黄酮提取工艺设计思路
1、黄酮类化合物含量测定的原理
在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色。黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长510nm附近有吸收，可用分光光度法进行测定。实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮形成红色络合物，在波长510nm附近有吸收可进行比色分析。
在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成2'-OH查耳酮而显色。
利用黄酮类化合物中的3－羟基、4－羟基、5－羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与Al3＋进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量
、测定波长的确定2取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL,
室温放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混匀, 室温放置6 min, 加入4%的NaOH
10mL, 用水稀释至25 mL,混匀, 放置15 min, 在分光光度计上扫描波长从400 nm～600 nm
之间的吸收度, 结果在510nm 波长处有最大吸收值。
配合物在Kmax= 354nm 及Kmax= 510nm有两个吸收峰, 经实验后得出Kmax= 112354nm波长处得到的工作曲线线性关系及精密度数据均不佳, 故本实验选取Kmax= 510 2nm为测定波长。
3、标准溶液的配制精确称取105℃干燥恒重芦丁对照品50mg, 加乙醇适量, 使之充分溶解, 用乙醇定容到100mL, 摇匀, 制得芦丁溶液。精确量取芦丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液。每1mL溶液含芦丁对照品0.2mg。或精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg, 置50mL容量瓶中, 加无水乙醇20mL, 轻摇使充分溶解,定容, 摇匀, 得0. 2mg /mL芦丁标准液。
精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含芦丁对照品0.1mg芦丁标准品溶液。
干燥器中冷却，精确称,℃烘箱下烘干至恒重105芦丁标准品于称量瓶中置20mg称取约．
取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容至100 ml为标准液。
、样品溶液的测定方法4 4.1、标准曲线的绘制精确量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分别置于25mL容量瓶中。分别加水至6mL, 加5%亚硝酸钠溶液1.0mL, 混匀, 放置6min; 加10%硝酸铝溶液1.0mL,
摇匀, 放置6min; 加1% 氢氧化钠溶液10.0mL, 再加水至刻度, 摇匀, 放置15min。用分光光度法在510nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 用最小二乘法对直线进行回归计算，令回归方程为：y=ax+b，绘制标准曲线, 得回归线方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在8~40μg/mL的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系。
分别取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL芦丁标准溶液于6支比色管中，分别加入0. 3 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸铝后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置12min得测定液。以空白溶液作参比,在λ= 510nm处测吸光度,计算标准液浓度(C)与吸光度(D)的回归方程D = bC + k。
精确吸取芦丁标准液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙醇至5. 0ml，加5%亚硝酸钠溶液0. 3 ml,，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0. 3ml,摇匀，放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液4. 0ml，加水0. 4ml，摇匀，放置15 min后，在510 nm
处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下: A =12. 721 0C - 0.
，相关系数r = 0. 999802903。
、样品处理4.2取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关文献，在105℃烘至约八成干,剪成约1 cm 长度，用粉碎机粉碎，再在105℃烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂,于43℃水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素。取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤纸包置烘箱中130 ℃烘干，放入干燥器中冷却备用。
4.3、样品处理方法湿热法：将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min，另取鲜叶常压蒸30min。将阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min。
氧化法：（1）H2O2法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2浓度℃）、50、2%（30min℃）、30、0.5%（30min℃）、40、2%（10min℃）、50、温度1%．
60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。（2）KMnO4法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。
4.3、样品溶液的测定4.3.1、分光光度法
精确量取样品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法进行操作, 在510nm
波长处测定吸光度A1; 再精确量取样品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 在510nm 波长处测定吸光度A2。取2次吸光度的差值, 由回归线方程计算样品中黄酮类化合物的提取率。
HPLC 法4.3.2、取上述样品总黄酮提取液浓缩物，用甲醇溶解，进样前用0.45 μm 滤膜过滤。高效液相色谱仪：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色谱柱：Dima Technologies(C18 迪马公司)，规格：250 mm×4.6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：SPD-10A；检测波长254 nm；进样量20 μL；流动相：80%甲醇。在进柱之前，流动相要经过0.45μm 的有机膜过滤，并超声脱气30 min。
、溶剂选择5分别称取样品1g，以提取温度90℃，提取时间2 h ，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50(g/mL)为提取条件进行常压回流提取，以此结果进行比较。
6、线性范围、回归方程和检出限
总黄酮的线性范围在1.0～40μg/ml 之间，所得回归方程为y=0.0033x－0.0109，相关系数为0.9995，检出限为1.0μg/ml。
、显色剂稳定性实验7精确量取标准溶液和样品提取液1.0mL, 同标准曲线和样品测定的操作，分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。结果显示其RSD值为0. 5097% , 说明样品溶液在1h内稳定。
8、加标回收率实验取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的芦丁对照液1. 0mL,
该方法对, 。表明2. 135%值为99. 12%, RSD 计算回收率。加样回收率为, 按实验方法测定
黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量)/芦丁标准品加入量×100%。
分别取0.2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg 芦丁标准品作为加标测定管，另1管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。由表8可知，该方法的回收率为95%~104%，证明该方法的准确度较好。
取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入0.2mg/mL芦丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。
回收率%= 样品加标准样测得总黄酮含量?样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含量×100%
回收率/%
平均回收率/% 样品测定值序号加标量/mg 加标后测定RSD/%
值）mg /ml
（mg/ml0.2000 1
2 0.2000
3 0.2000
4 0.2000
0.2000
5
9、精密度实验
取5份同一样品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按实验方法测定，计算其平均含量和相对标准偏差。其RSD 值平均为0.162%, 测定结果的相对标准偏差很小, 说明仪器的精密度较高, 实验数据可靠。
在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验5
次，计算保健食品总黄酮提取量为（5.370±0.092）mg，RSD 为1.717%，证明该方法的精密度较好。
按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定。
精密称取车前草供试品3份，每份测试3次,结果见表2，相对标准偏差为3. 20 %(m =3)。精密移取芦丁标准液1mL，共5 份，分别置于10mL试管中，按1.3.3.2 节操作，计算吸光度的相对标准偏差(RSD)。
10、重现性试验。取同一批大白口蘑样品6份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明，其相对标准偏差为1.24%。
在同一实验室、不同时间对样品叶中总黄酮含量进行5次重复测定。
11、金属离子的干扰实验
银杏叶提取物作为生物活性物质, 许多金属离子对它的测定都有一定影响。本实验选取常见的Zn2+ 、Fe3+ 进行实验。实验表明Zn2+ 对反应无影响, 加入1 mL 100Lg?m L Fe3+
溶液, 扫描发现在波长510 nm 无吸收峰, 由此可知Fe3+ 对实验测定影响很大。本实验选择EDTA做掩蔽剂。
12、黄酮类化合物的定性检测12.1、三氯化铝反应
取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用95%乙醇完全溶解，每只试管中再加1%三氯化铝乙醇溶液1～2 mL，观察颜色变化情况。在三氯化铝反应中，原来的黄色加深，并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色。滤纸上无明显颜色变化，紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含4'-羟基黄酮醇和7，4'-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物。黄色或黄绿色：有黄酮类化合物。
、盐酸-镁粉还原反应12.2将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中，待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况。在盐酸-镁粉还原反应中,溶液呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。试液呈现红色，可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物。
取样品液5mL，加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min。并作空白对照实验（在样品液中仅加入浓盐酸进行观察）。可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在。橙红色：黄酮类化合物。
取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加热溶解，滴加2，即产生剧烈的反应。反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙50mg，再加镁粉约HC1滴浓．
红色。此现象表明被测物为黄酮类物质。
、四氢硼钠反应12.3取8支试管，分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品，用95%乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠，观察颜色变化情况。在四氢硼钠反应中，溶液由浅黄色变为红色或紫红色，此反应是二氢黄酮类化合物的专属反应。
、与碱反应12.4试液变黄色，可能含二氢黄酮、黄酮醇等黄酮类化合物。棕黄色，空气氧化变褐色：有黄酮醇类或查耳酮。4%氢氧化钠反应，棕色，有黄酮类化合物。
、铝盐反应12.5取样品提取液5 mL，加入0.3mL 5% NaNO2，充分混匀，混匀后静置5min，加入0.3mL
10% Al(NO3)3，混匀后静置6min，加入2mL1 mol/L NaOH，混匀，静止10min。可观察到有砖红色的颜色产生，表明提取液中有黄酮类物质。黄色：有黄酮类化合物。
12.6、浓氨水反应
提取物乙醇溶液点在滤纸上,置于浓氨水上方30 s, 紫外灯下观察, 显黄色荧光斑点。棕黄色，有黄酮类化合物。
三氯化铁反应12.7、1%蓝色：黄酮类化合物。12.8、1%醋酸铅反应
黄色沉淀：黄酮类化合物。12.9、浓硫酸反应
橙色：黄酮类化合物。12.10、熔点测定
取提取的莲子心黄酮样品，经多次重结晶提纯，测其熔点230℃~230.5℃。
12.11、红外光谱图的比较
取精制的黄酮样品和黄酮（芦丁）对照品，溴化钾压片法绘制红外光谱图。测试条件：扫描范围4000cm-1~400cm-1；分辨率4cm-1，扫描次数32
、总黄酮提取量即得率和提取率计算13 、总黄酮提取量即得率计算13.1．
Y＝C×V1×（V2/V3）/m
式中，Y 为黄酮含量（mg/g），C为测定液黄酮浓度（mg/mL），V1为测量时定容
的体积（mL），V2为提取液体积（mL），V3为测量时取液体积（mL），m 为提取时原料质量（g）。总黄酮得率X（%）＝n×C×V/m×100%
式中：n为提取液稀释倍数；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为果渣的重量，mg；X总黄酮得率。
100V1 ×103 ×P =C ×V ×n/W ×式中:P—总黄酮类物质含量, g/100 g;C—从回归方程计算得样品中黄酮类物质质量,
mg;n—稀释倍数;V —浓缩液的体积, mL;V1 —测定体积, mL;W—投料量, g。
13.2、总黄酮提取率计算
提取率= [提取的总黄酮质量/原料质量×原料中总黄酮含量] ×100%
14、单因素试验
14.1、乙醇体积分数的影响取样品1g 左右，分别加入0%、10%、20%、30%、40%、50`%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在100℃条件下快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.2、不同提取温度取样品1g，乙醇体积分数60%，分别20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃于用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.3、不同提取时间
取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃分别快速萃取30min、60min、90min、120min、150min、180min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
、不同粒度14.4取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于20目、40目、60目、80目、100目、
120目用快，测定提取液黄酮含量，并计算得率。5min速萃取法提取．
14.5、提取次数
取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃快速萃取1 0mi n ，分别萃取1 、2 、3 、4 、5次，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.6、料液比取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
15、超声波提取总黄酮15.1、乙醇溶液浓度对总黄酮提取的影响15.2、超声温度对总黄酮提取的影响
、超声时间对总黄酮提取的影响15.3 15.4、料液比对总黄酮提取的影响15.5、提取次数对总黄酮提取的影响15.6、目数对总黄酮提取的影响
超声时间的选择、间隙/ 15.7 15.8、浸泡时间选择16、微波提取总黄酮16.1 、乙醇浓度对黄酮提取率的影响16.2、液固比对黄酮提取率的影响
16.3、微波功率对黄酮提取率的影响16.4、微波辅助提取时间对黄酮提取率的影响
16.5、0103%的非离子表面活性剂B对黄酮提取率的影响（椰油酰胺甜菜碱(CAB)，十二烷基硫酸钠( K12 ) ，十六烷基三甲氯(溴)化铵(1631)，椰油酰基二乙醇胺(6501)，三乙醇胺，椰子油醇醚羧酸钠(CES)，椰油酰胺丙基甜菜(CAB - 35)，十二烷基苯磺酸钠(LAS)，十二烷基硫酸铵(K12A) 、吐温80( Tween 80)、十二烷基三甲基氯化铵( DTAC)）
16.6、提取次数对总黄酮提取量的影响
、超高压提取总黄酮17 17.1、乙醇浓度17.2、压力、料液比17.3
17.4、处理时间
、提取次数17.5 18、验证试验根据筛选得到的最佳提取条件A3B2C3D2，平行提取3次，计算总黄酮的提取率。结果见表4。经实验验证，根据最佳的提取条件所得的总黄酮的提取率均大于正交设计中总黄酮的提取率，因此本最佳工艺条件合理，同时也表明此工艺具有较好的稳定性。
19、粗总黄酮的纯化
、树脂预处理19.1用40目筛在水中筛选出大小合适、分布均匀的树脂,将新的D101/AB-8大孔吸附树脂用2
倍体积的95%乙醇浸泡24h, 并不时搅动, 使树脂充分溶胀。将树脂置于玻璃色谱柱( 30mm×500mm) 中, 用95%乙醇淋洗, 检测流出液, 直至淋洗后流出液与水混合( 1︰5)
后不再出现白色混浊, 用大量重蒸馏水洗去乙醇至无醇味，用4倍体积5%的HCl溶液浸泡3-4h，用去离子水洗至中性，再加入大约4倍体积的5%的NaOH溶液浸泡3-4h，再用纯化水洗至中性，备用。
19.2、树脂的吸附和解吸:
将已预处理的D101 大孔吸附树脂装入柱中, 将按最佳工艺提取的黄酮粗提液回收乙醇, 调至浓度为0.5 mg / mL上柱, 以0.5 mL/min流速吸附后用3倍柱床体积纯化水洗至流出液无色, 再用4倍量70%的乙醇解吸, 得解吸液。
19.3、产品的处理解吸液真空干燥至恒重, 称定质量。按方法测定吸光度, 根据回归方程计算解吸液中总黄酮含量。按下式计算黄酮的纯度: 黄酮的纯度(%) = W/ W0×100%。式中, W 为解吸液中黄酮的含量( g) ,W0为解吸液干燥后的质量( g) 。
大孔吸附树脂对腊梅花总黄酮的吸附率的测定：称取预处理好的树脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，准确加入腊梅花黄酮类水溶液30ml, 在室温下置于振荡器上振荡24h，充分吸附后，测定滤液中剩余黄酮的浓度，按照下式计算吸附率：
吸附率(%) = ( C1- C2 ) / C1×100式中, C1为吸附前浓度(mg/L) ; C2为吸附后剩余液的浓度(mg/L)。
大孔吸附树脂对腊梅花总黄酮的脱附率的测定：取上述得到的饱和树脂, 准确加入50
测定滤液中黄酮的浓度，按, ，充分解脱后24h的乙醇，在室温下置于振荡器上振荡ml95%．
照下式计算脱附率:
脱附量= C3V1 / m脱附率( %) = 脱附量/ 吸附量×100式中, C3为解脱后溶液的浓度(mg/ L) ;
V1为解脱剂的体积( L) ; m为树脂的质量( g)。
20、抗氧化活性试验
20.1、清除羟自由基能力的测定在15 mL试管中依次加入FeSO4，H2O2，摇匀，然后加入水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴中加热15 min，取出，510nm处测定吸光度A1，在加入一定浓度的样品溶液1 mL，摇匀，水浴继续加热15min后取出，510nm处测定吸光度A2。通过计算精制前后产品的自由基清除效果来对比精制的效果。
清除率=（A1-A2）/A1×100 %20.2 、清除超氧阴离子自由基能力的测定1）PBS 缓冲溶液的配制：取氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g, 磷酸氢二钠1.44 g, 磷酸二氢钾0.24 g 溶解在800mL 蒸馏水中，调整pH值至8.2，最后定容至1000mL。
2）测定方法：在10 mL 容量瓶中加入5 mL PBS 缓冲液（pH=8.2）,1 mL 的黄酮溶液，在45℃恒温水浴中放置20 min 后，加入1 mL 的25 ℃预热邻苯三酚溶液（45 mmol/L）,迅速混匀，每隔60 s 在510 nm 处测定溶液的吸光度，并与空白溶液相比较，根据公式即可计算出被测物抑制O2-·的累积作用能力。
抑制率=（ΔA 对照-ΔA 样品）/ΔA 对照×100 %20.3、清除自由基效能力的测定—DPPH法配置5 种不同浓度的黄酮溶液，分别吸取样液2.0 mL，加入DPPH 溶液（2×10-4 mg/mL）2.0 mL，摇匀、静置30 min，以70 %乙醇为对照，在510 nm 处测定试液的吸光度A1。同时取待测样液2.0 mL 与70 %乙醇2.0 mL 进行混合，以70 %乙醇为对照，在510 nm 处测定试液的吸光度A2。最后，将DPPH 溶液2.0 mL 与70 %乙醇2.0 mL 混合，以70 %乙醇为对照，在510 nm处测定试液的吸光度A3。每组测定3 次，求取平均值，按下述公式计算样品的抑制率。
抑制率=[1-（A1-A2）/A3]×100 %
，2mmol/L此时浓度为充分振荡，的无水乙醇，50mL 加入，DPPH.的0.0394g 精确称取．
吸取1mLDPPH 溶液用无水乙醇定容到10mL，放入冰箱中待用。
取0.2mmol/L DPPH. 溶液2.5mL，用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下置于30min，测定其在479nm 处的吸光度A。取2mL 经纯化后的蚕沙类黄酮提取液和0.2mmol/L
的DPPH。溶液2ml，用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下放置30min，测定其在479nm 处的吸光度Ai。另外取2mL 经纯化后的蚕沙类黄酮提取液用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下置于30min，测定其在479nm处的吸光度Aj。
对0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL8种质量浓度的样品总黄酮和Vc对照品的待测乙醇溶液进行实验。在517nm处测定吸光值(A517)，并按公式计算各试样清除DPPH自由基的能力。DPPH自由基清除率= [ 1 - (A2 -A1 ) /A0 ] ×100%
式中: A0为2mL DPPH有机溶液+ 2 mL溶剂的吸光值; A1为2mL乙醇+ 2 mL试样溶液的吸光值; A2为2mL DPPH有机溶液+ 2 mL试样溶液的吸光值。
DPPH 法：分别吸取提取物甲醇溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于10 mL 的具塞试管，各加0.2 m mol/L 的DPPH·甲醇溶液1 mL，再加甲醇至4 mL，摇匀，室温下密封避光放置30 min 后，用甲醇作参比测定在517 nm 处吸光度值Ai，同时测定1 mL 0.2mmol/L 的DPPH·甲醇溶液和3 mL 无水甲醇混合液在517 nm 处的吸光度值Ac，以及未加DPPH·甲醇溶液的提取物甲醇溶液与甲醇混合液在517nm 处的吸光度Aj 值。记录Ai、Aj 和Ac，按照下式计算提取物的清除率K(%)。以Vc 溶液为阳性对照物。
100－Aj)/Ac)×K(%)=(1-(Ai样品清除自由基能力常以IC50 来比较。IC50的定义为：使自由基数目减少50%时所需样品的浓度。在此指可使DPPH·甲醇溶液在波长517 nm下吸光度值下降50%的样品浓度，浓度以mol/L表示。
21、不同条件对黄酮类化合物的影响21.1、加热对黄酮类化合物的影响
将黄酮类化合物溶液，分别在50℃加热恒温2h，30min取样1次，迅速冷却，于510nm 处测定吸光度。
21.2、PH值对黄酮类化合物的影响用黄酮类化合物溶液，分别配制成pH = 8、7、6、5、4，于
510nm处测定吸光度。
对黄酮类化合物的影响NaCL、21.3．
用黄酮类化合物溶液，分别配制成NaCl为0%、0. 25%、0. 5%、1. 0%, 于510nm 处测定吸光度。、总黄酮液体保健饮料22
银杏叶提取黄酮及分离纯化 组员：李佳辉、黄埔、赵超武 一、实验目的 1.掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取 2.掌握紫外分光光度计的应用，以及相关溶液的配置 3.学会自主设计实验，培养团队合作精神 二、实验原理 ⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用； ⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm; ⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因 为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。 其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化
合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应）
目前银杏叶黄酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法（SFE法）、高速逆流色谱技术提取法（HSCCC)微波提取法、超色波提取法、酶提取法、分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进行大规模生产。 其工艺流程如下： 银杏叶—→粉碎—→NaOH-60%乙醇回流提取—→离心—→过滤—→滤液收集—→二次醇提—→合并两次滤液—→树脂吸附—→脱吸—→浓缩—→干燥—→提取物 由于银杏叶黄酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线，并采用分光光度法进行测定。 三．实验材料及器材 1.材料 酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95％乙醇、磷酸氢二钠、磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸
中草药叶下花总黄酮提取方法 作者：杨发忠，杨斌，杨德强，陈厚琴，代红娟，张丽，李东海 【摘要】目的对叶下花总黄酮的种类与提取方法进行初步研究。方法采用定性检测、光谱分析、单因素测定、正交实验等，研究黄酮种类，考察乙醇体积分数、温度、固液比、时间对提取率的影响。结果叶下花含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等多种黄酮类化合物；所考察的影响因素中，对总黄酮提取率影响程度大小顺序为乙醇体积分数＞温度＞时间＞固液比。结论最佳提取条件为A1B2C3D3 (乙醇体积分数30%、温度65℃，提取时间180 min，固液比1∶80)，在此提取条件下，提取量高达5.233%。 【关键词】叶下花总黄酮提取方法正交实验 Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction conditions for the total flavonoids from Ainsliaea pertyoides Franch and to study the categories of the total flavonoids. MethodsThe methods of the chemical qualitative detection, the spectral analysis, single factor determination, orthogonal test were adopted to study the categories of the total flavonoids, and the effect of four factors, i.e. the volume fraction of ethanol, the temperature, the ratio of solid to liquid, the
黄酮类化合物提取方法的研究 发表时间：2019-07-23T09:36:27.620Z 来源：《医师在线（学术版）》2019年第10期作者：鲍兴隆[导读] 旨在研究黄酮类化合物的提取分离工艺，为选择合适的方法提供参考依据。 浙江大学校医院浙江杭州310000 摘要：近年来，随着对黄酮研究的深入，国内外对黄酮的研究也越来越重视，本文旨在研究黄酮类化合物的提取分离工艺，为选择合适的方法提供参考依据。通过对比黄酮类化合物传统及新型方法的总黄酮提取率发现，新型提取方法相对于传统提取法而言提取率具有明显优势，但新型提取技术对原料、设备、处理要求也相应提高，目前国内外研究相对偏少。 关键词：黄酮类化合物；微波提取；超临界流体萃取法 黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物，泛指两个苯环通过三个碳原子或一个吡喃环或吡喃环连接而成的化合物，主要包括：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇、异黄酮类及二氢异黄酮类、查尔酮和二氢查耳酮类及花青素类等[1]。黄酮类化合物属植物次生代谢产物，在植物体内大部分与糖结合成苷类，小部分以苷元的形式存在，具有多种生物活性，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等药理活性，在医药、保健食品等行业中均有广泛的开发利用。对黄酮类化合物的提取有传统的超声波提取法等；以及新型的：微波提取法、超临界流体萃取法、双水相萃取法等。 1传统提取方法 1.1超声波提取法 超声波空化作用使植物细胞壁及整个生物体破裂，这样有利于黄酮类化合物的释放和溶出，另一方面可加速提取液的分子运动，使得提取液和苎麻叶中的黄酮类化合物快速接触，相互溶合、混合，此外超声波热效应也有利于水溶作用，有效缩短了提取时间。贺波[2]以“华苎4号”苎麻叶为原料，采用超声辅助提取法,通过单因素及正交实验,得出最佳的提取工艺条件是：液固比30:1,乙醇浓度70%,超声功率60W,超声时间30min,超声温度60℃,提取一次。在此工艺条件下苎麻叶中黄酮类化合物得率为4.94%。2新型提取方法 2.1微波提取法 微波提取法是微波转化成热能使细胞内部温度上升，当细胞内部压力超过细胞壁的承受能力，细胞破裂，其有效成分流出，在较低的温度条件下萃取介质捕获并溶解。此外，微波产生的电磁场还能加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率，缩短萃取组成的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间。张海慧等[3]以黑穗醋栗为试材，进行单因素实验，在此基础上设计了四因素三水平正交试验。最后确定了微波辅助法提取黑穗醋栗黄酮的最佳条件为：以95%乙醇为溶剂，微波功率500W，微波65℃，提取8min，液料比10:1，此时提取率可达到0.738mg/g。张鹏等[4]通过实验得出银杏黄酮微波提取的最佳条件为乙醇浓度50%，料液比1:25，回流温度70℃，微波时间120s，在此条件下总黄酮提取率为11.02%。与传统方法相比，微波提取法具有省时、节约溶剂、提取率高等优点，有较大的推广价值。 2.2超临界流体萃取法 超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。余青等[5]采用单因素与正交试验对超临界CO2萃取具乌饭树叶总黄酮的工艺进行了研究，结果表明，最佳提取条件为：萃取压力18MPa，萃取时间1.5h，萃取温度50℃，夹带剂乙醇浓度75%，CO2流量20kg/h，夹带剂添加量5mL/g在此条件下乌饭树叶总黄酮平均提取率为73.10%（n=3，RSD=3.58%）。谢建华等[6]利用响应面发优化超临界CO2萃取苦瓜总黄酮的工艺参数,在实验的基础上,确定最佳工艺条件:以无水乙醇为夹带剂1.0mL/g，萃取压力33.4MPa，萃取温度46℃，萃取时间53.2min。此条件下苦瓜总黄酮提取率达到84.3%。超临界流体萃取技术萃取速度快，提取率高，流程简单，且对生物活性保留较好，具有一定的应用价值。 除以上的提取方法外，还有双水相萃取分离、双水相—超声耦合、超声—酶法耦合、酶法—高压脉冲电场耦合等技术。总的来说，传统提取方法的总黄酮提取率基本在5%左右，而新型提取方法的提取率在10%以上（有的甚至可达80%-90%），相对于传统提取法而言，新型提取方法的提取率具有明显优势，但对新型提取技术对原料、设备、处理要求也相应提高，目前国内外研究相对偏少。3展望 黄酮类化合物分布范围广、种类多，黄酮类化合物的保健品也早在二十世纪八十年代末就引起国际医药界的注意，而且大部分毒理学研究提示其一般无毒，近年来此类化合物一直是生化制药、保健品生产方面的热门之一，在最近上市的保健产品中也有很大一部分其主要功效成分就属于黄酮类化合物，其涉及的功能食品也很多。最近由于心血管疾病、癌症等疾病死亡人数呈快速增长，而黄酮对心血管系统及防癌抗癌有一定的作用，许多国家和地区正在开发相关的产品，前景较好。由于黄酮类化合物可能存在几种不同的作用机制与合成途径，有些实验结果的解释可能依然存在不足之处。因此今后黄酮类化合物的研究还需要关注的是生物利用度、代谢动力学、体内的氧化损伤及长期服用产生的慢性后果等方面[7]。开发出更加可靠、令人信服的模型或系统，以此来精确评估黄酮类化合物在人体内的代谢作用是非常必要的。 参考文献 [1] TAYLOR L P,GROTEWOLD E. Flavonoids as developmental regulatoes [J].Current Opinion in Plant Biology,2005,3(8)：317-323. [2] 贺波.苎麻叶中黄酮的提取、分离纯化、结构及抗氧化活性研究[D].武汉:华中农业大学硕士学位论文,2010. [3] 张海慧.微波辅助法提取黑穗醋栗中黄酮类物质的研究[J].东北农业大学学报,2008.39(9):32-35. [4] 张鹏.银杏叶黄酮的微波提取及抗氧化性研究[J].安徽农业科学,2009,37(12):5496-5497,5730. [5] 余青,郑小严,黄红霞,等.超临界CO2萃取乌饭树叶总黄酮的工艺[J].2009,38(01):97-102. [6] 谢建华,单斌,彭云.超临界CO2流体萃取苦瓜总黄酮工艺及其抗氧化活性[J].2010,08(1):66-71. [7] 佟永薇.黄酮类化合物提取方法的研究及展望[J].食品研究与开发,2008,29(7):188-190.
银杏叶黄酮提取及含量测定 一、实验目的 1、掌握银杏叶中黄酮的提取方法 2、了解银杏叶中黄酮的含量测定 二、实验原理 近几年来，随着对黄酮类化合物研究的日益深入与重视，黄酮类化合物提取技术的发展也得到了促进。目前提取黄酮类化合物的方法主要包括有机溶剂浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法、微波提取法和酶提取法等。 １．１有机溶剂浸提法 目前国内外使用最广泛的银杏叶中黄酮的提取方法就是有机溶剂提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些极性较大的混合溶剂，如甲醇－水（１＋１）溶液。由于甲醇的毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为提取剂。银杏叶干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、提取、过滤，滤液中的溶剂经减压蒸馏除去后得银杏叶浸膏粗提物。徐桂花等［１］提取银杏叶中黄酮类化合物时，采用乙醇（７０＋３０）溶液为提取剂，提取温度为７０℃，料液质量浓度比为１ｇ比４０ｍＬ，提取时间为４ｈ。由于乙醇提取工艺在安全性、溶剂成本、效率及杂质酚酸去除等方面都不能应对日益严酷的市场竞争，张林涛等［1］提出了以硼砂－ 氢氧化钙碱水为溶剂提取银杏叶黄酮，其黄酮提取率与文献值相近，但提取工艺时间缩短为１ｈ。 １．２超声波提取法 超声波提取法是利用搅拌作用、强烈的振动和空间效应、高的加速度等使药物有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并能消除高温对提取成分影响的一种提取法。刘晶芝等［2］运用了超声波技术与水浸提取相结合的方法得出超声波提取的最佳工艺条件为：超声频率４０ｋＨｚ，超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比１００，提取温度３５℃，静置３ｈ，提取率为８１．９％。郭国瑞等［3］以水为介质，超声波提取银杏叶中黄酮苷，与常规水浸提法比较，超声波提取效率大大提高，确定超声波提取的最佳工艺为：超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比３０，提取温度５０℃，提取率为８２．３％。 １．３超临界流体萃取法 超临界流体萃取法是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对有效成分进行萃取和分离的新技术。可作为超临界流体的物质很多，其中二氧化碳临界温度（ＴＣ＝３１．３℃）接近室温，且具有无色、无毒、无味、不易燃、化学惰性、价廉、易制成高纯气体等优点而被广泛应用，特别在中药材及其制剂中更显示出其独特、简便、快速、具有较高的选择性、提取杂质少、可直接进样分析的优点。邓启焕等［4］探讨了超临界萃取银杏叶有效成分的影响因素，最佳条件为萃取压力２０ＭＰａ、时间９０ｍｉｎ、粒度３．９ｍｍ、温度４０℃，经测定银杏叶黄酮的质量分数为２８％，高于国际公认标准。 １．４微波提取法 微波提取法是利用分子或离子在微波场中的导电效应直接对物质进行加热从而提取植物细胞内耐热物质的新工艺。曾里等［5］的研究表明以乙醇溶液作溶剂比以水作溶剂的效果好，最佳条件为以乙醇 （６０＋４０）溶液为提取剂，解冻处理２０ｍｉｎ。张鹏等［6］对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行了研究，最佳提取条件为以乙醇（５０＋５０）溶液
总黄酮的提取方法 1、熔剂法热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法 2、微波提取法微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离，进入介电常数较小，微波吸收能力相对差的提取剂[1]。这种方法的优点是对提取物具有较高的选择性、提取率高、提取速度快、溶剂用量少、安全、节能、设备简单 3、超声波提取法用超声波提取法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。原理是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，还利用其次效应，如机械振动、扩散、击碎等，使其加速被提取成分的扩散、释放。超声波提取法具有设备简单，操作方便，提取时间短，产率高，无需加热，同时有利于保护热不稳定成分，省时，节能，提取率高的优点。 4、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是利用超临界流体处于临界温度和临界压力以上，兼有气体和液体的双重特点，对物质具有良好的溶解能力，从而作溶剂进行萃取分离。可做超临界流体的物质很多，一般为低分子量的化合物，如CO2、C2H6、NH3、N2O 等。目前多采用CO2 做萃取剂，因为它具有密度大、溶解能力强、临界压力适中、临界温度接近常温、不影响萃取物的生理活性、无毒无味、化学性质稳定、生产过程中容易回收、无环境污染、价格便宜等一系列优点。但单一的CO2作萃取剂只对低极性、亲脂性化合物有较强的溶解能力，对大多数极性较强的组分则不起作用，因此，在其中加入夹带剂，通过影响溶剂的密度和溶质与夹带剂分子间的作用力来影响溶质在二氧化碳流体中的溶解度和选择性[15]。超临界流体萃取技术有许多传统分离技术不可比拟的优点：过程容易控制、达到平衡的时间短、萃取效率高、无有机溶剂残留、对热敏性物质不易破坏等[16]。但它所需要的设备规模较大，技术要求高，投资大，安全操作要求高，难以用于较大规模的生产。 5、酶法提取酶解法适用于被细胞壁包围的黄酮类物质，利用酶反应的高度专一性，破坏细胞壁，使其中的黄酮类化合物释放出来。黄剑波等[22]采用纤维素酶辅助法从甜茶中提取黄酮类化合物，黄酮类物质的提取率为91%，提取纯度为54%。王悦等[23]对桔皮细胞进行游离酶、固定化酶和常规法提取，黄酮得率分别是%，% 和%，和传统的方法相比，游离酶法的总黄酮得率提高了81%。
黄酮类化合物的提取、药用价值和产品开发应用前景 任红丽2009090141 摘要：对黄酮类化合物的药用价值、提取工艺、分离方法等方面进行综述。在 药用价值方面,讨论了其抗抑郁作用、抗氧化与自由基消除活性作用、对化学性肝损伤的保护作用、抗肿瘤作用、抗骨质疏松作用、抗心肌缺血作用;在提取工艺方面,讨论了溶剂提取法、超声提取法、酶法、微波法等;及其开发应用，为今后黄酮类化合物的深入研究提供理论基础。 关键词：黄酮类化合物提取工艺药用价值 黄酮类物质是一类低分子天然植物成分，是自然界中存在的酚类物质[14]，又称生物黄酮或植物黄酮，属植物次级代谢产物，广泛存在于各种植物的各个部位，尤其是花、叶，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。迄今，已有数百种不同类型的黄酮类化合物在植物中被发现，人工合成的黄酮类化合物也不断问世。最初这类物质仅用于染料方面，自20世纪20年代，槲皮素、芦丁等黄酮类物质用于临床后，才开始引起人们的关注，研究发现其中相当一部分具有显著的生理及药理活性，例如抗氧化、抗病毒、抗炎、调节血管渗透性，改善记忆，抗抑郁、抗焦虑、中枢抑制、神经保护等功能[2,12]诸多生理和药理特性使其广泛应用于食品、医药等领域。 1.提取纯化方法 1．1 传统提取方法 1．1．1 热水提取法 水是最廉价的提取溶剂，是地球最丰富的物质，无色无味无毒，对人体和环境无害，挥发性不大，具有真正的绿色环保意义。但用水作为提取溶剂时，从中药材中提取的黄酮类化合物中杂质含量较多，往往因泡沫或粘液很多，给进一步分离带来许多麻烦，而且浓缩也会很困难。此外，水提取物容易发霉发酵[22]。1．1．2 碱性水、碱性稀醇浸提法 中草药中黄酮类成分多为多酚类化合物，因其结构中具有酚羟基[7]，故可用碱性水或碱性稀醇液来提取中草药中的黄酮类化合物。黄酮母核的多样性主要是由黄酮本身骨架、环系的变化、氧化程度和数量而定，当碱的浓度过高，加热时便破坏黄酮类化合物的母核。 1．1．3 有机溶剂热回流及冷浸提取法 根据杂质极性不同，可选用不同的有机溶剂(如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇、丙酮等)，一般采取乙醇为提取溶剂[15]。
黄酮提取实验方案 1材料与仪器 1.1材料 1.2试剂 芦丁，无水乙醇，氢氧化钠，石油醚，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠(以上均为国产分析纯)，实验所用水均为蒸馏水。 1.3实验仪器 电热恒温水浴锅 电子天平(感量0.0001g) 722型光栅分光光度计 索氏提取器 量筒(100ml,10ml)25ml比色管移液管小试管白瓷板圆底烧瓶100m 容量瓶 锥形瓶 2实验原理 2.1提取原理 溶剂提取原理游离黄酮黄酮昔备注 乙辱溶解范围广+ + (甲醇)著■甘元均可溶(90-95%) (6M)甲醇毒性大 沸水多糖昔易于水+ 成本低、安全, 水溶性杂质多 臓性水或稀氢氧化钠溶出能力强 碱性乙醇酚强基的酸性 + +石灰水除杂质效果好
分离依据 之间的极性（分配系数K ）差异 分离工艺 回收 回收 单糖瞽 多糖昔 誓元 爸游离黄酮的乙瞇液 2 黄酮与杂质 昔与昔元 昔元与昔元 ）溶剂萃取法 2.2分离方法及原理 （二）pH 梯度萃取法 分离依据： 游离黄酮类化合物的酸性差异（见黄酮酸性规律） 分离工艺： 依次以 5%NiiH0h . 5%Na2C0 0. 2%N SL OH. 4%NaOH^取 5%NaHCO3< 5%Na2CO3液 0. 2KNaOH 液 4%NaOH 液 母液 （脂溶性杂石油駆液 乙豔液 乙酸乙酯 （脂溶性杂质）| | 丄酸化 水饱和正丁醇 母液 （水溶性杂质） 减压回收 原料的提取苹缩液（水溶液） 依次以石油耿、乙馳、 乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取
3 实验部分 3.1 原料的预处理 金星科厥类叶T除杂T水洗T晾干T粉碎 3.2 芦丁—标准溶液的配制 将芦丁在干燥箱里用120C条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品O.OIg用85%勺乙醇溶液配制成100.00mL 的溶液，备用。 3.3 测定波长勺选择 精确移取芦丁标准溶液0.50mL, 置于25.00mL 勺比色管中，用质量分数为85%勺乙醇稀释到10.00mL 处，加人5%勺亚硝酸钠溶液0.80mL, 混匀，放置10min; 加入10%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min, 再加入4%勺氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min, 加入85%勺乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后在460?560nm处测定吸光度，⑷（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。 3.4 芦丁标准曲线勺绘制 精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中，用质量分数为85%勺乙醇稀释到10.00mL 处，加人5%勺亚硝酸钠溶液0.80mL, 混匀，放置10min; 加入1 0%硝酸铝溶液0.80mL , 混匀，放置10min, 再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min，加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液）然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。 3.5 黄酮类化合物的特征性实验[5]-[6] 在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如 下： （1）盐酸一镁粉反应：取 1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色。（2）三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液， 吹干，观察颜色变化。（3）三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加1%三氯化铁乙醇溶液， 观察其颜色。（4）浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min ，观察 其颜色变化。 3.6 单因素实验 2.6.1 较佳提取剂质量分数的确定 准确称取3g 处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇、95%、85% 80%、 75%的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80C下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的 质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL 容量瓶中，然后精确吸取 0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%的亚硝酸钠溶液0.80mL,混匀，放置10min;加入10%硝酸铝溶液0.80mL ,混匀，放置10min,再加入4%的氢氧化钠溶液10.00mL, 混匀，放置10min, 加入85%的乙醇溶液至刻度，摇匀，10min 后 于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。
槐花中黄酮类化合物分离和鉴定[适用对象] 中药国际交流、中药知识产权、中药制药工程、中药资源专业 [实验学时]9 一、实验目的要求 学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求： （1）了解沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。 （2）了解由芸香苷水解制取槲皮素的方法。 （3）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。 二、实验原理 由槐花中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制。纸色谱的分离原理是利用各种化合物在流动相和固定相中分配系数的不同而达到分离目的。 三、仪器设备 烘箱、水浴锅、铁架台，烧杯，三角烧瓶，滤纸，试管，层析槽，毛细管等。 四、相关知识点 槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达12~20%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。 芸香苷（rutoside），分子式C27 H30 O16，分子量610.51，淡黄色针状结晶，mp.177~178℃。难溶于冷水（1﹕8000），略溶于热水（1﹕200），溶于热甲醇（1﹕7），冷甲醇（1﹕100），热乙醇（1﹕30），
冷乙醇（1﹕650），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。 槲皮素（quercetin ），分子式C 15 H 10 O 7，分子量302.23，黄色针状结晶，mp.314℃（分解）。溶于热乙醇（1﹕23），冷乙醇（1﹕300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水。 O O O H OH OH OH OR 五、实验步骤 （一）芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱鉴定 1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20 cm ×20 cm ，在滤纸下端约2 cm 处用铅笔画一直线，间隔2 cm 分别点上下列样品或标准溶液： （1）糖样品溶液 （2）标准葡萄糖溶液 （3）标准鼠李糖溶液 （4）芸香苷样品甲醇溶液 （5）芸香苷标准品溶液 （6） 槲皮素样品甲醇溶液 （7）槲皮素标准品溶液 2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4﹕1﹕5）上层上行展开。 3、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置。待溶剂挥尽后，在（3）与（4）点之间剪开，分别显色。 （1）糖的显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，在105℃烘10分钟，
举例说明黄酮的提取分离方法 组长：崔宁 组员：翟雪王璐璐冯子涵赵子惠罗春雨刘红成 1.提取方法 1.1热水提取法 热水提取法一般仅限于提取苷类. 在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素. 此工艺成本低、安全,适合于工业化大生产。以水做溶剂,同时提高浸提温度、延长浸提时间和增加液料比(60倍) ,可以明显提高芦丁的产率。 实例 桑叶：采用热水提取法测定桑叶中各有效成分含量，发现黄酮类化合物含量为1%以上,其中霜后桑叶黄酮类化合物含量最高为1.54% ,其次是晚秋桑叶,春季桑芽和后期桑叶含量最低。 甘草：过去甘草黄酮的提取主要为水提法,其主要原理通过甘草粉与水按一定配比,加热混合至80～95 ℃浸提甘草粉,利用甘草黄酮的水溶性进而提取甘草黄酮。此法虽然要求设备简单,但因提取杂质多、提取时间长、提取液存放易腐败变质、后续过滤操作困难、收率较低等缺点,现已不常使用。 1.2有机溶剂萃取法 其原理是利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同的溶剂萃取。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,一般采取乙醇为提取溶剂。高浓度的乙醇(如90 %～95 %) 适于提取苷元,浓度60 %左右的乙醇适于提取苷类。提取次数一般为2～4 次,提取方法有热 回流提取和冷浸提取两种方式。 实例 桑叶：使用乙醇提取桑叶中总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇的浓度为70%，料液比为1:15，在80℃的条件下浸泡3h。使用多种有机溶剂提取发现桑叶中黄酮类化合物的最佳提取溶剂是60%丙酮。 西芹：使用无水乙醇为提取剂，按西芹鲜重与提取剂的比例(W/ V) 1∶2 ,在80 ℃下回流提取2～4h ,制备西芹总黄酮。 银杏叶：从银杏叶中提取总黄酮时, 随乙醇浓度的增加总黄酮提取率逐渐上升, 当乙醇浓度增至70% 时提取率最高, 之后反而下降, 故选用70% 的乙醇作浸提剂最佳。 生姜：生姜黄酮提取用40倍原料的90%甲醇溶液, 在60 ~ 65℃条件下提取4 h 为其优化组合, 而其试验组合中以用40倍原料的75%甲醇溶液,在60~ 65 ℃条件下提取2 h的提取效果最好。 1.3碱性水或碱性稀醇提取法 黄酮类化合物大多具有酚羟基, 易溶于碱水, 酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黄酮酚羟基的酸性, 二是由于黄酮母核在碱性条件下开环, 形成2′-羟基查耳酮, 极性增大而溶解。因此可用碱性水( 碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 50 %乙醇) 浸出, 浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。 实例 菊花：各取5g干菊花4份, ，在80℃恒温水浴分别以pH为8,9,10,11的NaOH溶液分两次温浸1h和0.5h。pH降低时.由于提取不完全.含量较低；pH为11时,虽然黄酮
黄酮提取工艺 2-1 微波辅助提取金银花总黄酮工艺流程图 3.实验方法 3.1 标准曲线的制备 3.1.1最大吸收波长的选择方法 以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510nm处均有1个强吸收峰，因此选择510nm为测定波长。 3.1.2对照品溶液的制备方法 精密称取芦丁对照品10.2mg置50mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。 3.1.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在510nm处测定吸光度，以对照品量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3.2 微波提取单因素实验方法 分别考察不同的微波辐射功率,辐射时间,乙醇浓度,固液比对提取效果的影响 3.3 提取工艺正交试验设计方法 系统考察微波提取法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用微波辐射功率（A），辐射时间（B），乙醇浓度（C），固液比（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表设计，得到供试液。 3.4微波辅助提取法与乙醇回流法比较 比较两种提取方法的处理时间和液固比对总黄酮提取量的影响。传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低;而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮含量。 3.5总黄酮含量测定方法 取0.5mL液，加入5%亚硝酸溶液0.3mL荡摇匀，放置6min加入10%硝酸铝0.3mL荡摇匀，放置6min入4%氢氧化钠试液4mL，30%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min分光光度法，在510nm定吸光度值由标准曲线计算得总黄酮含量。 4. 结果 4.1 标准曲线绘制 表4-1 标准曲线表 编号 0 1 2 3 4 5 芦丁浓度 0 0.02 0.03 0.05 0.07 0.09 （mg/mL） 吸光度 0 0.206 0.381 0.548 0.738 0.911 （OD）
溶剂提取法提取银杏叶中得黄酮实验报告 小组成员：周璟、胡静、左兵华、刘云飞 2014年5月一、实验目的 ⅰ）掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取 ⅱ）掌握紫外分光光度计的应用，以及origin软件绘图的基本操作ⅲ）学会自主设计实验，培养团队合作精神 二、实验原理 ⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用； ⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm; ⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因 为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。 其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二
酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应） 三、实验药品及仪器 ⑴药品：银杏叶（阴干碾碎储藏备用），芦丁，无水乙醇，亚硝酸钠，氯化铝和氢氧化钠； ⑵仪器：电子天平，旋转蒸发仪，索氏提取器，uv-1800型紫外分光光度计，研钵，比色皿，容量瓶（10ml*6,50ml*1,100ml*2），移液管，量筒，烧杯，玻璃棒。 四．实验步骤 Ⅰ）配制60%的乙醇溶液（黄酮同时具有水溶和油溶性）。 Ⅱ）准确称取10g银杏叶粉末置于索氏提取器中，加入60%的乙醇溶液10ml，回流提取3h，然后用旋转蒸发仪浓缩并回收乙醇溶液，抽滤得到银杏叶黄酮粗提物。再用60%的乙醇定容到100ml。 Ⅲ）芦丁标准液的配置：准确称取芦丁标准品0.005g，用60%的乙醇溶液加热溶解，并转移到50ml容量瓶内用乙醇溶液定容，摇匀，得质量浓度为0.1mg/ml的芦丁标准液。 Ⅳ）分别吸取上部配制的母液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml于6只10ml容量瓶中摇匀，先加入5%的亚硝酸钠0.5ml摇匀，静置6min，再加入10%的氯化铝溶液0.31ml，摇匀，静置6min，再加入4%的氢氧化钠溶液4ml，用60%的乙醇溶液定容到10ml，放置20min。其中，加入
银杏叶中黄酮提取及含量测定 一、实验目的 提取银杏叶中的总黄酮并测定其含量。 二、实验原理 银杏系银杏科银杏属落叶乔木，银杏叶中含有多种生理活性成分，其中黄酮类化合物是重要的生理活性物质，具有保肝护肝、预防治疗心血管疾病、抗氧化、抗衰老等作用。因此，将银杏叶作为高营养、保健功能价值的资源加以开发利用，这对于提高银杏叶综合利用率有重要意义。银杏叶黄酮类化合物的提取方法目前研究的有水浸取法，成本低但浸取率低；有机溶剂浸取法中，乙醇浸取的效率高且无毒，是目前采用较多的方法；韩玉谦等采用超临界流体萃取法，在70%乙醇溶液中加热回流法和CO2 超临界流体萃取法提取银杏叶中的活性成分，银杏黄酮回收率为84 . 4 % ，是常规萃取法回收率的2倍多；乙醇超声波浸取法, 黄酮提取率可达到8 6 . 7 %。银杏黄酮含量的测定常用分光光度法和高效液相色谱法。分光光度法自20世纪9 0年代以来一直是用来测定银杏黄酮的一种重要方法, 由于其成本低、便于操作等特点, 是一种快捷有效的方法[1]。本实验采用乙醇作溶剂进行索氏提取，建立了用Al(NO3)3显色法对芦丁标准品和银杏叶提取液进行光谱扫描测定银杏叶总黄酮含量的方法[2]。 三、实验仪器和试剂 材料：银杏叶粉末50g 试剂：标准芦丁样品，无水乙醇（600ml），50mlAl(NO3)3（0.1mol/L），乙醚，5%NaNO2溶液，10%AL(NO3)3，4%NaOH溶液。
仪器：紫外分光光度计、电子分析天平、水浴锅、烘箱、烧杯、容量瓶（100ml1个、50ml1个、10ml6个）、索氏提取器、减压蒸馏装置、锥形瓶、沸石等。 四、实验步骤 1.1提取银杏叶中总黄酮 （1）将银杏叶洗净, 在103℃下烘干至恒重,用研钵捣碎制得银杏叶粉（2）准确称取10.0g，置于索氏提取器中，按下列条件加热回流提取：乙醇浓度80％，料液比1：20(g／ml)，回流温度85℃，回流时间2 h，平行进行1~3次实验。 （3）将圆底烧瓶中提取液倒入烧杯，加入一倍蒸馏水，再加入相同量的乙醚，混合均匀，倒入分液漏斗中，静置20min，分层后，收集下层液体。 （4）减压蒸馏，回收乙醇，得到淡黄色黏液，干燥得到银杏叶中总黄酮提取物。 1.2银杏叶中总黄酮含量测定 （1）芦丁标准溶液的配置：称取0．0100g芦丁标准品，放入烧杯中，加入80%的乙醇溶液使其溶解，置于100ml的容量瓶中，制成0.1g/L的芦丁标准溶液。定容，摇匀备用。 （2）绘制芦丁标准曲线：分别移取0，0.4 ，0.8，1.2，1.6，2.0 ml 芦丁对照品溶液，于6个10ml 容量瓶中，标记1~6，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0ml的80%乙醇溶液，加入5%NaNO2溶液0.5ml，摇匀，放置6min，加入0.5ml10%AL(NO3)3，摇匀，放置6min，加入4%NaOH
银杏叶黄酮类化合物的提取研究进展 银杏树Ginkgo biloba L.又称白果树、公孙树，是我国古老的树种之一，具有“活化石”的美称。由于其生长规律特殊，抗病能力强而受到国内外的重视。有关银杏叶的有效成分及疗效的研究日益受到重视，已开发出保健品、化妆品、药品等多达100多种，形成国际市场上销售额20多亿美元的新兴产业。银杏叶的化学成分有黄酮类、萜类、内酯类、酚酸类以及生物碱、聚异戊二烯等化合物。黄酮类为银杏叶的主要有效成分之一，含量随品种、产地、树龄、不同的采摘时间而不同。黄酮类化合物优异的抗氧化、抗病毒、防治心血管疾病、增强免疫力等作用而受世人瞩目。 药学研究表明，有38种银杏黄酮类化合物从银杏叶中分离出来，其中黄酮类化合物主要有3类：黄酮(醇)及其昔28种：如槲皮黄酮等；黄烷醇类：如儿茶素等4种；双黄酮：如白果双黄酮等6种(儿茶素)。 1 银杏叶黄酮的提取分离 1.1 溶剂提取法目前国内外掀起了研究开发银杏叶热。国内银杏叶常用溶剂例如乙醇、丙酮、醋酸乙酯、水以及某些极性较大的混合溶剂浸泡银杏叶进行提取，溶剂提取方法一般有：煎煮、冷浸、回流、渗施等经典方法。 1.1.1 水提取树脂分离法有关水浸提银杏黄酮苷的文献报道不多。肖顺昌等报道了用l 6倍量沸水分3次浸提银杏叶，得到的水溶液，经冷藏、分离杂质得溶液，然后用D101型吸附树脂吸附得到浓度达38％的黄酮苷。胡敏等研究水浸提银杏叶黄酮苷并用树脂精制的工艺，探讨了影响黄酮苷浸出的主要因素以及最适的精制方法，结果表明：水为提取剂，在9 0℃水溶回流浸提银杏叶2次，4h／次，经沉淀，过滤，浓缩后，用树脂精制、冷冻干燥后，制得总黄酮苷含量高的提取物、产品得率为银杏叶干重的 1.2％-1.5％。 水提取成本低，没有任何环境污染，产品安全性高，但是水对有效成分的选择性差，提取率低。
２００６年第１３卷第６期 化工生产与技术ＣｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ !!!!!!" !" !!!!!!" !" 研究与开发 收稿日期：２００６－１０－１０ 以银杏叶提取物（ＧＢＥ）为原料制成的药物具有清除自由基，防止脑缺血和脑水肿，改善脑功能等多种作用。银杏叶制剂还可用于保健食品和化妆品等［１，２］。银杏叶中黄酮类化合物的提取直接决定着银杏叶的药用价值，因而成为国内外的研究热点。 提取方法最早用水浸提法，此方法具有设备简单、成本低且对环境和人类无毒害的特点，但提取率偏低、杂质含量较高，后处理难度大。有机溶剂法尤其酮、醇提取法是相当经典的方法，比如用丙酮作为提取剂的方法有：（１）丙酮提取－四氯化碳萃取法；（２）丙酮提取－氢氧化铅沉淀法；（３）丙酮提取－氨水沉淀法；（４）丙酮提取－硅藻土过滤法。（１）法工艺产品黄酮含量太低，达不到标准，（２）～（４）法工艺虽然能较好地从银杏叶中提取出有效成分含量较高的提取物，但它们存在着很多缺点。例如，使用了丁酮、四氯化碳等有毒害溶剂等，产品中无法避免这些物质的残留；操作复杂和步骤多，导致ＧＢＥ收率低且最终精制品的质量不够稳定。 随着超临界流体提取技术的迅速发展，应用该技术提取植物中活性成分已越来越广泛，与有机溶剂提取法相比，超临界流体萃取方法具有产品收率高、质量好、有效成分破坏少、无溶剂残留、操作方便等优点。但是超临界流体萃取法设备规模较大、技术要求高、投资大，安全操作要求高，难以用于较大规模的生产。乙醇和丙酮对活性成分提取率相近，但考虑到溶剂的成本和操作的安全性，使用乙醇水溶液比丙酮水溶液更合适。因此采用乙醇－水 为提取剂，对影响浸取的主要因素进行了研究。 １ 实验部分 １．１ 主要材料、试剂及仪器 银杏叶：产于连云港花果山，自采；氢氧化钠、无 水乙醇、硝酸铝、芦丁、亚硝酸钠、二氯甲烷和甲醇，均为分析纯。 ７２３可见分光光度计，ＤＦ－１型集热式磁力搅拌 器，ＲＥ－５２８５Ａ型旋转蒸发器，恒温水浴锅，电热鼓风干燥箱，ＳＨＺ－ＣＤ型循环水式真空泵，等。１．２工艺流程 采用有机溶剂提取法，因为甲醇和丙酮具有毒性，所以采用乙醇－水作为提取剂比较合适［３］。 ＧＢＥ的提取工艺流程如下： 干燥银杏叶→粉碎→浸取→过滤→减压蒸馏→银杏浸膏粗提物→二氯甲烷萃取→减压除去溶剂→干燥→产物。 １．３银杏叶中总黄酮含量的测定 将银杏叶洗净，在低温下烘干至恒重，准确称取 ２ｇ，置于索氏提取器中用甲醇回流提取至提取液无色；提取液经浓缩，并转入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，取１ｍＬ按照标准曲线的作法测定吸光度［４］，水浴温度控制在７５℃左右。 银杏叶中总黄酮的质量分数＝５０×ρ１／ｍ１，ρ１为银杏叶中总黄酮的质量浓度，ｍｇ／ｍＬ；ｍ１为银杏叶质 量，ｍｇ。 本实验中银杏叶中总黄酮的质量分数＝５０×０．７／ 银杏叶中黄酮类化合物的提取工艺研究 朱平华 （淮海工学院化工系，江苏连云港２２２００５） 摘要 对银杏叶中黄酮类化合物的提取工艺进行了研究，通过单因素试验和Ｌ９（３３）正交试 验，研究了浸取温度、乙醇含量和固液质量比对黄酮类化合物提取率的影响。结果显示温度是影响提取率的主要因素，最佳工艺为浸取温度８０℃，乙醇的体积分数为７０％和固液质量比１：７，银杏叶中黄酮类化合物的浸出率可达到９２．３％。关键词 银杏叶；黄酮类化合物；乙醇；提取 中图分类号ＴＱ２３４．２＋１，ＴＱ４６０．６＋１文献标识码Ａ文章编号１００６－６８２９（２００６）０６－００２５－０３ ?２５ ?
一.黄酮类化合物的提取分离方法 按所用溶剂不同分类 (1)热水提取法(以水作溶剂)---------- 灵芝多糖热水提取 (2)有机溶剂萃取法-----------生产茶多酚工业试验、乳酸 (3)碱提取酸沉淀法.---------- 橙皮苷、黄芩苷、芦丁等都可用此法提取. 2.按提取条件不同分类 (1)回流提取法----------从苦楝树皮中提取苦楝素 (2)索式提取法----------柑橘属类黄酮 (3)微波辅助提取法----------采用微波辅助法从黎蒿中提取黄酮类化合物 (4)超声提取法----------提取山楂中黄酮类物质 (5)超滤法----------黄岑甙 (6)酶提取法----------采用纤维素酶对红景天进行酶解处理,可提高黄酮类物质的浸出率 (7)超临界流体提取法----------竹叶黄酮、从干姜片中提取挥发油 PH 梯度萃取法：石榴果皮褐变产物、葛花总异黄酮 高效液相色谱分析法：五味子、葛根 高速逆流色谱分离法：甘草、分离蜜环菌发酵液乙醇提取部位 柱色谱法 （1）硅胶柱色谱：姜黄素 （2）聚酰胺柱色谱：紫锥菊 （3）葡聚糖凝胶柱色谱：回心草、茵陈蒿 （4）大孔吸附树脂分离法：川草乌、三七总皂甙 二. 槐米中芸香苷（芦丁）的提取方法有哪些（设计） 方法：渗漉法、煎煮法、回流提取法 （1） 槐米粗粉20g 加约120ml 的%硼砂水溶液， 搅拌下加入石灰乳至pH8-9， 并保持该pH 值煮沸20分钟，四层纱布 趁热滤过，反复2次 提取液 药渣 浓盐酸调pH2~3 搅拌，静置放冷，滤过。 滤液 沉淀 热水或乙醇重结晶 芸香苷结晶 碱溶酸沉法提取分离槐米中芸香苷的流程图 （2）取30g 槐花米，置于250mL 烧杯中，加入%硼砂沸水200ml ，在搅拌下缓缓加入石灰乳调节pH=8～9，在此pH 下保持微沸20～30min ，趁热用棉花滤过，残渣再加水，同上法再煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在60～70℃下用浓盐酸调至pH=4—5，静置。 提 碱 取 溶 分 酸 离 沉
一、溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备基础上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附．洗脱法。以60％丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最佳萃取条件为萃取5 min温度60℃4次，萃取物中黄酮苷含量为57％。V水：V正丙醇=1:25最佳。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80％乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH值为3—4酸水和酸性25％乙醇洗涤，75％乙醇洗脱，喷雾干燥将银杏叶洗净，于60℃烘干至恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中加入60％乙醇至250．0 ml，80℃下回流提取3．0 h，蒸馏回收乙醇，并用活性炭脱色，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50％一70％时,提取率随浓度增加提高，当浓度70％时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80℃时提取率达最大。提取时间为三小时为佳。 黄酮类化合物（英语：Flavonoid，又称类黄酮[1]）是指基本母核为2-苯基色原酮类化合物，现在则泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一系列化合物。他们来自于水果、蔬菜、茶、葡萄酒、种子或是植物根。虽然他们不被认为是维生素，但是在生物体内的反应里，被认为有营养功能，曾被称为“维生素P”： 黄酮类（英语：Flavones）是一类基于2-苯基色原酮-4-酮（2-苯基-1-苯并吡喃-4-酮）骨架的黄酮类化合物，如右图所示。 银杏叶黄酮的研究程序 溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机