第14 章微生物的保存技术
工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微
生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA 重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保
存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。
微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不
同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。
与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。
最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30 年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。
14.1 细菌的冻干保存法
14.1.1 一般概念
冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC 在1985 年第16 版《细菌、噬菌体和rDNA 载体目录册》及1987 年第17 版《真菌／酵母目录册》中，记载有
11 000 株细菌、噬菌体和rDNA 载体及 21 000 株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna 等
本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
170 遗传多样性研究的原理与方法
1981；Jong 等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法
（Franks 1985；Berny 等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长
的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106～107 个细胞／ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速
将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（－60℃），再用真空泵除去这
些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5℃的冰箱内。保存温度低（－3 0～－7 0℃）可以延长其活力。当微生物浓度较
高
时，生存率高，保存期也长。长期保存时，贮藏温度越低则越好。
在冻干前一般要加冷冻保护剂，这样可使细胞免除在冷冻初期因形成冰晶而造成的损
害。ATCC 常规用10％脱脂奶或12％蔗糖作为冷冻保护剂，而美国农业部（USDA）的农业研究服务机构的实验人员用牛或马血清作为微生物的冷冻保护剂（Halliday，Baker 1985）。在菌液中加入甘油和二甲亚砜（DMSO）也可防止冷冻中微生物的死亡，但实际操作中应根据不同微生物决定应用或不用防冻剂。
冻干细胞的复苏很简单。只要在室温下打开安瓿，将少量液体营养培养基加入细胞中，再将重新水合的细胞转移到含有益于生长的培养基的容器内即可。
用于冻干的实验设施成本为 2.5 万美元（Colwell 1986），但准备冻干培养物的实际花
销不高。用冻干法保存的细胞其长期活力很好，这种方法也许是目前所使用的微生物保存法中效果较好和最经济的方法（Halliday，Baker 1985）。但有的微生物不适宜应用该技术，如病原微生物在冻干过程中往往由于细胞飞溅而发生污染或感染事故，所以，对于某些病原微生物还必须使用其他的贮存方法保存。
14.1.2 材料
（1）冷冻保护液（肌醇血清营养肉汤）：
肌醇（Sigma，Poole，Dorset，UK） 6.67g
营养肉汤粉（Unipath，Basingstoke，Hampshire，UK） 0.825g
蒸馏水 33.3ml
将上述物质置于一个250ml 的三角烧瓶内溶解和混合均匀后，用120℃高温灭菌15 分钟，冷却后在无菌条件下加灭菌马血清（Advanced Protein Product Ltd．）100ml，混匀后，分装于 5ml
小瓶内。分装好的小瓶在30℃下培养2～3 天，确定无菌后置－30℃下保存，临用前解冻。（2）冷冻管：外径 16mm、长 36mm 的硼硅中性玻璃小管（Schubert Seals，N1595，Gosport，Hampshire，UK），使用前要经160℃灭菌2 小时。
（3）塞子（Type 20133A，Schubert Seals），使用前要加热除去水分（单层放入不锈钢托盘中，置入110℃热风干燥箱中加热2 小时）。
（4）冻干仪（Edwards Freeze-dryer，Modulyo，Crawley，Sussex，UK）。
（5）灭菌塑料加样头（Alpha Laboratories，Ltd．，Eastleigh，Hamp-shire，UK）。（6）铝制封口盖。
14．1．3 方法
（1）先用清洗剂（Flow Laboratories，Thame，Oxfordshire，UK，7 倍无磷实验室用清洗剂）
清洗玻璃珠，然后用0 . 1 m o l／d m 3 H C l 中和玻璃珠上的碱性，反复用自来水冲洗至珠子
第14 章微生物的保存技术171
的PH 值与自来水的pH 值相同为止，再用蒸馏水或去离子水清洗，最后置热风干燥箱内干燥。（2）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在理想的条件下培养（一般用有螺纹盖
的20ml 管装的斜面培养基，将减少污染的机会）。
（3）无菌条件下加 2ml 冷冻保护液到琼脂斜面内。
（4）将细菌与保护液充分混匀，这时的细菌浓度为108～1010 个细胞／ml。
（5）将混匀后的细菌悬液移入剩余的3ml 保护液内再次混匀（操作时要避免产生气溶胶，尤
其是操作病原菌时）。
（6）吸0.5ml 混匀液，加到预先标记好的冷冻管底部，操作时要特别小心，不要使液体漏到
冷冻管外壁，以免造成污染。将塞子塞入冷冻管（但不要塞紧，以便在冷冻干燥仪中抽真空）。（7）将冷冻管放入金属半圆支架上，置入－30℃冰箱内冷冻2 小时，同时将充填物（玻璃珠，
20～30 粒／管）预冷至—30℃，以免将盛有冷冻管的架子移入时冷冻管内的内容物解冻。（8）打开冻干仪的冷凝器开关，关闭冷凝器的排水阀。当冷凝器的温度降至－50℃时，迅速
将充填装置和冷冻管放入冻干室。然后关闭空气阀抽真空。20 分钟后要求真空室的压力到300Pa。
要让冻干仪运行1～24 小时，以便样品完全干燥。
（9）上述工作结束时，在真空条件下转动螺旋起重器，以终止运行。
（10）用高频火花检测器（Edwards High Vacuum）检测冷凝管干燥器和放置期间是否维持真
空环境。冷凝器内发浅蓝色或紫色光表示完全真空，深紫色或不发光表示非完全真空。（11）用铝盖密封冷冻管上的塞子。
（12）小心移去铝盖和拔出塞子，使细菌复苏。
（13）加约0.5ml 营养肉汤到冷冻管内，与冻干的细菌混匀，再将该肉汤接种到肉汤培养基中，并在理想的条件下培养。
（14）移少量（0.1ml）解冻后的菌到营养琼脂板上，检测任何可能的污染。
14.2 病毒的超低温保存法
14.2.1 一般概念
大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲
亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细
胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将
封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。172 遗传多样性研究的原理与方法
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
14.2.2 材料
病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
14.2.3 方法
（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。
（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩
塑料管。
（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号
和存放日期等。
（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。
14.3 低温保存法
14.3.1 材料
（1）培养基：
2 号营养肉汤粉（Unipath） 2.5g
甘油（Sigma） 15ml
蒸馏水 85ml
将上述材料混匀后，分装在5ml 瓶内，在121℃下灭菌15 分钟。
（2）厌氧菌用 BGP 培养基〔其中不加琼脂，而加 15％（体积比）甘油〕：
胰蛋白胨（Unipath） 1.0g
氯化钠 0.5g
牛肉提取物 0.3g
酵母提取物 0.5g
盐酸半胱氨酸 0.04g
葡萄糖 0.1g
磷酸氢二钠 0.4g
第14 章微生物的保存技术173
甘油 15ml
蒸馏水 85ml
将上述材料混匀后，分装在 10ml 瓶内，在 121℃下消毒 15 分钟。以上两种培养基使用前均
能在4℃环境中存放几个月。
（ 3 ）玻璃珠：将直径为2mm 的玻璃珠（ Creative Beadcraft Ltd ； mersham ，Buckinghamshire，UK）按上述冻干法中的清洗法清洗。
（4）冷冻管：在2ml 有盖冷冻管（Nunc，Paisley，Scotland）内存放20～30 粒清洗好的玻
璃珠，盖好盖后置121℃下消毒15 分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。
此外，将超低温冰箱预先冷却到—70℃，灭菌塑料加样头。
14.3.2 方法
（1）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在适宜细菌生长的条件下培养细菌。
（2）无菌条件下加2ml 细菌悬浮液至营养肉汤中。
（3）用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀（细菌的最终浓度为108～1010 个细胞／ml）。（4）按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内，反复吹打几次，使珠子
内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。
（5）吸去冷冻管内多余的液体。
（6）将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然后将架子放入—70℃的冰柜内。
（7）从冰柜中取出一支冷冻管，在无菌条件下打开，用灭菌镊子从管中取出一粒珠子，然后
迅速将管子放回冰柜，以免管子内的其余珠子融解。
（8）直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中，在适当的条件下培养。
14.4 传代培养保存法
尽管与上述方法相比，用传代培养保存法保存微生物的时间较短，且会使微生物在反复
传代和适应的过程中发生变异，但由于其简便易行，加之一些不耐冷冻和干燥处理的微生物还需要用该法保存，所以，传代培养保存法是所有使用微生物的单位都要采用的基本保存法。目前必须依靠传代培养保存的微生物仍为数众多。传代培养保存法主要是保存生活态的微生物，它又分为连续用培养基传代和连续用活宿主传代。斜面保存法和矿物油保存法是传代培养保存的两种最常用的方法。
14.4.1 斜面保存法
斜面保存法是传代培养保存法的具体方法，其优点是简便，易于推广。但用该法保存微
生物的时间不太长。由于在具体操作时需要多次传代，加之斜面培养基中又保持了一定的营养条件，因此，用这种方法保存的微生物还易产生变异。
使用该方法保存微生物时，可将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，培养至菌种充分
生长后，放4℃冰箱中保存。每隔一定时间进行接种培养后再行保存，如此连续不断。一般细菌、酵母、放线菌和霉菌均可用此法保存。
174 遗传多样性研究的原理与方法
14.4.2 矿物油保存法
矿物油保存法是传代培养保存法的变相方法，也较简单，且保存时间可达1 年以上。
矿物油保存法，即是将接种在斜面培养基的细菌经过培养后，加入灭菌的石蜡油并浸盖
住整个斜面（覆盖的深度为2cm ），使之与空气隔绝，以降低微生物的代谢率（ Gherna 1981），再将浸盖有石蜡油的斜面培养菌种置于约4℃或室温保存即可。复苏的方法与常规再
培养的方法类似。尽管这种方法可使保存的细菌3 年内不死，但不适于微生物的长期保存，因为每隔几年就必须复苏、鉴定和再贮存，从而耗费人力和物力。霉菌、酵母菌和放线菌可用该法保存，一些不适于冷冻干燥的微生物用该法保存也有效。
14.5 砂土保存法
产芽孢的细菌或霉菌和放线菌的孢子均可用此法保存。具体操作如下：
用60 目和120 目筛除去砂和黄土中的大颗粒，分别用10％盐酸浸泡2～4 小时，再用水
洗至中性，烘干后按2 份砂:1 份土的比例混匀，装入小试管中高压灭菌（至少3 次），并作
无菌检查，确认无菌后备用。
在培养好的斜面菌种中加入无菌水，做成细菌芽孢或霉菌和放线菌孢子悬液后，取出一
定量加入上述处理好的砂土管中，置真空干燥器内，用真空泵抽干后再将砂土管置入盛有氯化钙干燥剂的容器内，密封后低温保藏即可。芽孢杆菌、产孢子的霉菌以及放线菌可用该法保藏 1～10 年。
少数微生物，如放线菌和一些生活在土壤中的产芽孢细菌能抵抗正常的冷冻操作，并保
持活力和基因的稳定性。以0～－20℃保存在营养培养基中的培养物，其细胞可存活2 年，但一般认为这种细胞会被所形成的冰晶伤害。对某些短期保存的微生物而言，低温保存不失为一种廉价而有用的方法。室温干燥可使大量的微生物死亡（Gherna 1981），但有少数细菌
能够抵抗脱水干燥并存活相当长的时间，产芽孢的细菌特别适用于这种贮存方法。干燥保存法通常将微生物细胞转种在一个灭菌的固体培养基上，然后在真空中脱水。土壤、纸张或陶制有孔培养基（Ceramic bead medium）常用于此类目的。还可先将细胞悬浮在明胶液内，再将这种明胶滴在真空中干燥。一旦脱水，细胞必须保存在干燥器内。如果再放到冰箱内保存，细菌的活力会保持得更长久些。用这种方法贮存的样品复苏后，要用营养培养基再水合和再次培养。该法常用于一些重要细菌属（如根瘤菌）的保存。__
微生物资源的开发与利用
微生物资源的开发与利用 摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。 关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用 1.引言 当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。 生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。 微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端 环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。 2.微生物资源 2.1微生物资源的特点 环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种
不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) , 对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。 微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。 相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。 微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。 微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌 目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。 尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实
微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡
微生物标本采集、送检及处理原则 一、标本采集的一般原则： 1、病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。 2、无菌采集应无污染，严格进行无菌操作。 3、根据目的菌的特性用不同的方法采集适量标本，采集量不应过少。 4、注意在不同病程采集不同部位标本。 5、采集标本时要防止传播和自身感染。 二、标本的处理： 1、标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。脑脊液则要在25 ℃保存，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。对环境敏感的细菌应保温并立即送检。 2、标本中可能含有致病菌，必须注意安全防护。切勿污染环境。对于烈性传染病标本运送时更要由专人运送，严格按规定包装。 3、厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。 Ⅰ血液及骨髓标本： 血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血症的基本方法。如从患者血液中检出细菌，一般应视为病原菌。 常见的病原菌主要有金黄色或表皮葡萄球菌、链球菌（A、B群、肺炎链球菌等）、肠球菌、产单核细胞李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、伤
寒及副伤寒沙门菌和厌氧菌等。 1、采血时间及次数 2、抽血部位及抽血量 3、报告方式：培养5d无菌生长者报告“培养5d无菌生长”。 查见细菌报告菌名和药敏结果。 4、菌血症、败血症的诊断标准：1）两次培养均出现同一种细菌（可排除污染）； 2）发病星期后血中抗体滴度上升。 Ⅱ脑脊液标本： 脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要价值。正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示有细菌性（急性化脓性、结核性等）脑膜炎。 常见的病原菌主要有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、链球菌（A、B群和肺炎链球菌）、葡萄球菌、产单核细胞李斯特菌、结核分枝杆菌等。 1、涂片检查： (1) 一般细菌涂片检查：例如：革兰阴性、凹面相对的球菌，可能是脑膜炎奈瑟菌；链状排列的革兰阳性球菌；长丝状等多形态性的革兰阴性杆菌，可能是流感嗜血杆菌。 (2)结核分枝杆菌涂片检查 (3)新生隐球菌涂片检查
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入
微生物检验标本的正确采集及注意事项 正确采集临床微生物标本，直接影响到微生物培养鉴定结果。据相关统计：微生物标本的检测误差来源：80%来源于分析前20%来源于分析中和分析后其它检验样本的检测误差来源：45%分析前10%分析中（仪器））45%分析后.检验标本采集质量控制的重要性,分析前的误差来源所占比例的这个数据是惊人的，在我们的大型医院都存在这个问题，而在我们医院应该不会低于这个数据。 可靠的检验结果可以指导临床诊断治疗，为临床科学用药和成功的感染控制提供依据，是正确、合理使用抗菌药物，延缓细菌耐药，减少抗菌药物滥用和监测医院感染的第一步，也是最重要的一步。为此应正确采集各种细菌学标本。 一、血液标本的采集 1、采集方法 （1）75%酒精清洁局部皮肤。 （2）待皮肤干后，再用2%—2.5%碘酒从穿刺点中心部位开始消毒，范围不应小于5cm （直径），且不能用手指触摸消毒后的皮肤。 （3）皮肤碘酒干后（约1min），穿刺采集血液，采血量成人5-10ml，婴幼儿1-5ml。 （4）采血后立即在床旁接种培养瓶，并迅速轻摇，充分混匀防止凝固，但又不可剧震以防溶血。 2、注意事项 （1）怀疑菌血症应尽早采血，体温上升（38.5℃）采血可提高阳性率，但也要防止因等待而延误时机。 （2）对已经使用抗菌药物，而又不能停药者，应在抗菌药物浓度最低时采集也即在下次用药前采血。切忌不要在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本，也不能从静脉导管及动脉插管中取血。 （3）培养基与血液之比以10:1为宜，以稀释血液中的抗生素，抗体等杀菌物质；有人主张对接受抗菌药物治疗的病人，培养基与采血量之比可为20:1或大于这个比例。 （4）近年研究表明，将血液注入血培养基前，更换针头反而易导致污染。 （5）每例至少采血两次，间隔0.5-1h，以利于提高阳性率和区分感染菌与污染菌。 （6）疑为细菌性心内膜炎及布鲁氏病的病人，以肘动脉或股动脉采血为宜，除在发热期采血外，并要多次采血（24h 3-4次）和增加采血量（可增加10ml）。 （7）采血后立即送检，如不能立即送检可置室温，而不能放置冰箱。 （8）如临床表现很似败血症，而血培养多次阴性者，提示考虑厌氧菌和真菌感染的可能。 二、呼吸道 1、痰标本 （1）采集方法 ①清晨起床后用凉开水漱口多次，以除去口腔内大量杂菌，用力咳出肺深部的脓痰，置于清洁干燥容器中或无菌管中送检。 ②痰量极少者可用45℃ 3%-10%的氯化钠溶液约25ml雾化。对于咯痰量少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，当其咯痰后用无菌棉棒采集标本。
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
毕业论文(设计)任务书 课题名称生物杀菌素在食品防腐中的应用研究进展 所在系食品系 专业班级发检04-1 学号0 姓名裴蕾 年月日至年月日共周 指导教师签字 系主任签 字 年月日 一、毕业论文（设计）的内容 文章阐述生物杀菌素的基本概念及特点，生物杀菌素在食品防腐中的应用研究概况, 并对生物杀菌素的发展趋势进行展望。 二、毕业论文（设计）的要求与数据 收集生物杀菌素相关资料，论文书写有明确的中心，论述充分并有一定的逻辑性，重点突出，内容应充实完整，格式规范。 三、毕业论文（设计）应完成的工作 1. 文献浏览 2. 确定提纲 3. 撰写初稿 4. 修改定稿
查阅中国期刊网、万方数据库、超星数据库中的相关文献，并参考其他网络资源和图书等纸质资源。 摘要:生物防腐剂是一类新型的安全高效的天然防腐剂，该文阐述生物杀菌素的特点及在食品防腐中应用研究，并介绍了几种主要的生物防腐剂在食品工业中生物杀菌素发展趋势进行展望。 关键词:生物杀菌素;生物防腐剂；食品防腐;食品安全；应用；动向Abstraet:Biological preservation have the natural secure and highly efficient natures. The character and the application of microbial to food preservation are introduced,and introduction about the application of main kinds of biological preservatives and
微生物资源的开发与利用 摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。 关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用 1.引言 当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。 生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。 微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。 2.微生物资源 2.1微生物资源的特点 环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) ,
对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。 微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。 相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。 微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。 微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌 目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。 尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实际存在种类的0.1%~1%。因此, 放线菌还有极其丰富多样的未知种群等待人们去发现 [6]。如日本Takahashi 等[7] 报道, 从不同的环境, 利用特殊的分离方法分离到放线 菌的新种、新属,并从这些放线菌发酵产物中得到许多新结构的活性物质。
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。
方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项： 1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。 常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。 煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min， 超高温杀菌:135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点：保持食品价值和营养
实验十 微生物菌种保藏方法 [日期：2009- 5-30]来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏
5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。
第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
第八章微生物与食品腐败变质 第一节食品的微生物污染及其控制 一、微生物污染食品的来源和途径 （一）食品污染的种类： 生物污染：微生物、寄生虫及虫卵、昆虫 化学污染：农药、工业三废、添加剂、包装材料 物理污染：放射性污染 （二）微生物污染食品的途径： 水的污染：水是作为媒介使微生物污染食品的 土壤的污染：加工的原料在采收时携带了微生物引的 空气的污染：食品暴露在空气中被微生物污染 人为的污染：人接触食品、工作衣帽不清洁等 食品加工用设备、容器、工具的污染：运输工具、生产 二、控制微生物污染的措施 控制食品因微生物的污染而造成的腐败变质，首先应掐断微生物的污染源，其次是抑制微生物的生长繁殖。具体要求如下：
第二节微生物引起食品腐败变质的原理 ?食品中碳水化合物的分解 ?食品中蛋白质的分解 ?食品中脂肪的分解 ?有害物质的形成 第三节微生物引起食品腐败变质的环境条件 一、食品基质条件 食品的营养成分食品的水分食品中的氢离子浓度 1.食品的营养成分 食品的营养成分与微生物生长的适应性 食品的主要营养成分是蛋白质、碳水化合物和脂肪。不同的微生物对它们的利用能力是不同的。 分解蛋白质的微生物： 细菌：芽孢菌属、假单胞菌属 霉菌：毛霉属、根霉属等 分解碳水化合物的微生物：
细菌：芽孢杆菌属 霉菌：曲霉属、根霉属等 分解脂肪的微生物： 细菌：荧光假单胞菌的分解能力较强 酵母：解脂假丝酵母具有一定的脂肪分解能力 霉菌：大部分霉菌具有一定的脂肪分解能力。 2.食品的水分 微生物生长需要水分，水分在某些极限以下时微生物则无法生长。乳粉含水量低于5%时，在密封状态下，不会引起微生物的生长发育。 微生物对水的需求中，影响最大的是水的可利用性，常用水分活度Aw表示 水分活性值（Aw）的概念：食品在密闭容器内的水蒸气压与在相同温度小纯水蒸汽压之比值，食品的Aw值范围为：0≦ Aw≦1 不同类群微生物生长的Aw值 微生物生长Aw值的可变性 3.食品中的氢离子浓度 每一种微生物生长繁殖都有一定的pH值范围：超过该范围，生长就会受到抑制，甚至导致死亡。大部分细菌的生长最适pH值为5.6~7.5。乳酸菌、霉菌酵母在微酸性条件下生长。大肠菌、蛋白分解菌在碱性环境中易生长，酸性条件下则受到抑制。 根据食品经代谢后产生的矿物质残渣或灰分呈酸性、碱性或中性反应可以将食品分为： 酸性食品与非酸性食品：pH值在4.5以上者为非酸性食品（动物性食品和大多数蔬菜）； pH 值在4.5以下者为酸性食品（水果和少数蔬菜） 微生物生长与食品pH值的关系：非酸性食品适宜细菌生长；酸性食品中，酵菌、霉菌和少数耐酸细菌（如大肠菌群）可生长。 二、食品的外界环境条件 1.温度
病原微生物检验标本采集、运送操作规程正确的标本采集，运送，保存和处理对于微生物检验工作质量至关重要，为了准确检出病原菌，避免漏检与误诊，临床医护人员和实验室工作人员应掌握微生物标本的选择，采集，运送，保存及处理的一般原则。 一、标本采集的一般原则 1.早期采集 采集时间最好在病程早期，急性期，且必须在使用抗菌药物之前采集，确保病原菌的检出。 2.无菌操作 采集标本时应尽量减少或避免感染部位附近或皮肤黏膜正常菌群的污染，使病原菌与正常菌群混淆，造成临床误诊。采集的标本应存放在无菌容器内，容器不能使用消毒剂处理，标本中也不能添加防腐剂，以免降低病原菌的检出。3.适量的标本 标本量过少可能导致假阴性结果。 4.适当的采集方法 对于厌氧菌，需氧菌或兼性厌氧菌的采集方法是不同的，用于厌氧菌培养的标本应尽量用注射器采集抽取物，室温保存，不能冷藏和冷冻。 5.盛放标本的容器 采集标本应存放在无菌，防漏，应带有螺旋盖的容器内。 二、标本的运送 1.标本采集后立即送检，若有延迟也应在2小时内送到实验室，否则会影响病原菌的检出，一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。 2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）或组织（小于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。 三、不同标本的采集，运送 （一）血液标本采集，运送
1.血培养指针征 当患者出现：发热（大于38度）或低温（小于36度），寒战，白细胞增多,皮肤黏膜出血，休克，多器官衰竭，血压降低，c反应蛋白升高及呼吸加快，血液病患者出现粒细胞减少，血小板减少等，具备上述一种或几种体征时，临床怀疑菌血症应采集血液标本进行血培养，对入院危重感染患者应在未使用抗菌药物治疗前，及时做血培养。 2.对怀疑菌血症、真菌血症的患者，在考虑使用抗菌药物之前，应立即采集血培养标本。必须同时或间隔短时间内采集２套以上血培养标本。成年患者：推荐同时采集２－３套（不同部位）血培养标本（即双瓶双臂同时采集血培养标本），采血量每瓶不少于5ml;婴幼儿患者：推荐同时采集２次（不同部位）血培养标本,采血量每瓶不少于2ml。（少于病人总血容量的1%）.在采取血培养后的2—5天内，无需重复采取血培养。两个例外：细菌性心内膜炎和金黄色葡萄球菌菌血症。 3.血标本采集的量是影响检出率的最重要的因素。 检出率与采血量成比例增长，每增加1ml的血液，病原菌的检出率就会相应增加。儿童患者血液中病原菌浓度较高，血培养量无需等同于成人。采用一对（需氧瓶+厌氧瓶）组合，比采用二个需氧瓶的组合可检出更多的葡萄球菌、肠杆菌科细菌和厌氧菌。采血量不能满足推荐的量时，应首先满足需氧瓶的需要。 推荐从外周静脉采集血液标本,不推荐静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读。 4.血标本采集的注意事项 在采血之前，血培养瓶的橡皮塞需使用75%酒精消毒并干燥。然后再进行穿刺部位的皮肤消毒。严格按照“酒精、含碘消毒剂、酒精”的消毒步骤操作，并等待足够的消毒时间。严格无菌操作，不允许在皮肤消毒后用手接触静脉，除非带有无菌手套.不推荐采血和接种血培养瓶更换注射器针头;采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室,血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏或冷冻。 (二)痰培养标本采集，运送 1.痰培养指征 上呼吸道感染包括咽炎，喉炎，会咽炎等都可采集鼻，鼻咽，口咽拭子标本
食品微生物学经典试题及答案 单项选择题: 1、下列是原核微生物的是(细菌。 2、第一个发现微生物的是(列文虎克 3、微生物学发展的第二时期,是(巴斯德、科赫奠定了基础。 4、荚膜的主要成分是(糖类。 5、测量细菌的大小用(微米。 6、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 7、培养酵母用(麦芽糖琼脂。 8、一般培养基灭菌的条件是(121°C 15分。 9、放线菌的菌落特征是(干燥、多皱。 10、酵母的无性繁殖主要是(芽殖。 11、霉菌的主要繁殖方式是 (孢子生殖。 12、曲霉孢子是 (外生孢子。 13、霉菌菌落比酵母的要 (大。 14、哪些对病毒的描述是错的(对抗生素敏感。 15、病毒具有(一种核酸。 16、噬菌体可用于(诊断和治疗。 17、能够使细菌和放线菌裂解的是 (裂性噬菌体。 18、可用于细菌鉴定和分型的是 (噬菌体。 19、细菌总数测定的是(全部活细菌数。 20、大肠菌群数量测定的(100 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 21、测定大肠菌群数量的方法,选用的是(37 °C 22、培养酵母菌的温度常选(28 °C 23、配制固体培养基加琼脂量是(2 %。 24、完整测定大肠菌群时间是(72 小时。 25、肉毒杆菌释放的是(外毒素。 26、对面包黏丝病有抑制作用的是(丙酸钙 27、果汁,果酒一般可用(亚硫酸钠防腐。 28、饮料常用防腐剂是(苯甲酸钠。 29、最常用的食品杀菌方法是(巴氏杀菌。 30、同样百分浓度蔗糖的渗透性比食盐(差 10% 。 31、 GMP 是(良好生产规范。 32、属于厌氧微生物的是(肉毒杆菌。
33、酒精消毒的最佳浓度是(75 %。 34、下列是非细胞结构微生物的是(病毒。 35、第一个用固体培养基的是(科赫。 36、芽孢抗热的主要成分是(DPA 。 37、测量细菌的大小用(微米。 38、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 39、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 40、酵母菌的菌落特征是(粘稠、较大。 41、病毒的繁殖主要是(孢子生殖。 42、霉菌的主要繁殖方式是(孢子生殖。 43、青霉孢子是(外生孢子。 44、哪些对病毒的描述是错的(个体极小。 45、病毒具有(二种核酸。 46、噬菌体可用于(鉴定细菌。 47、能够使细菌和放线菌裂解的是(裂性噬菌体。 48、可用于细菌鉴定和分型的是(假根。 49、细菌总数测定的是(醋酸菌。 50、大肠菌群数量测定的是每(1 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 51、制作半固体培养基时加琼脂量是(5 %。 52、完整的大肠菌群测定时间是(一天小时。 53、金黄色葡萄球菌释放的是(外毒素。 54、对面包黏丝病有抑制作用的是(苯甲酸钠 55、果汁,果酒一般可用(山梨酸钾防腐。 56、微生物在生物世界分类系统中占有(4 界。 57、列是原核微生物的是(放线菌。 58、第一个使用琼脂的科学家是(科赫。 59、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 60、测量细菌的大小用(微米。 61、芽孢能够抵抗不良环境的主要成分是(DPA 62、荚膜的主要成分是(多糖。
微生物标本的处理 1.尿液样品采集和处理 通常留取晨起第一次尿液（此时尿液在膀胱内储存4h以上）；尿液采集后要及时送检，并保证2h内接种；不能及时送检和接种时，尿液应置4~8℃冰箱保存；冷藏样品应于8h内接种；怀疑沙门氏菌时，应于发病2w左右采集尿液，怀疑钩端螺旋体感染时，应于发病后2w 采集尿液，上述时间此时阳性率高。尿液微生物学检验样品采集方法如下： （1）中段尿采集法：成年男性和女性分别用肥皂水或1:1000高锰酸钾水溶液清洗尿道口和外阴部，再用灭菌水冲洗尿道口，无菌生理盐水冲去消毒液，然后排尿弃去前段尿液，收集中段尿5~10ml盛于带盖的无菌容器内送检。 （2）导尿法：用导尿管导取10`15ml尿液，置灭菌容器中送检；长期留置导尿管者应更换新导尿管留尿；留置导尿时，用无菌消毒法消毒导尿管外部及导尿管口，用无菌注射器通过导尿管抽取尿液送检（不可采集尿液收集袋中的尿液送检）。 （3）集尿法：怀疑结核分枝杆菌感染时，于清洁容器中留取24h尿液，取其沉渣10~15ml 送检。 （4）耻骨上膀胱穿刺法：培养结果与临床病情矛盾时可采用此法，一般较少应用。（5）肾盂尿采集法：必须由临床医生采集。 注意事项：正常人的尿液是无菌的，除外尿道有正常菌群外，还有条件致病菌，而这些细菌又是尿路感染中常见的致病菌，故应该注意无菌采集。 2.粪便样品采集和处理 (1)采集时间： ①腹泻患者于急性期，尽量在用药前采集粪便； ②伤寒患者于发病2w以后采集粪便； ③怀疑霍乱时立即采集粪便送检。 (2)采集方法： ①自然排便法：取新鲜粪便的粘液、脓血、或絮状物等有意义成分，2~3g或1~2ml，生物菌容器内或置于保存液或増茵液内送检；或疑似霍乱者应置于碱性蛋白胨水中（ph8.6）。 ②直肠拭子法：难以获得粪便或排便困难者及幼儿可采用此法，将拭子前段用无菌甘油或生理盐水湿润，然后插入肛门约4~5cm（幼儿2~3cm），轻轻在直肠内旋转。擦取直肠表面粘液后取出，盛于无菌试管中或保存液中送检。 3.痰及下呼吸道样品采集和处理 （1）自然咳痰法：①晨痰为佳；②先冷开水洗漱、清洁、口腔和牙齿；③再用力咳出呼吸道深部的痰，吐至无菌容器中；④痰量不得少于1ml：⑤痰咳出困难时 可先雾化吸入Nacl溶液（100g/L，加温到45℃）使痰容易咳出。查结核分枝杆 菌，应留取24h痰。 （2）小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子深入咽部，小儿因压舌板刺激引起咳嗽，喷出的肺或气管分泌物粘在拭子上即可送检。 （3）支气管镜、支气管穿刺、支气管肺泡灌洗等采集法，此采集方法必须由医生操作。 ①气管导管法：气管插管吸取下呼吸道痰液。 ②气管镜采集法：用气管镜在肺内病灶附近用导管吸取或用支气管刷直接取得。 （4）呼吸道样品采集方法：鼻咽拭子法，先用清水漱口，对光坐，头向上仰，口张大，用压舌板轻压舌根，用棉拭子在病人咽后壁，悬雍垂后侧涂抹数次，立即
第14 章微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA 重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30 年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC 在1985 年第16 版《细菌、噬菌体和rDNA 载体目录册》及1987 年第17 版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000 株细菌、噬菌体和rDNA 载体及 21 000 株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna 等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜 170 遗传多样性研究的原理与方法 1981；Jong 等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法 （Franks 1985；Berny 等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长 的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106～107 个细胞／ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速 将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（－60℃），再用真空泵除去这 些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5℃的冰箱内。保存温度低（－3 0～－7 0℃）可以延长其活力。当微生物浓度较