白抑制宿主菌胞壁质生物合成关键步骤的催化剂MurA，通过靶向正常细胞胞壁生物合成途径中的不同阶段的酶而导致新合成的肽聚糖降解，从而逐渐使宿主细胞溶解。 此外，真菌线状单链DNA（ssDNA）微小病毒φX174噬菌体只含有10个基因，其溶菌机制是产生单一的溶解蛋白E。蛋白E由必须基因D
1术语和定义 溶菌酶酶活性单位：在25℃、pH值为的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降所需要的酶量为一个酶活性单位U。本定义适合“比浊法”。 溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为u。本定义适合“管碟法”。 2技术要求 2.1外观和性状要求 粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。 2.2技术指标 4.2.1粉酶水分含量：≤12%。 4.2.2粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。 4.2.3粉酶炽灼残渣：≤%。 4.2.4酶活（效价）指标 表1 产品成分分析保证值 4.2.5卫生指标 符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。 3试验方法 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。 3.1外观的测定 取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。 3.2粉酶水分的测定 按GB/T 6435 规定进行检测。 3.3粉酶粒度的测定 按GB/T 5917 规定进行检测。 3.4粉酶炽灼残渣的测定
按《中国兽药典》规定进行检测。 3.5卫生指标的测定 按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。 3.6溶菌酶酶活性（效价）的测定 溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下，通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用，计算出溶菌酶活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法）。 3.6.1试剂和溶液 5.6.1.1溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus） 将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。 使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间，最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。 5.6.1.2磷酸缓冲液 称取磷酸二氢钠（）11.7g, 磷酸氢二钠（）7.86g，加900mL水溶解,调pH值至，定容至1000mL。 5.6.1.310％氢氧化钠溶液 5.6.1.41％硫酸铜溶液 5.6.1.530%三氯醋酸 5.6.1.6斜面培养基：营养琼脂 5.6.1.7抗生素检定培养基II号 5.6.1.8溶菌酶标准品 3.6.2仪器 5.6.2.1分析天平：精密度； 5.6.2.2牛津杯：牛津杯内径±0.1mm，外径±0.1mm，高±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致； 5.6.2.3陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌； 5.6.2.4游标卡尺：精度0.02mm； 5.6.2.5双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡； 5.6.2.6超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备； 5.6.2.7pH酸度计：精确到； 5.6.2.8分光光度计：配10mm比色皿，可在450nm下测定吸光值；
人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达 人溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活性物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。但由于制备材料来源有限,产物分离纯化费用高等因 素,hLYZ的应用受到了极大的限制。本论文旨在利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的hLYZ,以期降低生产成本解决溶菌酶应用受限的问题。 主要研究内容如下:(1)将α信号肽和hLYZ基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重组子K1。K1摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为260 mg·L-1,总酶活为12,937 U·mL-1。 在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW·L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g·L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g·L-1,总酶活达到262,152 U·mL-1。 (2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和hLYZ基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg·L-1,总酶活为16,974 U·mL-1,均优于K1。 在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g·L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U·mL-1,比 K1 略低。 (3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW·L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g·L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g·L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g·L-1。 采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g·L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g·L-1,未出现明显的蛋白降解现
溶菌酶及其在食品工业中的应用 摘要：溶菌酶是一种具有天然活性，安全无毒的生物酶，可专一作用于微生物的细胞壁，从而广泛应用于食品防腐，医疗制品，机体免疫等方面。本文介绍了溶菌酶的结构、性质。对其近年来其在食品工业上的应用进行了综述，并对其应用前景进行了展望。 关键词：溶菌酶；结构性质；食品 Application of Lysozyme in the Food Industry Xiong sizhou Abstract: Lysozyme was a biological enzyme of native active, safe and non－toxic, which was widely used in food preservation, medical production, body immune, etc．In this article, the structure, properties, are summarized. In recent years The application of the enzyme in food industry was also summarized. the prospect of lysozyme was predicted. Keywords: Lysozyme ; Structure and Properties ;Food
作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。 由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。 1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。 1.1 细菌溶菌酶 细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。 1.2 真菌溶菌酶 真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。 1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichoderma harzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。