实验二培养基的配制
一、基础知识
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。飞自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下
（一）按成分的不同分
1．天然培养基。
主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定。这类培养基是实验室和发酵工厂常用的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，玉米粉、黄豆饼粉培养基、血琼脂培养基等。
2．合成培养基
用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，因此也称化学成分明确的培养基(chemically defined medium)，如高氏I号培养基、查氏培养基、M9培养基等。一般用于研究微生物的形态，营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。
高氏I号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物(如各种抗生素、酚等)，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀、如高氏工号培养基中的磷酸盐和镁盐相互混合时易产生沉淀；因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将三种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏工号培养基中的FeS04·7H2O的量只有0.001％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的FeSO4·7H2O贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。
高氏工号培养基配方如下
可溶性淀粉20g
NaCl 0.5g
KNO31g
K2HPO4·3H2O 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4·7H2O 0.01g
琼脂15-25g
水1000 ml
pH 7.4-7.6
3．半合成培养基
在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。例如常用的马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。
（二）按培养基的物理状态分
1．固体培养基
在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、琼脂糖、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基．对其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加入1.5％-2.5％即可凝固成固体。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。
2．半固体体培养基
在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基。例如用琼脂作凝固剂时只需加入0.2％-0.7％。此种培养基常用来观察细菌运动的特征、菌种保存和噬菌体的分离纯化及制备等。
3．液体培养基
不含任何凝固剂，配后成液体状态的培养基。广泛用于微生物的培养，生理代谢和遗传学的研究以及工业发酵等。
（三）按培养基的用途分
1.基础培养基
含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白陈培养基．这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。
牛肉膏蛋白胨培养基是工种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖．
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水1000 ml
pH 7.4-7.6
2．营养培养基(加富培养基)
在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液，血清、动物(或植物)组织液，酵母浸膏或生长因子等．用以培养对营养要求苛刻的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。
血液培养基是一种含有脱纤维动物血(一般用兔血或羊血)的牛肉膏蛋白胨培养基。因此除培养细菌所需要的各种营养外，还能提供辅酶(如V因子)，血红素(X因子)等特殊生长因子。因此血液培养基常用于培养，分离和保存对营养要求苛刻的某些病原微生物。此外，这种培养基还可用来测定细菌的溶血作用。
血液琼脂培养基的配方如下：
牛肉膏3g
蛋白胨10g
NaCl 5g
琼脂15-20g
水1000 m1
pH 7.4-7.6
无菌脱纤维兔血(或羊血) 100ml
3.鉴别培养基
是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基．某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应
可以将某种微生物与他种微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的生理生化鉴定。如用来
检查细菌能否利用不同糖类产酸产气的糖发酵培养基和能否产生硫化氢的醋酸铅培养基等。
4．选择培养基
利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加人这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如分离真菌的马丁氏(Martin)培养基和既有选择柞用又有鉴别作用的远藤氏(Endo)培养基等。微生物遗传学研究中用来选择营养缺陷型的培养基以及分子克隆技术中常用的加抗生素
X-gal(5-溴-4-氧-3-吲哚-
-
βD-半乳糖苷)的培养基等均属于选择培养基。
马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgS04·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4、MgS04·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷、镁离子。这种培养基的特点是培养基中加入的孟加拉红和链霉素能有效的抑制细菌和放线菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真
菌的目的。
马丁氏培养基配方如下：
KH2PO41g
MgSO4·7H2O 0.5g
蛋白胨5g
葡萄糖10g
琼脂15-20g
水1000 ml
pH 自然
此培养液1000 ml 加1%孟加拉红水溶液3.3 ml。
临用时以无菌操作在100 ml培养基中加入1%的子原核微生物0.3ml，使其终浓度为30μg/ml。
二、实验目的
1．明确培养基的配制原理
2．通过对基础培养基的配制，掌握配片培养基的一般方法和步骤
3．通过对高氏I号培养基的配制，掌握配制合成培养基的一般方法。
4．通过对分离直菌的马丁氏（Martin）培养基配制，掌握选择培养基配制方法，并明确选择的原理。
5．掌握血液琼脂培养基的配制方法，明确血液培养基的用途。
三、实验器材
1．溶液或试剂牛肉膏，蛋白质，Nacl，琼脂，1mol/L NaoH，1mol/L Hel, 可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，KH2PO4，葡萄粮，孟加拉红（1%的水溶液），链霉素（1%水溶液）
2．仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养其也装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，PH试纸（PH 5.5-9.0），棉和，牛皮纸，江号笔，麻绳，纱布，装有5-10粒玻璃的无菌三角瓶，无菌注射器，无血平皿等。
3．动物健康的兔或羊
四、实验步骤
（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备
培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒人烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作耍迅速．另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品．瓶盖也不要盖错。
2．溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解(图V—1)。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%-2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细苗生长．
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1m01/L HCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。
pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固．因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH．
4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验勿需过滤)。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图V-2。
(1)液体分装分装高度以试管高度的l/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染．
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞及试管帽等)，以阻止外界微生物进人培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能(棉塞制作方法附本实验后面)。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。(有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。)
8．灭菌
将上述培养基以0.103 MPa，121℃，20 min高压蒸气灭菌。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10．无菌检查
将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。
（二）高氏I号培养基的制备
1．称量和溶化
按配方先称取可溶性粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需少量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100ml 水中加入1g的FeSO4·7H2O配成0.01g/ml，再在1000 ml培养基中加1ml的0.01g/ml的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同实验十六。
2．pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同实验十六。
（三）马丁氏培养基的制备
1．称量和溶化
按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中。将各成分完全溶化后，补足水分到所需体积。再将盂加拉红配成1％的溶液，在1000 ml培养基
中加入1%的孟加拉红溶液3.3 ml，混匀后，加入琼脂加热溶化(方法同前实验)。
2．分装、加塞、包扎、灭菌、无菌检查与前实验相同。
3．链霉素的加入，
将链霉素配成1％的溶液，在100 ml培养基中加1％链霉素液0.3m1，使每毫升培养基中含链霉素30 p8。
由子链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基溶化后待温度降至45~50℃时才能加入。
（四）血液琼脂培养基的制备
1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备
2．无菌脱纤维兔血(或羊血)的制备
用配备18号针头的注射器以无菌操作抽取全血(无菌采血操作见实验五十四)，并立即注入装有无菌玻璃珠(约3 mm)的无菌三角瓶中，然后摇动三角瓶10 min左右，形成的纤维蛋白块会沉淀在玻璃珠上，把含血细胞和血清的上清液倾人无菌容器即得到脱纤维兔血(或羊血)，置冰箱备用。
整个过程必须严格无曹操作；制备脱纤维血液时，应摇动足够时间以防凝固。
3．将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，待冷至45℃一50℃时，以无菌操作按10％加入无菌脱纤维兔血(或羊血)于培养基中，立即摇荡，以便血液和培养基充分混匀， 45℃-50℃加入血液是为了保存其中某些不耐热的营养物质和保存血细胞的完整，以便子观察细菌的溶血作用．同时，在这种温度时琼脂不会凝固。
4．迅速以无菌操作倒人无菌平皿中，使成血液琼脂平板。注意不要产生气泡。
5．置37℃过夜，如无菌生长即可使用。
五、思考题
1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否无菌的？
2．在配制培养基操作过程中应注意些什么问题？为什么？
3. 配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需要另加微量元素?
4. 今有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时要注意各种营养成分的比例?
5．什么是选择性培养基？它在微生物学工作中有何重要性？
微生物培养基的制备及接种 宿舍：628 成员：黄朋朋、李厅、王冲、马浩、王萌、 王锦楼 一、实验原理： 牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养 基，这种培养基含一般细菌生长繁殖所需要的最基本营养物质，培养基含有碳源、氮源、磷酸盐、维生素、生长因子等。 在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。多用于培 养细菌因此要用烯酸和稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于 细菌的生长繁殖。 二、实验器材： 1、试剂：牛肉膏1.8g、蛋白胨6g、食盐11g、琼脂12g、水 600ml、1mol/L NaOH、1mol/L HCl 2、仪器或其他用具：试管56/个、1000ml大烧杯/个、三角 瓶、量筒、玻璃棒、培养基分装器、分析天平、牛角匙、 pH试纸、牛皮纸、记号纸、麻绳、纱布、培养皿、高压 式蒸汽灭菌锅等。 3、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种。 三、实验步骤： 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl
放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2、溶解： 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补 充水分到所需的总体积。配制固体培养基，将称好的琼脂 放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中， 需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的 水分。 3、调pH： 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值， 如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH， 边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。 反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头， 以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。4、分装： 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内,每试管 10ml。如图：
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
[Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O 0.1ｇ Ｎa2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the liquid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌（胚芽乳杆菌）、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ(乳酸菌培养基Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌（胚芽乳杆菌） 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY （蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基）Peptone（蛋白胨）10g Yeast extract （酵母膏）5g Glucose （葡萄糖）1g Distilled water （蒸馏水）1L 8. Glycerol Agar （甘油琼脂） Peptone （蛋白胨）5g Beef extract （酵母膏）3g Glycerol （甘油）20g Top water （自来水）1000ml Agar （琼脂）15g pH 7.0-7.2 9. Rhizobium medium （根瘤菌培养基）AS 9 Yeast eztract （酵母膏）1g Soil eztract （土壤浸提液）200ml Mannitol （甘露醇）10g Agar （琼脂）15g
实验一微生物培养基的制备与灭菌（8课时） 一、目的要求 1、学习配制微生物培养基的一般方法和步骤。 2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。 二、基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 三、实验材料 1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/L HCl溶液。 2、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。 3、其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。 （二）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 1、培养基配制 （1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。 注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 （2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。 （3）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。 注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 2、制备液体培养基 （1）用量筒准确量取20ml培养基，倒入100ml三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。 注意：倒溶液时不要把瓶口沾湿。包扎时不要把瓶子弄倒而把棉塞弄湿。
《水产微生物学》 课程论文 系部：水产系 专业：水族科学与技术 班级：2011级二班 姓名：陈娟 学号：222011602093065 2013年1月4日
微生物与水产养殖的关系 陈娟 西南大学水产系重庆市荣昌402460 摘要：随着水产养殖业的发展,养殖对象逐渐多样化,养殖规模日益扩大,集约化程度也 不断提高。然而养殖区水质却不断恶化,养殖生态系统严重失衡,导致细菌性、病毒性等病害的感染机率也随之增大,使水产养殖业的健康发展受到影响。微生物能够直接或间接的作用于水产养殖业中的作用日益受到重视,这方面的研究也在不断的深入并应用到实践当中。本文将从五个方面系统阐明《水产微生物》这门学科在水产行业中的重要作用。 关键词:水产养殖; 微生物; 应用 1利用微生态制剂代替抗生素防治疾病 目前养殖业中主要使用广谱抗生素来控制病害的发生,但由此产生的副作用以及引起病原菌产生抗药性、毒性、“三致”(致畸、致癌、致突变)等弊端也逐渐显露出来。随着动物微生态制剂在畜牧等方面上的广泛应用,在水产业上的应用也越来越引起人们的重视,其良好的效果也已被大量的试验和生产实践所证实。微生态制剂具有多功能性、广泛的适应性和高度的安全性等特点。实际应用的微生态制品应包括活菌体、灭活菌体、菌体成分、代谢产物及活性生长促进物质[1]。 1986年,Kozasa[2]首次将益生菌应用于水产养殖,用1 株从土壤中分离的芽孢杆菌( B aci l l us toy2oi )处理日本鳗鲡( A n g ui l l a j a ponical ) ,降低了由爱德华氏菌( Edw ardsiel l a)引起的死亡率。此后,微生物制剂在水产养殖中的应用研究迅速发展。据国外的研究报道,一些微生物制剂有抗病毒的作用。Direkbusarakom 等[3]由一种黑色虎虾( Ti gerp raw ns)卵中分离出 2 个溶血性弧菌(V ibrio) NI2CA1030 和NICA1031 ,这些菌株对IHNV 和大马哈鱼表皮病毒有着抗病毒活性抑制作用; Austin等[4]用分离的溶藻弧菌(V . al gi nol y t icus)注射或浸浴大西洋鲑( S almo sals r)时,可抵抗致病性杀鲑气单胞菌( A eromonas salmonici da ) 、鳗弧菌(V .ang ui l l arum)和病毒鱼弧菌(V . pisci um) 等的感染;Bogut 等[5],用微生态制剂溶藻胶弧菌的去细胞上清液冷冻干燥粉能有效抑制病原菌杀鲑气单胞菌、鳗弧菌和病毒鱼弧菌; Gatesoupe[6]研究表明,使用1 株产生铁载体( Siderop hore)的弧菌强化的轮虫可增加大菱鲆( S cop ht hatmus max imus )仔鱼被一致病弧菌感染后的成活率;Ol sson[7]从大菱鲆幼鱼排泄物中提取的肉杆菌( Carnobacteri um)细胞可抑制鳗弧菌的生长,研究认为,大菱鲆肠道和粪便为鳗弧菌生长提供了丰富场所,使用肠道菌的抑制活性可能会降低大菱鲆育苗场鱼类致病性弧菌的生长; Gullian[8]从虾( Penaeus v annamei )的肝胰脏中分离到3 株细菌,分别确认为副溶血性弧菌(V . p arahemol y t icus) p62、p63 和芽孢杆菌p64 ,它们可抑制虾体内的哈维氏弧菌(V . harev y i) S2 ,其死亡率分别可达83 %、60 %和58 % ,而对宿主无致病作用。国内方面,对微生态制剂的研究起步较晚,但发展迅速。桂远明等[9-10 ]用从健康鲤鱼( Cy p ri nus carpio)的肠道中分离出的无毒正常菌群J Y10、J Y31 制成的微生态制品喂饲鲤鱼,其质量增长率、能量同化率、生态生长效率、组织生长效率均高于对照组,后来再将它们制成益生素并添加到饲料中,以该饲料投喂鲤鱼,增加了抗病能力;杨思芹等[11]在人工养殖中国明对虾( Fenneropenaeuschi nensis)时,摄取益生剂组的对虾的活力及抗
培养基 培养基(medium或culturemedium)是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的。任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌，否则很快引起杂菌丛生，并破坏其固有成分和性质。 一、选用和设计培养基的原则和方法 在微生物学研究和生产实践中，配制合适的培养基是一项最基本的工作。但是，许多工作不但要求我们去选用一种现成的培养基，而且还经常要求亲自去设计一种更合适的培养基，这就要求人们除了熟悉微生物的营养知识和规律外，还要有一套科学的设计培养基所应遵循的基本原则和方法。不巧的是，在一般的书籍中，这方面的内容不易找到。为此，这里根据自己的体会，提出了四个原则和四种方法，以作为总结这类工作的一个尝试。 (一)四个原则 1．目的明确在设计新培养基前，首先要明确配制该培养基的目的，例如，要培养何菌？获何产物？用于实验室作科学研究还是用于大规模的发酵生产？作生产中的“种子”，还是用于发酵？等等。 如果某培养基将用于实验室研究，则一般不必过多地计较其成本。但必须明确对该培养基是作一般培养用，还是作精细的生理、代谢或遗传等研究用。如属前者，可尽量按天然培养基的要求来设计，如系后者，则主要应考虑设计一种组合培养基(即“合成培养基”，详后)。拟培养的微生物对象也十分重要。不同大类的微生物，对培养基中碳源与氮源间的比例、pH的高低、渗透压的大小、生长因子的有无以及特殊成分的添加等都要作相应的考虑。 如果某培养基将用于大规模的发酵生产上，则用作“种子”的培养基，一般其营养成分宜丰富些，尤其氮源的含量应较高(即C/N比低)；相反，如拟用作大量生产代谢产物的发酵培养基，则从总体来说，它的氮源含量宜比“种子”培养基稍低(即C/N比高)。除了对不同类型的微生物应考虑其特定条件外，在设计发酵培养基时，还应特别考虑到生产的代谢产物是主流代谢产物，或是次生代谢产物。如属主流代谢产物(一般指通过主要代谢途径产生的那些结构较简单、产量较高、价值较低的降解产物)，则生产不含氮的有机酸或醇类时，培养基中所含的碳源比例自然要比生产含氮的氨基酸类产物时高，反之，生产氨基酸类含氮量高的代谢产物时，氮源的比
36 种微生物常用培养基配制 1. 牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养） 牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCI 5g ,水1000mL pH7.4?7.6。 2. 高氏1 号培养基（用于放线菌培养） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCI 0.5g ，K2HPO4?3H2O0.5g，MgS04?7H200.5gFeS04?7H200.01,水1000mL pH7.4?7.6。配制时注意：可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中。 3. 马丁氏（Martin ）培养基（用于从土壤中分离真菌） K2HPO41g MgSO4?7H2O0.5g蛋白胨5g,葡萄糖10g, 1/3000 孟加拉红水溶液100mL水900mL自然pH, 121C湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却55?60C时加入链霉素（链霉素含量为30 卩g/mL）。 4. 马铃薯培养基（PDA）（用于霉菌或酵母菌培养） 马铃薯（去皮）200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，水1000mL配制方法如下： 将马铃署去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸 30mi n,注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加
糖，再补足至1000mL自然pH,霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。 5. 察氏培养基（蔗糖硝酸钠培养基）（用于霉菌培养） 蔗糖30g, NaNO32g, K2HPO41g, MgSO4?7H2O0.5,gKCl 0.5g, FeSO4?7H2O0.1,水1000mL pH7.0?7.2。 6. Hayflik 培养基（用于支原体培养） 牛心消化液（或浸出液）1000mL,蛋白胨10g,NaCI 5g,琼脂15g, pH7.8?8.0，分装每瓶70mL 121C湿热灭菌15min,待冷却至80C 左右，每70mL中加入马血清20mL 25%羊酵母浸出液10mL 15醋酸铊水溶液2.5mL,青霉素G钾盐水溶液（20万单位以上）0.5mL ,以上混合后倾注平板。 *注意：醋酸铊是极毒的药品，需特别注意安全操作。 7. 麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基） 葡萄糖0.1g, KCl 0.18g ，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g，琼脂 l.5g，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5 C湿热灭菌15min 8. 葡萄糖蛋白胨水培养基（用于V.P.反应和甲基红试验） 蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g, K2HPO4 0.2g,水100mL pH7.2,
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水产微生物学复习辅导资料第一章绪论 一.名词解释 1.微生物：指个体微小，结构简单，肉眼看不见，必须借助光镜或电镜才能看到的微小生物。 2.微生物学：研究微生物形态结构、生理代谢、遗传变异、生态分布、分类进化和生命活动基本规律以及微生物与人类、动植物和自然界的相互关系，并将其应用于农牧渔业、工业、环境保护、医药卫生、生物工程等领域的科学。 3.水产微生物学：是微生物学应用于水产养殖业后而形成的微生物学的一个分支学科。它是在研微生物学的—般理论和技术的基础上，研究微生物与水产环境、水生动物疾病、水产品的关系，旨在改善养殖环境、防治水产动物疾病和防止水产品腐败变质。 二、杂题 1.原核细胞型微生物有：细菌、放线菌、霉形菌、立克次体、衣原体、螺旋体、蓝细菌。 2.真核细胞型微生物有：真菌（酵母菌、霉菌）、原生动物等。 3.按结构差异，微生物的类型分为三类：非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物。非细胞型微生物主要是病毒。 4.病原微生物的致病性检测技术有：检样处理、细胞与动物接种、MLD和LD50测定、致病因子分析等。
5.用于微生物的免疫学技术主要是：抗原和抗体的制备、凝集、沉淀和抗体标记技术等。 6.研究病毒大小和形态的方法有：电子显微镜法、超滤膜过滤法、超速离心法和电离辐射与X线衍射法。 三、问（简）答题 1.微生物有那些特性 答： ①个体微小，结构简单。 ②种类繁多，分类广泛。 ○3群居混杂，相生相克。 ④生长繁殖快，适应能力强。 ⑤生物遗传性状典型，实验技术体系完善。 2.微生物有哪些作用 答：（1）有益方面：①推动自然界能量流动和物质循环。②净化环境，维持生态平衡。③维护人和动物健康。④制造加工食品和生物工程。⑤用于生物科学研究和生物工程。 （2）有害方面：某些微生物能引起人和动植物疾病，毁坏工农业产品，农副产品和生活用品 第二章细菌 一、名词解释 1.细菌：是指个体微小、形态与结构简单、具有细胞壁、原始核质，无 核仁和核膜，除核糖体外无其他细胞器的原核生物。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
水产微生物学复习辅导资料 第一章绪论 一.名词解释 1.微生物：指个体微小，结构简单，肉眼看不见，必须借助光镜或电镜才能看到的微小生物。 2.微生物学：研究微生物形态结构、生理代谢、遗传变异、生态分布、分类进化和生命活动基本规律以及微生物与人类、动植物和自然界的相互关系，并将其应用于农牧渔业、工业、环境保护、医药卫生、生物工程等领域的科学。 3.水产微生物学：是微生物学应用于水产养殖业后而形成的微生物学的一个分支学科。它是在研微生物学的—般理论和技术的基础上，研究微生物与水产环境、水生动物疾病、水产品的关系，旨在改善养殖环境、防治水产动物疾病和防止水产品腐败变质。 二、杂题 1.原核细胞型微生物有：细菌、放线菌、霉形菌、立克次体、衣原体、螺旋体、蓝细菌。 2.真核细胞型微生物有：真菌（酵母菌、霉菌）、原生动物等。 3.按结构差异，微生物的类型分为三类：非细胞型微生物、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物。非细胞型微生物主要是病毒。 4.病原微生物的致病性检测技术有：检样处理、细胞与动物接种、MLD和LD50测定、致病因子分析等。 5.用于微生物的免疫学技术主要是：抗原和抗体的制备、凝集、沉淀和抗体标记技术等。 6.研究病毒大小和形态的方法有：电子显微镜法、超滤膜过滤法、超速离心法和电离辐射与X线衍射法。 三、问（简）答题 1.微生物有那些特性？ 答： ①个体微小，结构简单。 ②种类繁多，分类广泛。 ○3群居混杂，相生相克。 ④生长繁殖快，适应能力强。 ⑤生物遗传性状典型，实验技术体系完善。 2.微生物有哪些作用？ 答：（1）有益方面：①推动自然界能量流动和物质循环。②净化环境，维持生态平衡。 ③维护人和动物健康。④制造加工食品和生物工程。⑤用于生物科学研究和生物工 程。 （2）有害方面：某些微生物能引起人和动植物疾病，毁坏工农业产品，农副产品和生活用品 第二章细菌 一、名词解释 1.细菌：是指个体微小、形态与结构简单、具有细胞壁、原始核质，无核仁和核膜，除核糖 体外无其他细胞器的原核生物。 2.菌落：一般经过18-24小时的培养后，单个细菌在固体培养基上或内部生长分裂繁殖成一
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
摘要：1、营养琼脂（普通琼脂）成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤）100毫升琼脂（视天气，琼脂质量而定）制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。用途：作普通琼脂平皿。2、血琼脂平板（BA）制法：取营养琼脂（PH7．6），加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养 1、营养琼脂（普通琼脂) 成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤) 100毫升 琼脂（视天气，琼脂质量而定) 制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。 用途：作普通琼脂平皿。 2、血琼脂平板（BA) 制法：取营养琼脂（PH7．6)，加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾注于平板或分装试管，制成斜面备用。 用途：1．一般棉拭子均接种此培养基。 2．尿液，脓液 3．分离细菌标本用。 3、基础培养基（肉膏汤BB) 成份：蛋白胨10克牛肉膏5克 氯化钠5克水1000毫升 制法：将以上各物称好，加水煮沸溶解，用1NNOH校正PH至7．6，过滤分瓶，121℃高压灭菌，20分钟备用。 用途：1 作耐药试验，增菌用分装小管。 2 作普通琼脂斜面。 4、血液培养基（大管肉汤培养基) 成份：1 新鲜牛肉浸液1000毫升 2 PABA（对氨基苯甲酸〔相当于10mg/毫升〕) 1g% 1毫升 3 MgSO 4 [相当于0．493/100毫升] 49．3% 1毫升 4 枸椽酸钠0．3g 制法：1 将1号，4号混合液，2号，3号液分装高压灭菌。
2 取灭菌1，4号混合液用无菌法加入PABA，MgSO4，再分管，行无菌试验三天方可使用。 用途：作血，骨髓培养用。 5、肠道杆菌培养基（伊红美兰琼脂) 成份：蛋白胨10克乳糖10克 氯化钠5克琼脂25（22)克 水1000毫升2%伊红溶液20毫升 0．5%美兰溶液20毫升 制法：将蛋白胨，氯化钠琼脂称好，加水1000毫升使溶解，校正PH7．4过滤，补足失水，加入2%伊红溶液20毫升，0．5%美兰溶液20毫升，（115℃高压20分钟)，冷却至50℃左右倾注平板，凝固后存冰箱备用。（高压以后方可再加乳糖) 用途：用作分离沙门氏，志贺氏菌属，也作菌群调查。 1 6、罗文斯坦培养基 成份：磷酸二氢钾2．4克硫酸镁0．24克 枸椽酸钠0．6克天门冬素3．6克 纯甘油（丙三醇) 12毫升水600毫升 马铃薯粉30克鸡蛋1000毫升（约3公斤) 2%孔雀绿水溶液20毫升 制法：1 除鸡蛋外（还有孔雀绿)。可将其它物品称好，放入大三角瓶包扎好，高压灭菌。 2 鸡蛋用75%酒精泡30分钟，灭菌法打蛋，倒入盛有玻璃珠的灭菌三角烧瓶内充分将鸡蛋摇散。 3 将各成份按比例配好，分装每管约5毫升。 4 间歇灭菌第一次90℃1小时，第二次80℃半小时，第三次80℃半小时（或放85℃烤箱内连续二次)。 质控标准： 1 灭菌试验合格。 2 接种结核杆菌要求两星期生长良好。 用途：作结核分枝杆菌培养用。
微生物培养基配制 培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。 配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。 注意事項–灭菌锅的使用 ①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀 灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門 進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆 拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套 培养基中的主要成分及其作用： 营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水 常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏 常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖 双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；
醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油） 水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等 抑制剂： 1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率 2、种类： 盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等 染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红 胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐 抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素 指示剂 1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。 培养基的类型： ●根据培养基的物理状态来区分： 1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养 2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定 3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种 4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。 ●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装 瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。 ●根据培养基的用途来区分： 增殖培养基选择培养基鉴别培养基 1、增殖培养基：在普通培养基中加入 一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
水产微生物学 第一章绪论 一.名词解释 1. 微生物：存在于自然界中的一群个体微小、结构简单、必须借助显微镜放大数百倍甚至数万倍才能观察清楚的一类微小生物的总称。 2. 微生物学：是在细胞、分子或群体水平上研究微生物形态结构、生理代谢、遗传变异、生态分布、分类进化和生命活动基本规律以及微生物与人类、动植物和自然界的相互关系，并将其应用于农牧渔业、工业、环境保护、医药卫生、生物工程等领域的科学。 3. 水产微生物学：是微生物学应用于水产养殖业后而形成的微生物学的一个分支学科，其主要任务是在研微生物学的—般理论和技术的基础上，研究微生物与水产养殖环境、水产动物饲料、水产动物疾病和水产品保鲜、贮藏的关系，充分发挥微生物在改善养殖环境、提高抗病力和健康水平、防治水产动物疾病以及防止水产品腐败变质中的作用。 二、杂题 1、原核细胞型微生物：细菌、放线菌、霉形菌、立克次体、衣原体、螺旋体、蓝细菌。 2、真核细胞型微生物：真菌、原生动物等。 3、按结构差异，微生物有三种类型：非细胞型微生物（主要是病毒）、原核细胞型微生物、真核细胞型微生物。 4、病原微生物的致病性检测技术有：检样处理、细胞与动物接种、MLD口LD50测定、致病因子分析等 5、用于微生物的免疫学技术有：抗原和抗体的制备、凝集、沉淀和抗体标记技术等。 6、研究病毒大小和形态的方法有：电子显微镜法、超滤膜过滤法、超速离心法、电离辐射与X线衍射法。 三.问答题 1、微生物有哪些特性？ ①个体微小，结构简单②种类繁多，分类广泛 ③群居混杂，相生相克④生长繁殖快，适应能力强。 ⑤生物遗传性状典型，实验技术体系完善。 2、微生物的主要作用 1 ）有益方面：①推动自然界物质循环和能量流动②净化环境，维持生态平衡 ③维护人和动物健康④ 制造加工食品和工农业产品⑤用于生物科学研究和生物工程 2 ）有害方面：①某些微生物能引起人和动植物疾病 ②毁坏工农业产品，农副产品和生活用品 第二章细菌 一、名词解释 1 、细菌：是指个体微小、形态与结构简单、具有细胞壁和原始核质，无核仁和核膜，除核糖体外无其他细胞器的原核生物。 2、菌落：某个细菌在适合生长的固体培养基表面或内部，在适宜的条件下，经过一定时间培养，多
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。