引物设计原则
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详细介绍：
PCR引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度(product length)，序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值，在错配位点(false priming site)的引发效率，引物及产物的GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
6. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低(绝对值不超过9)，而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
[2] 扩增较大片段DNA的PCR方法
一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：
通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性
(3'-editing-exonuclease)，可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到
10*-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶I Klenow 片段)或AmpliTaq(全长的Taq DNA聚合酶)等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶(如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株)有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb 以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟(10倍于通常所需)亦无改进。
利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增
美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将Pfu DNA 聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。
控制脱嘌呤反应增强扩增效率
在PCR反应体系中某些成分耐热性较差，会影响反应效率。DNA聚合酶的热稳定
性一般都是较好的，可能是模板DNA在温度较高的环境中某些位点发生脱嘌呤反应从而阻碍反应的顺利进行。Lindahl和Nyberg的研究结果显示：在70℃ pH7.4的条件下，单链DNA脱嘌呤反应的速度是双链DNA的4倍；100℃ pH7.0时，100kb的碱基中每分钟将有1个位点脱嘌呤。这一反应与缓冲体系中酸碱度的变化有关。人们注意到：三羟甲基氨基甲烷(Tris)的酸解离常数(pKa)会随温度升高而改变，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃时pH8.55的PCR 反应体系，到95℃热变性时，pH值将变为6.45，这就很可能诱导脱嘌呤反应。为了解决这一问题，可以采取下列措施：
缩短热变性时间，Barnes等在扩增35kb的大片段时，变性条件为95℃5秒，取得满意结果；
尽可能使升温、降温过程缩短，可选择使用导热性能优越的薄壁反应管及较为先进的扩增设备；
适当提高反应体系的pH值，反应最初应控制在pH8.8-9.2范围；
适当增加延伸时间(可长至20分钟)。使用这种方法可以扩增最大为35kb的DNA 片段，产物的准确性亦有充分保证，克服了以往基因克隆过程中出现的DNA分子内的碱基重排和可能的毒性危险等问题。
[3] PCR常见问题
PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1(插入片段：载体)常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss 单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A)涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B)转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10(3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug
转化pGEM-T应用10(8次方)cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C)如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞)，表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801，M1804，M1794)质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA
连接酶替换。
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A)连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4oC过夜。
B)插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T
Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。
E)高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成
产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对
于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域 内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。 16.TM值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ①引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
The central role of UDPGDH played in capsule and other polysaccharides synthesis. KPS, capsule polysaccharide; LPS,lipopolysaccharide 简并引物设计方法 （1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。 （2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X，也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。 （3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp 之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。 若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。 （4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 （5）对引物的修饰若得到的引物为： 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3 则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度很高不利于PCR，可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。 这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。 简并引物设计原则
PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二
级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）
PCR引物设计原理及原则 PCR引物设计原理 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量
mi引物设计原则 1、引物的长度一般为15-30 bp,常用的就是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。 3、引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其她3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 4、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo软件中使用的就是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6、ΔG值就是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7、引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8、对引物的修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都就是写成5-3方向的, Tm之间的差异最好控制在1度之内, 另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链就是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不
引物设计的原理与方法 The latest revision on November 22, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5.碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应具有互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
引物设计原则： 引物的3’端决定着PCR反应产物的特异性，而5’端限定着PCR产物的长度。 （1）引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。 在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配，特别是3’ 端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 （2）引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配，降低特异性，而太长也会降低特异性，并且影响PCR反应效率。 引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的 互补。 （3）引物的碱基应尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量在40%~75%之间，且上下游引物序列GC含量的差异不要 太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或 C。DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减 （4）引物的内部应避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构，特别是引物的末端应无回文结构。上下游引物不应有互补序列，特别是3’端应避免 互补，以免形成引物二聚体。 （5）如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。 而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。（6）5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。 （7）引物3’端的头1~2个碱基会影响T aqDNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性。一般的PCR反应中，引物3’末端 的碱基最好选T、C、G而不选A，A错配时会影响合成效率。 （8）引物3’端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码子少的氨基酸如Met、Trp，且避免三联体密码第三个碱基的摆动未知位于引物的3’端。3’ 端不应终止于密码子的简并碱基。
引物设计原则（汇总） 普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）： 1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性； 2. 下载基因序列到Vector NTI； 3. 找到所需安装载体序列； 4. 将基因序列的CDS高亮标记； 5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列； 6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子； 8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码； 9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。 2011年10月18日左洁 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
引物设计 一、软件使用： ●推荐软件：Primer Premier 5.0 ●优点：操作简单、显示各种参数改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等 ●缺点：没有明显缺点 ●本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar； DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). ●网上同类软件：Primer3（Whitehead Institute 开发）；JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好 这两种软件。独特之处在于：对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物 对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基 因组PCR的用户试用。 二、推荐操作： ●引物搜索：Primer Premier 5.0 ●引物评价：Oligo 6.22 三、引物设计的原则: 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
一、引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。 ②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的T m值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小些，最好不要超过9。 ③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。 ④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。 Analyze中第四项为Composition and T m，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T m值可以控制在50～70度之间。 第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以
引物设计需要注意事项 一、PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
PCR引物设计基本思路 1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询 RBS149..153 /gene="eryF" CDS158..1372 /gene="eryF" 1ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc 61tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg 121gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgtatg acgaccgttc ccgatctcga 181aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc 241ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc 301gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt 361ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac 421caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga 481gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct 541gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct 601gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg 661gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc 721ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg 781cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc 841cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag
引物设计原则及酶切位点选择和设计 [整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二）设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同buffer的酶。 最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。 Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。 其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。