实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色
一、目的要求
1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理
对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
三、实验器材与试剂
1.菌种：枯草芽胞杆菌12-18小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌24小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2.溶液和试剂：草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液、吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用碘液、乳酸石炭酸棉蓝染液。
3.仪器和其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸和接种环、接种铲、接种针、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、玻璃纸、平皿、U型玻璃棒、滴管、解剖针、解剖刀、生理盐水50%乙醇、20%甘油、高氏一号培养基平板、马铃薯琼脂薄层平板等。
四、操作步骤
安全警示
1.加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂。
2.使用燃料时避免占到衣服上。
3.进行放线菌和霉菌制片时减少空气流动，避免吸入孢子。
4.实验完毕后洗手，金黄色铺头球菌为条件致病菌，二甲苯为有毒物质。
（一）细菌制片及简单染色
1.涂片
取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域标记；各滴一小滴生理盐水与两个区域中央；用接种环无菌操作分别有枯草芽胞杆菌营养琼脂斜面和金环色葡萄球菌营养琼脂细面挑取适量菌苔，将占有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1-2环菌液直接涂于载玻片上。
2.干燥
自然干燥或用电吹风干燥。
3.固定
涂菌面朝上，通过火焰2-3次。
4.染色
将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖图菌部位即可，吕氏碱性美蓝染液1.5分钟，结晶紫染液或齐氏石碳酸复红染液1分钟。
5.水洗
倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，不要直接冲涂片处，至洗出水无色为止。6.干燥
用吸水纸洗去过多水分，自然干燥或电吹风吹干。
7.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。
获得本实验成功关键
1.涂片时取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免贪多造成菌体堆积而难以看清细胞具体形态。同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。
2.无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温时菌体变形。
3.必须等涂片干燥后加热固定，避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形。
(二)革兰氏染色法
一、目的要求
1、学习并掌握革兰氏染色法
2、了解革兰氏染色原理。
3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理
革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。阳性细菌细胞壁上肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网口收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）
三、实验器材与试剂
1.菌种：大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2.溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液95%乙醇、番红复染液等。
3.仪器和其它用品：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管架、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、滤纸、滴管和无菌生理盐水等。
本实验为什么采用上述生物？
大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰式阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着不同染色，同时，由于两者具有不同的个体形态，在它们的混合图片上进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。
四、操作步骤
1、制片
取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。
2、初染
低价草酸铵结晶紫染液覆盖图菌部位，染色1-2min红倾去染液，水洗至流出水无色。
3、媒染
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，在用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
4、脱色
将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般20-30s）当流出液体无色时立即用水洗去乙醇。
5、复染
将玻片上残留水用吸水纸吸取，用番红复染液染色2min，吸去残水晾干。
6、镜检
油镜观察。
7、混合涂片染色
在载玻片同一区域用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，其他步骤如上。
获得本实验成功的关键
选用活跃期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
涂片不宜过厚，脱色不完全造成假阳性。
脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
五、实验结果与讨论
1.结果（1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。
（2）填写表
菌名
菌体颜色
细菌形态
结果
大肠杆菌
金黄色葡头球菌
2思考题
(1)革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？
(2)现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你的染色结果的正确性？
(3)为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阳性？
(4)你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？
(5)Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌（如肺炎球菌）保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，为什么肺部组织细胞未被染上蓝紫色？
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实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类
物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
Role of Special Histochemical Stains in Staining Microorganisms Rashmil Saxena, BFA, HT(ASCP)CM Division of Transplantation Department of Surgery, Indiana University Indianapolis, IN, USA M icroorganisms encountered in routine pathology specimens include bacteria, fungi, protozoa and viruses1. Several histochemical stains help to visualize the first three groups of organisms; however, histochemical stains do not offer an advantage over H&E in the visualization of viruses and immunohistochemistry is the preferred method for this purpose. Histochemical stains also help to identify and classify bacteria, fungi and protozoa. The Giemsa and Gram’s stains help to visualize bacteria as well as classify them on their morphological characteristics. Thus bacteria can be classified into cocci or bacilli and cocci can be further classified into diplococci, staphylococci and streptococci based on their appearances on the Gram and Giemsa stains. The Gram stain also classifies bacteria into Gram-positive and Gram-negative organisms depending upon whether they take up the Gram stain or not; this classification is clinically useful and helps in therapeutic decisions. Some bacteria may not be adequately visualized with the Gram’s and Giemsa stains. Of these, the clinically most significant ones are mycobacteria and spirochetes. Mycobacteria stain with carbol fuschin and resist decolorization with acid-alcohol, leading to their designation as “acid-fast bacilli”. Spirochetes can be stained with a variety of silver stains such as the Warthin-Starry, Dieterle and Steiner stains. Finally, due to the large number of gastrointestinal biopsies in routine practice, a large number of stains are available for visualization of the Gram-negative bacillus, Helicobacter pylori. These include Giemsa, Alcian yellow - toludine blue, Diff-Quik, Genta, and Sayeed stains. A large number of laboratories prefer immunohistochemistry for identification of Helicobacter pylori. The Giemsa stain highlights several protozoa such as toxoplasma, leishmania, plasmodium, trichomonas, cryptosporidia and giardia. Ameba can be highlighted by the PAS stain due to their large glycogen content. Histochemical stains for fungi are discussed separately in this publication. Special Stains for Detection of Bacteria Gram Stain Utility of the Stain: The Gram stain is used to stain both bacillary and coccal forms of bacteria (Fig. 1). The most basic classification of bacteria consists of dividing them into Gram-positive and Gram negative bacteria based on whether they take up the Gram’s stain or not. Although the exact mechanism of staining is not known, bacteria that have large amounts of peptidoglycan in their walls retain the methyl violet stain, i.e., they are gram positive, whereas those that have more lipids and lipopolysaccharides in their cell walls are Gram-negative. The definite diagnosis of a bacterial species requires culture but the Gram stain provides a good initial indication of the nature of infection. 1 Some microbiologists also include viruses as microorganisms, but others consider these as non-living. Lwoff (1957). “The concept of virus”. J. Gen. Microbiol. 17 (2): 239–53. T echnical Articles
微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：
实验一：细菌、放线菌的形态 观察与革兰氏染色 姓名:陈虹邑 学号：200911233012 系别：生物科学与生物技术 班级：周二第一组 试验日期：2011年9月13日 同组成员：邢悦婷呼波
一、实验目的及意义 1、巩固油镜的使用; 2、掌握细菌形态观察的基本方法； 3、了解细菌的基本形态和结构。 4、了解革兰氏染色的原理； 5、初步掌握细菌涂片的方法； 6、掌握革兰氏染色的方法； 7、掌握放线菌的涂片方法； 8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 二、实验材料与方法 【实验材料】 菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌 （staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli） 试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液 仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯 【实验方法】 细菌的观察 1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片 上，盖上盖玻片。 2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话， 再用油镜观察。 3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油 镜观察，找到细菌的各种结构。
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用 一、实验目的 以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、显微镜油镜使用的原理 1 普通光学显微镜的基本构造 （1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2 显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55μm） n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、实验材料 1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。 2 细菌三种形态的玻片染色标本。 3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤 1 染色细菌玻片的油镜观查 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光亮度。 （3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。 （8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。 2 活菌制片观察 取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。 五、实验报告 油镜使用的原理 六、思考题 1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 七、实验注意事项 1 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4 观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。 2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验原理 1 简单染色的原理
实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色 赵奕玲 121180169 一．实验目的 1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤； 2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点； 3．掌握芽胞染色的步骤要点； 4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果； 5．学习无菌操作技术。 二．实验原理 一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。 虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。 芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。 芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较 困难。因此，用着色力强的染色剂（如孔 雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料 不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢， 进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽 孢的染色的染料则难以透出，若再用复染 液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保 留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的 颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色 易于区分。 三．实验器材 载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液； 结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液； 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌 平板，大肠杆菌平板，牙垢。 四．实验步骤 （一）革兰氏染色 1.涂片 左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。 室温下自然干燥。
实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常
用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。
简单染色法与革兰氏染色法 （一）细菌的简单染色法 1 目的 1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 1.2 掌握细菌的简单染色法。 1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 2 原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 3 材料 3.1 菌种 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。 3.2 染色剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 3.3 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 4 流程
实验细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求 1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 二、实验原理 细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 菌种：培养24小时的大肠杆菌 染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)，香柏油、二甲苯 器材和器皿：显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等 四、操作方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
图片简介: 本技术介绍了一种微生物染色装置，涉及医疗卫生临床检验设备领域，包括箱体，箱体内设有放置台和安装台，安装台上设有试管，试管底部设有控制试管启闭的开关机构；箱体内位于放置台的下方设有水池，还包括用于驱动水池升降的驱动机构，水池连通有控制水流进和流出的执行机构；箱体底部设有用于产生热风的送风装置，箱体顶壁开设有通孔；开关机构、驱动机构和执行机构信号连接有控制器；箱体内壁固接有位于水池上方的环形导流带，环形导流带远离箱体内壁的一侧向箱体内壁弯曲；水池底部设有环形导轨，环形导轨内滑动连接有滑动杆，滑动杆的顶端固接有高于水池的帆状物，帆状物能够将风能转换为动能，帆状物靠近水池内壁的一侧能够与水池内壁接触。 技术要求
1.一种微生物染色装置，包括箱体，箱体内设有用于放置载玻片的放置台，放置台的上方设有安装台，安装台上设有用于盛装染色液的试管，试管底部设有控制试管启闭的开关机构；箱体内位于放置台的下方设有水池，还包括用于驱动水池升降的驱动机构，水池连通有控制水流进和流出的执行机构；箱体底部设有用于产生热风的送风装置，箱体顶壁开设有通孔；开关机构、驱动机构和执行机构信号连接有控制器；其特征在于： 所述箱体内壁固接有位于水池上方的环形导流带，所述环形导流带远离箱体内壁的一侧向箱体内壁弯曲；所述水池底部设有环形导轨，环形导轨内滑动连接有滑动杆，滑动杆的顶端固接有高于水池的帆状物，所述帆状物能够将风能转换为动能，帆状物靠近水池内壁的一侧能够与水池内壁接触。 2.根据权利要求1所述的微生物染色装置，其特征在于：所述帆状物为与滑动杆的顶端固接的帆叶，所述帆叶倾斜设置，滑动杆靠近水池内壁的一侧设有刮板，刮板与水池内壁接触的一侧设有刷毛。 3.根据权利要求1所述的微生物染色装置，其特征在于：所述环形导流带包括固定部和弹性形变部，所述环形导流带通过固定部与箱体内壁固接，所述环形导流带的弹性形变部位于放置台的上方，所述箱体顶壁设有多个电动推杆，电动推杆输出端的端部与环形导流带的弹性形变部固接，电动推杆与控制器信号连接。 4.根据权利要求3所述的微生物染色装置，其特征在于：箱体内顶壁固接有步进电机，步进电机输出轴端部与所述安装台同轴固接；安装台沿其周向开设有多个圆孔，所述试管放置在圆孔上；放置台上开设有与试管中心位置对应的用于放置载玻片的凹槽，试管底部还设有与控制器信号连接的反射式光电传感器，步进电机与所述控制器信号连接，控制器信号连接有计时器，计时器设有第一时间阈值、第二时间阈值、第三时间阈值和第四时间阈值，当反射式光电传感器检测到载玻片反射信号时，控制器同时控制步进电机停止、开关机构打开、计时器开始计时和执行机构放水，当计时器计时第一时间阈值结束后，控制器控制微型电磁阀关闭；当计时器计时第二时间阈值结束后，控制器启动驱动机构将水池上升至将载玻片浸没；当计时器计时第三时间阈值结束后，控制器控制驱动机构复位，同时控制电动推杆的输出端收回；当计时器计时第四时间阈值结束后，控制器同时控制步进电机启动、计时器清零和电动推杆复位。
实验二细菌的普通染色和革兰氏染色 一、实验目的 1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤； 2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点； 3．识别细菌的革兰氏染色结果； 4．学习无菌操作技术。 二、实验原理 一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。 虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。 三、实验器材 载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液； 结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液； 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。 四、实验步骤 1、涂片 左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。 室温下自然干燥。 2、固定 手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 3、初染 滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。 4、媒染 用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。 5、脱色 用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。 6、复染 滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验 实验目的 1.学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。、 2.巩固显微镜的使用方法。 基本原理 1.简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。此法操作简单，适用于一般形态的观察。 在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。 2.革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌 上最常用的鉴别染色法。该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。 革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。 器材 1.活材料，培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。 2.染色液和试剂，碱性美兰，结晶紫，碘页，95%酒精，石炭酸复红，蒸馏水，乙醚-乙醇 混合液，香柏油。 3.器材，废液缸，洗瓶，载玻片，接种杯，酒精灯，擦镜纸和显微镜。 操作步骤 1.涂片，取干净的载玻片与实验台上，在正面边角作记号，并滴一滴无菌蒸馏水与载玻片 中央，灼烧接种杯，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混均后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2.干燥，干燥过程最好在空气中自然晒干，为了加速干燥，也可以在微小火焰上方烘干。 烘干后再在火焰上方快速通过3-4次，使菌体完全固定在载玻片上。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。 3.染色，滴加草酸铵结晶紫染色1-2min,染色液量以盖满菌膜为宜。 4.水洗，倾去染液，斜置载玻片，用水冲去多余染液，直至流出的水呈无色为止。 5.干燥，用微热烘干或自然晾干。 6.镜检，按显微镜的操作步骤观察细菌形态，及时记录，并进行形态图绘制。 革兰氏染色 各种细菌经革兰氏染色法染色后，能区分成两大类，一类最终染色成紫色，称为革兰
微生实验报告 姓名：王晶晖 专业年级：2011级生物技术 学号：040312011032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。 3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干：让涂片自然晾干。 3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。 4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min 5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。 6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。 （二）革兰氏染色
实验6 细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 内容：1．制作细菌染色装片。 2．进行革兰氏染色法操作。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌菌液，待测菌菌液1～2种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 三、操作步骤 (一)制片 1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2．干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 l．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。 3．脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。 4．复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 5．滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、实验报告 (一)绘图 1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 (三)未知菌的检测结果。 六、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。
实验原理： 1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。 2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 实验步骤： 一、标本的制备： 1、涂片： 取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。 2、干燥： 目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。 3、固定：
手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 二、染色 1、初染： 将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。 2、媒染： 加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。 3、脱色： 在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。 4、复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。 5、镜检。 实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，