高等真核生物的基因组一般具有80 000～100 000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%［1］。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。
由于真核细胞mRNA 3′端一般含有Poly（A）尾，因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的mRNA反转录成cDNA，以cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年Liang等［2］建立了一种差异显示反转录PCR法（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR），为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道［3，4］。然而，尽管应用DDRT-PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：(1) 重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复［5］；(2) 假阳性率可以高达90%［6］；(3) 获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来，针对DDRT-PCR方法的不足，又有几种新的检测差异表达基因的方法出现，现仅就这方面的进展做一简要介绍。
1.基因表达指纹（gene expression fingerprinting，GEF）：GEF技术使用生物素标记的引物Bio-T13合成cDNA第一链，用dGTP对其进行末端加尾，再以富含C的引物引发合成cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链cDNA，以交联有抗生物素蛋白的微球捕获cDNA3′端，以T4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子，并以Bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的PCR 扩增，得到大量的特异cDNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后，固定于微球上的cDNA片段经过一系列酶切，产生的酶切片段从微球表面释放出来，其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列［7］。GEF技术所需的工作量较DDRT-PCR明显减少，由于用酶切反应替代了条件不严格的PCR反应，其重复性也较好，假阳性率低，并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。GEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上，经过几轮酶切之后常会得到1 000～2 000条电泳带，而现有的PAGE电泳很少能分辨超过400条带，故只有15%～30%的mRNA能够被辨认出来，因此得
到的只能是高表达基因。如果希望寻找部分新基因，这是一种比较简单有效的方法；如果希望得到有关某种细胞的基因表达谱，可能比较困难；采用双向电泳技术可能会有所帮助［8］。
2．基因表达系统分析（serial analysis of gene expression，SAGE）：SAGE法的建立基于两条理论。首先，一段来自某个转录子确定位置的核苷酸，其长度只要有9～10个bp，就能够特异地确认该转录子。第二，对短片段标签的链接有利于在同一克隆中对多个标签测序。SAGE也是用生物素标记的Bio-Oligo(dT)为引物合成双链cDNA，然后以限制酶（锚定酶）进行酶切，捕获cDNA3′端。在此处产物被分为两部分，分别与包含有IIS型内切酶（标签酶）位点的A、B 连接子相接。IIS型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外。这样经过酶切，就有可能得到只有9～10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为PCR的模板，以基于A、B连接子的引物进行PCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用锚定酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起（大约为每条包含数十个不同来源的标签），克隆至质粒载体中后集中测序［9，10］。SAGE的最终结果是通过计算机统计得到的，根据某个标签出现频率的高低来判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签，还可以利用13bp的寡核苷酸探针（9bp加上锚定酶识别位点的4bp）对cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，精确到每个细胞中大约有多少拷贝，可以建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。它的缺点在于工作量非常大，有大量的测序及计算机分析任务；而且，对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选cDNA文库是很不严格的，根据我们的经验，往往是假阳性结果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段显示（display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端RFD利用带有“踵”结构的锚定Oligo(dT)引物合成cDNA第一链，以Okayama和Berg的置换法合成cDNA第二链，然后将双链cDNA以限制酶消化。本方法的适配子由A1和A2两条寡核苷酸构成，其序列与所用限制酶识别位点相符合，先将A2的5′端磷酸化，再加入A1退火，就会形成一个Y 型结构；把Y型适配子与酶切后的cDNA片段相连接，以适配子及锚定引物中
所含序列为特异引物进行PCR反应，则只有cDNA3′末端的一段被扩增出来，这时的产物可用凝胶电泳表示出来构成差异表达图谱。对于每次切割6bp的限制酶来说，每种大概只能切割8%的cDNA，因此至少需要12种以上的限制酶才能使所有cDNA都显示出来［11］。cDNA3′端RFD与GEF的思路比较相似，由于它利用多种限制酶进行酶切，因此不会象GEF因凝胶电泳分辨率不够而漏掉信息。它的重复性较好，假阳性率低，尤其是对于已知基因，可以根据选择内切酶的作用位点确定该基因在凝胶电泳中的位置并判断其含量，从而避免了进一步的分析。对于精力有限的研究人员，这可能是个值得一试的方法。cDNA3′端RFD方法也存在一些和DDRT-PCR相类似的缺点，它得到的片段中包含的编码信息比较少，需要多花一些时间对所得到的差异条带进一步分析。
4.分子指数的RNA指纹（RNA fingerprinting by molecular indexing，MI）:MI 是一种能够较好地显示mRNA中编码序列的方法。它利用Ⅱs型内切酶的作用位点在识别位点之外可以形成一个4bp的突出端的特点，设计43共64种（最外侧一个核苷酸随机）适配子，使得获取编码序列片段成为可能。首先是以常规方法合成双链cDNA，用Ⅱ类限制酶进行酶切后连接5′端磷酸化的相应适配子，再以Ⅱs类内切酶酶切后形成一个随机的4 bp突出端，用连接有生物素的64种适配子予以结合，可将这些限制片段分为64类，用包被抗生物素蛋白的磁珠捕获连接产物，就可以利用前后两个适配子所携带的特异序列为引物进行PCR扩增反应，凝胶电泳显示表达差异［12］。由于扩增的序列位于cDNA内部，因此最后得到编码序列的可能性很大，这是该方法最大的优点。鉴于并不是所有cDNA 都含有某一识别位点，故采用不同的内切酶组合。理论上可以显示所有的差异表达基因，但这样一来工作量就变得十分巨大。因此，该方法只适合对样本的快速分析和部分差异表达基因的研究；如果要对某种细胞的基因表达进行全面的研究，可能还要采用其它的方法。
5.抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）: SSH方法源于代表性差异分析法（representational difference analysis' RDA）。它原是一种研究基因组之间差异的以杂交为基础的方法。Diatchenko等［13］将“抑制性PCR”理论［14］与RDA相结合，建立了一种分离差异表达基因的新方法。SSH将需要检测的细胞称为“检测子”，将对照细胞mRNA称为“驱赶子”，把mRNA合成
cDNA后，通过仅仅两轮杂交和PCR过程，就能有效地分离到在检测子中表达，而在驱赶子中不表达或表达丰度不同的mRNA（图5）。通过SSH有可能得到某种细胞中相对其他组织的差异表达基因的全面信息，它较好地克服了其它方法中低丰度基因难以得到的问题，据称对低拷贝基因的富集可以达到 1 000～5 000倍，因此可能发现一些用原有方法没有检测到的新基因。这方面已经有人进行了尝试［15，16］，获得了一些成果。SSH的不足之处在于它需要mRNA的量较大，检测子和驱赶子都要达到2微克以上，这在某些情况下是非常难以做到的，因此目前有关SSH的报道基本上都以肿瘤细胞为研究对象。
基因表达差异的研究方法在DDRT-PCR出现之后又有了很大的发展，每种方法都各有自己的优缺点，研究人员应该根据自己的侧重点选择适合于自己的方法。目前真正能够做到简单、准确、全面地揭示基因表达差异的方法仍在不断探索之中，因此许多研究机构仍采用DDRT-PCR来达到自己的目的，毕竟经过最近数年的完善，该技术在许多方面都有了一定的改进，完成一般的研究项目已是绰绰有余。SSH作为一种基因表达差异研究的新方法，假阳性率低，所得到的结果也更加全面，因此，希望以不太复杂的方法全面揭示差异表达基因的研究者，可以尝试一下这种方法。
如何进行基因表达差异分析？
答：很多RNA-seq实验的目的是为了比较两种或多种样本中基因表达或整个转录组的差异，如比较癌症组织和正常组织的转录组差异等。这些差异既包括通常意义下的差异表达基因，也主要包括选择性剪接模式的差异、剪接异构体表达的差异、非编码转录本的差异等。这些差异一般可以用一些统计假设检验方法检测，但这种检验有时会受到测序深度、基因长度等因素的影响，需要对结果进行仔细分析，消除可能的混杂因素，必要时可以用reads的绝对表达值倍数变化（fold-change）来作为补充。
虽然新一代测序相对第一代测序的单位成本大大降低，但是，利用RNA测序进行基因表达研究的成本仍很高，因此，很多实验室没有条件进行样本重复. 如果两类样本均没有生物重复，例如只对两个细胞系各进行一次mRNA样本测序，则可以用随机采样模型通过假设检验来分析差异表达. 对于某个基因，如果一个read来自于这个基因，我们称事件A发生。对于一次RNA-seq实验，事件A发生的概率可以用这个基因上的read数n除以所有基因上的读段总数N来估计，即RPM. 事件A发生的概率反应了这个基因的表达水平。如果要判断某个基因在两个样本中的表达水平是否一致，就可以通过检验事件A在两种条件下发生的概率是否一致来实现，采用似然比检验、Fisher精确检验以及基于MA 图的统计检验方法等. 同样，也可用RPKM作为统计量来进行假设检验分析，由于是比较同一个基因在两个样本间的差异，基因长度的影响被抵消，用RPKM 和用RPM得到的结果相似。对无生物重复的RNA-seq数据进行差异表达基因分析，已经有几个公开发表的软件，包括DEGseq、Useq、Cufflinks中的Cuffdiff 模块等。
全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp 的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析；
c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300 万~600万个表达标签。
通信作者：吴俊 Email：wujunpostbox@https://www.doczj.com/doc/894718709.html, Gas6（growth arrest specific gene 6）是人类发现的一类新的生长因子，它作用于细胞受体，它的受体属于受体酪氨酸激酶家族，它们包括Sky （Tyro3）、Axl 、Mer ，也统称TAMreceptor （Tyro3，Axl ，Mer ）。随着研究的深入，人们发现，Gas6系统具有广泛的生物学作用。1 Gas6及其受体结构，细胞表达情况（图1） Gas6属维生素K 依赖的蛋白质，广泛表达于各类细胞。它和protein S 具有42%同源性[1]。Axl 普遍表达于各类细胞，Tyro3主要表达于中枢神经系统，而Mer 在单核转化的巨噬细胞较丰富。Axl 、Mer 、Tyro3可以在金属蛋白酶作用下切割，成为可溶性受体（soluble Axl ，sAxl ；soluble Mer ，sMer ；soluble T yro3，sT yro3），血浆中可检测到游离受体。2 Gas6与细胞凋亡 Gas6是一种细胞因子，与细胞生长相关。 Gas6系统研究进展 吴俊（北京大学人民医院 检验科，北京 100037） Gas6具有抗血管内皮细胞、平滑肌细胞凋亡的作用，通过Gas6-Axl-PI3K-Akt 起抗凋亡作用。它可介导凋亡细胞吞噬。目前已知，Gas6对于凋亡细胞的吞噬主要是通过受体Mer 来实现的[2]，Mer 表达于巨噬细胞和树突状细胞[2]，凋亡细胞表达磷脂酰丝氨酸，Gas6或protein S 通过维生素K 依赖的Gla domain 结合凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸[3]，通过吞噬细胞表面的Mer 受体，介导吞噬作用。Gas6调节巨噬细胞的成熟、转移[4]，促进内皮细胞生长并抗凋亡[5]。Mer 受体缺陷导致视网膜色素上皮细胞清除障碍[6,7]，可导致色素性视网膜炎甚至失明。精子细胞的成熟和凋亡也需要通过Gas6系统的调控[8]。 凋亡细胞的稳定清除，避免了进一步的坏死而引发的进一步炎性反应和自身免疫的发生。而可溶性的受体sMer 等可以与细胞表面受体竞争配体，因而起到抑制凋亡细胞清除的作用[9]。Mer 受体对于凋亡细胞诱导的T 细胞耐受有促进作用[10]，调节免疫耐受。 ３ Gas6在炎症和自身免疫中的作用 Gas6与多种炎症相关，包括感染性炎症、血栓性炎症、自身免疫性炎症等。Gas6促进炎症状态下细胞间相互作用[11]，促进炎性反应，扩大血栓形成，促进白细胞穿出[12]。Gas6与C-反应蛋白（CRP ）相独立，是炎症相关独立危险因素。败血症休克患者Gas6浓度升高[13]。Ekman C 等[14]证实Gas6/Axl 在血栓性炎症严重肢端缺血患者体内升高，且与疾病预后相关。急性胰腺炎患者Gas6，protein S 升高[15]。对于多重硬化（multiple sclerosis ，MS ）的患者，增加的可溶性受体Axl ，Mer 和金属蛋白酶ADAM17，ADAM10 正相关，与 图1 Gas6，protein S及其作用的受体结构简图 酪氨酸激酶 抗凋亡（神经保护）生存，抗凋亡增生 迂移 黏附 细胞吞噬 抗凋亡 淋巴细胞增生
基金项目:广东医学科研课题/广东省热点医学科研主题现状研究0(编号:A2006474)。作者简介:钟伟金,男,1976年生,硕士,馆员,研究方向为文献计量分析。 共词分析法研究(三) )))共词聚类分析法的原理与特点 The Research of Co -word Analysis (3) )))The Principle and C haracteristics of the C o -Word Cluster Analysis 钟伟金 李 佳 杨兴菊 (广东医学院图书馆 湛江 524023) 摘 要 共词聚类分析法采用聚类的计算方法,对文章中共现的词对(主题词或关键词)的关联性进行运算,将关系密切的词聚集归类,从而达到挖掘隐含信息的目的。通过对聚类原理的分析,认为该方法具有客观性、科学性、敏感性的特点。并讨论了共词聚类分析法的不足以及其解决办法,最后介绍了共词聚类分析法的最新研究进展。关键词 共词聚类分析法 研究进展 共词聚类原理中图分类号 G251.5 随着期刊数量的增长与学科的细化发展,给情报工作者带来了新的挑战:文献的组织与检索、文献内容的分析评价、文献信息的提取与挖掘。传统的文献检索方式如分类号、主题词、关键词等,由于缺乏文献内容间的联系、智能化检索程度低,在文献呈爆炸式增长的时代,传统的检索方式已难以在查全率与查准率间取得平衡,说明这种信息的组织检索方式难以满足人们的需求。由于人类科研活动及其成果主要是以文献方式记录储存的,因此对文献量与文献主题的统计分析可在某种程度上反映出一门科学在一定时期研究的基本趋势、研究的水平和发展速度[1],文献量的大量增长,无疑给情报人员通过对文献集的分析来评价学科的发展现状的难度,也为情报人员通过文献集提取、挖掘有用的信息带来困难。 为解决这一矛盾,需要采用新的方法来处理组织、整理和分析文献集。新方法应该具有以下三方面的特点:能对文献内容进行识别;能反映文献之间的内容联系;能借助机器进行批量处理。共词聚类分析法是共词分析法中的一种,它的分析对象是科技论文中高度概括文献内容并被专家规范的主题词,研究的是在一篇文献中同时出现的主题词对,通过这种共现的词对把文献集关联起来形成相互关联的网。对这种共词进行聚类统计分析的过程是共词聚类分析的全部。 1 共词聚类分析的原理 共词分析法利用文献集中词汇对或名词短语共同出现的情况,来确定该文献集所代表学科中各主题之间的关系。一般认为词汇对在同一篇文献中出现的次数越多,则代表这两个主题的关系越紧密。由此,统计一组文献的主题词之间两两在同一篇文献出现的频率,便可形成一个由这些词对关联所组成的共词网络,网络内节点之间的远近便可以反映主题内容的亲疏关系。共词聚类分析是共词分析中常用的一种方法,在共词分 析的基础上,以共词出现的频率为分析对象,利用聚类的统计学方法,把众多分析对象之间错综复杂的共词网状关系简化为数目相对较少的若干类群之间的关系并直观地表示出来的聚类的过程。通常在一篇文献中,由多个主题词组合在一起反映文献的内容,这个些主题词因为存在着一定的内容上的联系,而标引到一篇文章中,如果一对主题词同时在多篇文献中出现,则说明这对主题词的关系紧密。在文献群的主题中,通过聚类分析,能把这些关联密切的主题聚集在一起形成类团,表达某一领域分支的组成。类团的组成、演化以及消失是共词聚类分析的重点。 共词在同一篇文献出现的频率的大小,反映主题间关系紧密的程度。在主题词关系网中,有些主题词内容联合紧密,相互靠拢聚集在一块,形成概念相对独立的类团。相互关联的共词网络中,一个主题与多个主题形成关联,相互间构成立体状的关系网,在这种关系网中,很难分辨出由哪些主题词组成类团。为此,要借助数据挖掘中的聚类分析法,对共词关系网络中的词与词之间的距离进行数学运算分析,将距离较近的主题词聚集起来,形成一个个概念相对独立的类团,使得类团内属性相似性最大,类团间属性相似性最小[2]。 1.1 聚类时距离的确定 在进行聚类分析时,类组合的确定有两种概念方式:一是类和类之间的距离;二是点和点之间的距离。类间距离是基于点间距离定义的,比如两类之间最近点之间的距离可以作为这两类之间的距离,也可以用两类中最远点之间的距离作为这两类之间的距离;当然也可以用各类的中心之间的距离来作为类间距离。在计算时,各种点间距离和类间距离的选择是通过统计软件的选项实现的。统计类间的距离时,采用组间距离法(Between-g roups linkage),即两类的平均距离最小。点间距离有很多定义方式,常用的是欧氏距离(Euclidean distance),其算法为[3]: 情报杂志2008年第7期 Journ al of Information No.7,2008
随机信号分析习题一 1. 设函数???≤>-=-0 , 0 ,1)(x x e x F x ，试证明)(x F 是某个随机变量ξ的分布函数。并求下列 概率：)1(<ξP ，)21(≤≤ξP 。 2. 设),(Y X 的联合密度函数为 (), 0, 0 (,)0 , other x y XY e x y f x y -+?≥≥=? ?， 求{}10,10<<< 8. 两个随机变量1X ，2X ，已知其联合概率密度为12(,)f x x ,求12X X +的概率密度？ 9. 设X 是零均值，单位方差的高斯随机变量，()y g x =如图，求()y g x =的概率密度 ()Y f y \ 10. 设随机变量W 和Z 是另两个随机变量X 和Y 的函数 22 2 W X Y Z X ?=+?=? 设X ，Y 是相互独立的高斯变量。求随机变量W 和Z 的联合概率密度函数。 11. 设随机变量W 和Z 是另两个随机变量X 和Y 的函数 2() W X Y Z X Y =+?? =+? 已知(,)XY f x y ，求联合概率密度函数(,)WZ f z ω。 12. 设随机变量X 为均匀分布，其概率密度1 ,()0X a x b f x b a ?≤≤? =-???， 其它 （1）求X 的特征函数,()X ?ω。 （2）由()X ?ω，求[]E X 。 13. 用特征函数方法求两个数学期望为0，方差为1，互相独立的高斯随机变量1X 和2X 之和的概率密度。 14. 证明若n X 依均方收敛，即 l.i.m n n X X →∞ =，则n X 必依概率收敛于X 。 15. 设{}n X 和{}n Y (1,2,)n = 为两个二阶矩实随机变量序列，X 和Y 为两个二阶矩实随机变量。若l.i.m n n X X →∞ =，l.i.m n n Y Y →∞ =，求证lim {}{}m n m n E X X E XY →∞→∞ =。 第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。 第一节PCR技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。 一、实验原理 PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。第一，按照欲检测的DNA的5＇和3＇端的碱基顺序各合成一段长约18～24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：①引物的长度保持在18～24bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；②GC含量应保持在45～60%之间；③5＇和3＇端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95℃变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（92～95℃）→复性（40～60℃）→引物延伸（65～72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。 随机信号分析常用函数及示例 1、熟悉练习使用下列MATLAB函数，给出各个函数的功能说明和内部参数的意 义，并给出至少一个使用例子和运行结果。 rand()： 函数功能：生成均匀分布的伪随机数 使用方法： r = rand(n) 生成n*n的包含标准均匀分布的随机矩阵，其元素在(0，1)内。 rand(m,n)或rand([m,n]) 生成的m*n随机矩阵。 rand(m,n,p,...)或rand([m,n,p,...]) 生成的m*n*p随机矩数组。 rand () 产生一个随机数。 rand(size(A)) 生成与数组A大小相同的随机数组。 r = rand(..., 'double')或r = rand(..., 'single') 返回指定类型的标准随机数，其中double指随机数为双精度浮点数，single 指随机数为单精度浮点数。 例：r=rand(3,4); 运行结果： r= 0.4235 0.4329 0.7604 0.2091 0.5155 0.2259 0.5298 0.3798 0.3340 0.5798 0.6405 0.7833 randn(): 函数功能：生成正态分布伪随机数 使用方法： r = randn(n) 生成n*n的包含标准正态分布的随机矩阵。 randn(m,n)或randn([m,n]) 生成的m*n随机矩阵。 randn(m,n,p,...)或randn([m,n,p,...]) 生成的m*n*p随机矩数组。 randn () 产生一个随机数。 randn(size(A)) 生成与数组A大小相同的随机数组。 r = randn(..., 'double')或r = randn(..., 'single') 返回指定类型的标准随机数，其中double指随机数为双精度浮点数，single 指随机数为单精度浮点数。 例： 基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的 RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA， 然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同 RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个 相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种 因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以 芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对 表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空 间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA 的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。 基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在 细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一 特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因 产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的 运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几 种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分 析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查 基因表达的应用。8 f3 f- |2 L) K) b7 ]- ~- | RT-PCR检测基因表达的问题讨论 关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。 7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, { 将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。 CHO细胞表达系统研究进展 影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。 转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。 1、启动子 启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、L TR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子> LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。 来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等。在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前 龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/894718709.html, 共词分析及相应工具软件的设计与开发 作者：谢松 来源：《科技创新与应用》2014年第36期 摘要：基于关键词的共词分析自提出以来，在学科前沿热点、学科发展、学科研究范式 等研究中得到了越来越广泛的应用，文章研究了目前的常用共词分析的过程与步骤，比较了已使用的共词矩阵算法，设计开发了一个简洁高效、自动化程度比较高的共词分析工具软件，并以实例作为说明。 关键词：共词分析；共词矩阵；算法 1 概述 共词分析是法国文献计量学家于20世纪70年代提出来的一种文献内容分析方法，1986年法国国家科学研究中心的Callon M和Law J等人出版了第一部关于共词分析法的学术专著，经过几十年的发展，已经被广泛应用到许多领域，产生了大量的研究成果。其思想来源于文献计量学的引文耦合与共被引概念，当两篇文献同时被其他文献引用时，表明它们所研究的主题在理论或方法上是相关的。两篇文献共被引的次数越多，它们的关系就越密切。同理，当有两个专业术语在某学科领域的同一篇文献中同时出现，表明这两个词之间存在一定的关系，同时出现的次数越多，表明它们的关系越密切[1]。 共词分析法主要是对一组主题词或关键词两两统计其在每一篇文献中出现的次数，以此为基础构造共词矩阵，通过对共词矩阵变换为相似矩阵与相异矩阵，然后进行多元统计分析， 把众多分析对象之间错综复杂的关系以数值、图形直观地表示出来，揭示出这些词之间的亲疏关系，进而分析它们所代表的学科和主题的变化与趋势。 2 共词分析的过程与步骤 运用共词分析法进行研究大致可分为几个步骤进行，在具体的操作中可根据实际研究主题选择合适的分析方法。 2.1 确定研究主题与文献选取 利用共词分析法基本原理可以概述研究领域的研究热点，横向和纵向分析领域学科的发展过程与趋势，以及领域学科之间的关系等等。确定好研究主题之后即可在数据库中检索相应的文献，去除重复文献、非相关文献后筛选合适的文献作为处理对象。 2.2 高频词的选取 随机信号分析 朱华，等北京理工大学出版社2011-07-01 《随机信号分析》是高等学校工科电子类专业基础教材。内容为概率论基础、平稳随机过程、窄带随机过程、随机信号通过线性与非线性系统的理论与分析方法等。在相应的部分增加了离散随机信号的分析。《随即信号分析》的特点侧重在物理概念和分析方法上，对复杂的理论和数学问题着重用与实际的电子工程技术问题相联系的途径及方法去处理。《随即信号分析》配套的习题和解题指南将与《随即信号分析》同期出版。《随即信号分析》适用于电子工程系硕士研究生及高年级本科生，也适用于科技工作者参考。 第一章概率论 1.1 概率空间的概念 1.1.1 古典概率 1.1.2 几何概率 1.1.3 统计概率 1.2 条件概率空间 1.2.1 条件概率的定义 1.2.2 全概率公式 1.2.3 贝叶斯公式 1.2.4 独立事件、统计独立 1.3 随机变量及其概率分布函数 1.3.1 随机变量的概念 1.3.2 离散型随机变量及其分布列 1.3.3 连续型随机变量及其密度函数 1.3.4 分布函数及其基本性质 1.4 多维随机变量及其分布函数 1.4.1 二维分布函数及其基本性质 1.4.2 边沿分布 1.4.3 相互独立的随机变量与条件分布 1.5 随机变量函数的分布 1.5.1 一维随机变量函数的分布 1.5.2 二维随机变量函数的分布 1.5.3 二维正态随机变量函数的变换 1.5.4 多维情况 1.5.5 多维正态概率密度的矩阵表示法 1.6 随机变量的数字特征 1.6.1 统计平均值与随机变量的数学期望值 1.6.2 随机变量函数的期望值 1.6.3 条件数学期望 1.6.4 随机变量的各阶矩 1.7 随机变量的特征函数 1.7.1 特征函数的定义 1.7.2 特征函数的性质 乳酸杆菌基因表达系统的研究进展 徐义刚1,2,崔丽春1 (1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。 关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统 中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05 Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill us XU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1 (1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030) A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t https://www.doczj.com/doc/894718709.html,ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect. K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m 乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。 1乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势 乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景[1]。目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[2]。乳酸 收稿日期:2006-09-19 作者简介:徐义刚男,博士。从事病原微生物与免疫学研究。87 微生物学杂志2007年5月第27卷3期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ay2007V o.l27N o.3 136 北京，2009年10月 A P C 联合学术年会论文集 基金项目：国家“八六三”计划节能与新能源汽车重大专项项目（2008AA11A121） 作者简介：邓义斌，男，1979.10，广西壮族自治区鹿寨县人，华中科技大学博士生，主要研究方向为热流控制与管理；dengyb_whut@https://www.doczj.com/doc/894718709.html, 汽车热管理系统及其研究进展 邓义斌1,2 ，黄荣华1 ，王兆文1 ，程 伟3 (1． 华中科技大学能源与动力工程学院 湖北武汉 430074，2．武汉理工大学能源与动力工程学院 湖北武汉 430063，3．东风商用车研发中心 湖北武汉 430056 ) 摘 要：汽车热管理技术是汽车提高经济性和动力性、保证关键部件安全运行和车辆行驶安全的重要途径。介绍了汽车热管理的内涵和研究内容；报告了汽车热管理的发展现状与相应的仿真和试验研究方法；阐述了进行汽车热管理集成研究的重要性；指出只有深入研究系统的流动与传热机理，综合利用废热，从整车热管理集成的高度来进行优化匹配设计，才能发挥汽车热管理系统的最大优势。 关键词：汽车 热管理 节能 传热 发动机 中图法分类号：TK407 文献标识码：A Development in the Study of Vehicle Thermal Management System Deng Yibin 1,2 Huang Ronghua 1 Wang Zhaowen 1 Cheng Wei 31. School of Energy & Power Engineering, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430070, China 2. School of Energy & Power Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430063, China 3. Dongfeng Motor Corporation, Wuhan 430056, China Abstract: Thermal management has become a significant approach to improve the economy and dynamic of vehicle, to ensure the safety of vital assembly and automobile driving. This paper, firstly, introduced concepts and the main research contents of vehicle thermal management, then summarized the development of vehicle thermal management and simulation and experimental research methods corresponding to it. Finally, it pointed out that by the investigation on thermal management system integration with vehicle body, the actual performance of vehicle can be advanced. Key words: vehicle; thermal manageme nt; energy conservation; energy conservation; engine 1 汽车热管理的内涵 运用热力学原理提高整个系统或装置的能量利 用率，减少废热损失、提高系统的稳定性和可靠性的相关技术，从整体的角度来管理热量称为热管理。热管理是从被动地控制温度到主动地管理能量的思想转变，是提高热力系统设计整体性的重要研究方法。热管理的概念提出多年，已在汽车、集成电路、高能激光器、飞机、大型航天器和空间站中应用。 汽车热管理是在能源危机的出现、日益严格的汽车排放法规以及人们对汽车舒适性高要求的背景下应运而生的[1-5]。汽车热管理是从系统集成和整体角度，统筹热管理系统与热管理对象、整车的关系，采用综合控制和系统管理的方法，将各个系统或部件如冷却系统、润滑系统、空调系统等集成一个有效的热管理系统，控制和优化汽车的热量传递过程， 保证各关键部件和系统安全高效运行，完善的管理 并合理利用热能，降低废热排放，提高能源利用效率，减少环境污染。热管理在汽车节能、环保和安全等方面具有突出的战略地位，热管理技术成为汽车节能、提高经济性和保障安全性的重要措施。 2 汽车热管理的研究内容与研究现状 汽车热管理的主要研究内容包括热管理对象热特性研究、热管理系统集成以及热能综合利用等；广泛意义上包括对所有车载热源系统进行综合管理与优化，其中车载热源系统包括发动机的冷却系统、润滑系统、进排气系统和发动机机舱空气流动系统以及驾驶室的空调暖风系统等等，综合考虑空气侧与车载热源系统之间热量传递过程。涉及到冷却介质、热交换器、风扇、泵、底盘空气流动、传感器与执行机构、材料与加工、整车空气动力学、安全 共词分析与共引分析方法的比较研究 伍若梅/孔悦凡 2012-12-19 15:40:40 来源：《情报资料工作》2010年01期【英文标题】A Comparison on Co-word Analysis and Co-citation Analysis (School of Media Science, Northeast Normal University, Changchun, 130117) 【作者简介】伍若梅，女，1986年生，东北师范大学传媒科学学院情报学 研究生。东北师范大学传媒科学学院长春 130117 孔悦凡，女，1984年生，东北师范大学传媒科学学院图书馆学研究生。东 北师范大学传媒科学学院长春 130117 【内容提要】文章主要从共词分析和共引分析的起源、研究对象及性质、前提假设、影响因素、应用过程及范围以及存在的问题几个方面对这两种方法进行了比较，并得出若干结论。 The author compares the co-word analysis and co-citation analysis from aspects such as the origin, research objects, supposes, factors and application range, and have drawn a series of related conclusions. 【关键词】文献计量/共词分析/共引分析bibliomerics/co-word analysis/co-citation analysis 共词分析(co-word)和共引分析(co-citation)是随着电子文献形式和网络文献形式的出现而发展起来的两种重要的文献计量学方法。近年来随着科学知识图谱逐渐成为科学计量学研究的热门领域，共词方法和共引分析方法也成为人们所关注的焦点。作为情报学研究方法的重要组成部分，二者均可广泛应用于科学评价、科技管理等诸多领域。尤其是这两种方法都可以应用于学科范式可视化研究，但有的学者利用共词分析方法来研究，有的学者利用共引分析方法来对某学科或领域的范式进行研究。那么两者之间有何异同呢？为了更好地理解并恰当的利用这两种方法，本文试图从起源、概念、方法和过程等几个方面对二者做简要的比较分析。 1 共词分析与共引分析概述 共词分析法最早是由法国文献计量学家Callon提出的。利用共词分析法的基本原理不仅可以揭示研究领域的研究热点，横向和纵向分析领域学科的发展过程、特点以及领域或学科之间的关系，而且还可以反映某个专业的科学研究水平及其发展历史的动态和静态结构，其最终分析研究结果可以作为高层决策者制定战略决策和长远发展规划的基础。 共引分析法始于Small于1973年提出的以文献为单位的共引分析，是将一批文献（或著者、期刊）作为分析对象，利用聚类分析、多维标度等多元统计分析方法，借助计算机，把众多的分析对象之间错综复杂的共引网状关系简化为数目相对较少的若干类群之间的关系并直观地表示出来的过程[1]。之后，共引概念推广到与文献相关的各种特征对象上，从而形成各种类型的共引概念，如词的共引、文献共引、著者共引、期刊共引、主题共引和类的共引等。自White和Griffth 1981年提出著者共引分析以来，其理论发展也已经比较成熟，除了可 概率论基础 1.概率空间、概率（条件概率、全概率公式、贝叶斯公式） 2．随机变量的定义（一维、二维实随机变量） 3.随机变量的描述： ⑴统计特性 一维、二维概率密度函数、一维二维概率分布函数、边缘分布 概率分布函数、概率密度函数的关系 ⑵数字特征 一维数字特征：期望、方差、均方值（定义、物理含义、期望和方差的性质、三者之间的关系） 二维数字特征：相关值、协方差、相关系数（定义、相互关系） ⑶互不相关、统计独立、正交的定义及其相互关系 4.随机变量函数的分布 △雅柯比变换（随机变量函数的变换一维随机变量函数的单值和双值变换、二维随机变量函数的单值变换） 5、高斯随机变量 一维和二维概率密度函数表达式 高斯随机变量的性质 △随机变量的特征函数及基本性质 、 随机信号的时域分析 1、随机信号的定义 从三个方面来理解①随机过程(),X t ζ是,t ζ两个变量的函数②(),X t ζ是随时间t 变化的随机变量③(),X t ζ可看成无穷多维随机矢量在0,t n ?→→∞的推广 2、什么是随机过程的样本函数？什么是过程的状态？随机过程与随机变量、样本函数之间的关系？ 3、随机信号的统计特性分析：概率密度函数和概率分布函数（一维、二维要求掌握） 4、随机信号的数字特征分析（定义、物理含义、相互关系） 一维：期望函数、方差函数、均方值函数。（相互关系） 二维：自相关函数、自协方差函数、互相关函数、互协方差函数（相互关系） 5、严平稳、宽平稳 定义、二者关系、判断宽平稳的条件、平稳的意义、联合平稳定义及判定 6、平稳随机信号自相关函数的性质： 0点值，偶函数，均值，相关值，方差 7、两个随机信号之间的“正交”、“不相关”、“独立”。 （定义、相互关系） 8、高斯随机信号 定义（掌握一维和二维）、高斯随机信号的性质 9、各态历经性 定义、意义、判定条件（时间平均算子、统计平均算子）、平稳性与各态历经性的关系直流分量、直流平均功率、总平均功率、交流平均功率 随机信号的频域分析 1、随机信号是功率信号，不存在傅里叶变换，在频域只研究其功率谱。 功率谱密度的含义，与总平均功率的关系 2、一般随机信号功率谱计算公式与方法 3、平稳随机信号的功率谱密度计算方法 基因工程制药综述 班级：生技132 姓名： 学号： 大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、 RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体 pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双基因表达的分析技术
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