基因工程技术
百科名片
DNA与基因工程
基因工程技术:将重组对象的目的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术.
目录
概念
1基因工程的概念A 重组DNA技术的基本定义
1B 基因工程的基本定义
1基因工程诞生的理论依据（1）DNA是遗传物质
1（2）DNA双螺旋结构
1（3）中心法则和遗传密码
1（4）基因是可切割的
1（5）基因是可以转移的
1（6）多肽与基因之间存在对应关系
1（7）基因可以通过复制把遗传信息传递
1基因工程的发展史（1）基因工程的准备阶段
1（2）基因工程问世
1（3）基因工程的迅速发展阶段
1一、基础研究2、基因工程受体系统的研究
13、目的基因研究
14、基因工程工具酶的研究
15、基因工程新技术研究
二、应用研究
基因工程的应用和发展
1基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患
1二、重组DNA研究的安全准则
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编辑本段概念
基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规模合成.80年代以来,表达真核cDNA,细菌毒素和病毒抗原基因等,为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径. 基因工程技术生产药品的优点:生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽,胰岛素,干扰素等,细胞因子等; 可以提供足够数量的生理活性物质;发现更多内源生理活性物质;定向改变内源生理活性物质;获得新化合物,扩大药物来源
编辑本段基因工程的概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。
编辑本段基因工程诞生的理论依据
（1）DNA是遗传物质
不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA上，但是这些病毒的RNA 仍可以通过反转录产生。DNA并不影响不同基因的重组或互换。A：肺炎双球菌转化实验1944年美国微生物学家Avery，通过细菌（肺炎链球菌）转化（有毒与无毒）研究确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。B：噬菌体转染实验1952年Alfred Hershy和Marsha Chase用标记物的噬菌体（P32和S35）感染大肠杆菌，发现只有P32标记的DNA注入寄主细胞才能繁殖下一代进一步证明遗传物质是DNA。
（2）DNA双螺旋结构
1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。
（3）中心法则和遗传密码
遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨基酸。现在，基因是可以人工会成的。
（4）基因是可切割的
基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。
（5）基因是可以转移的
基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。由此表明基因不仅是可转移的，
（6）多肽与基因之间存在对应关系
现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。
（7）基因可以通过复制把遗传信息传递
经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
编辑本段基因工程的发展史
基因工程是在生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科的研究成果基础上逐步发展起来的。基因工程研究的发展大致可分为以下几个阶段：
（1）基因工程的准备阶段
理论上的准备：1944年，美国微生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA 是基因载体。从此之后，对DNA构型开展了广泛研究，至1953年Watson和Crick 建立了DNA分子的双螺旋模型。在此基础上进一步研究DNA的遗传信息，1958年至1971年先后确立了中心法则，破译了64种密码子，成功地揭示了遗传信息的流向和表达问题。以上研究成果为基因工程问世提供了理论上的准备。技术上的准备：20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA 分子进行体外切割和连接成为可能。1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子是如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子（DNA）是承载外源DNA片段的理想载体，病毒、噬菌体的DNA（或RNA）也可改建成载体。至此，为基因工程问世在技术上做好了准备。（2）基因工程问世
在理论上和技术上有了充分准备后，于1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，同时又与别人合作，将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已正式问世，不仅宣告质粒分子可以作为基因克隆载体，能携带外源DNA导人宿主细胞，并且证实真核生物的基因可以转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能表达。
（3）基因工程的迅速发展阶段
自基因工程问世以来的这二十几年是基因工程迅速发展的阶段。不仅发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种供转化（或转导）原核生物和动物、植物细胞的载体，获得了大量转基因菌株，而且于1980年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠，1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。基因工程基础研究的进展，推动了基因工程应用的迅速发展。用基因工程技术研制生产的贵重药物，至今已上市的有50种左右，上百种药物正在进行！临床试验，更多的药物处于前期实验室研究阶段。转基因植物的研究也有很大的进展，自从1986年首次批准转基因烟草进行田间试验以来，至1994年11月短短几年，全世界批准进行田间试验的转基因植物就有1467例。又过4年，至1998年4月已达4387项。转基因动物研究的发展虽不如转基因植物研究的那样快，但也已获得了转生长激素基因鱼。转生长激素基因猪和抗猪瘟病转基因猪等。如果说20世纪八九十年
代是基因工程基础研究趋向成熟，应用研究初露锋芒的阶段，那么21世纪初将是基因工程应用研究的鼎盛时期，农、林。牧、渔、医的很多产品上都会打上基因工程的标记。基因工程的研究内容
编辑本段一、基础研究
基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和cDNA文库，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。
1、基因工程克隆载体的研究基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程研究首先得以迅速发展。Ti质粒的发现以及成功地构建了Ti质粒衍生的克隆载体后，植物基因工程研究随之就迅速发展起来。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体还须大力发展。
2、基因工程受体系统的研究
基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即原核生物和真核生物。原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，应用技术成熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主；以大肠杆菌为受体建立了一系列基因组文库和cDNA文库，以及大量转基因工程菌株，开发了一批已投入市场的基因工程产品。蓝细菌（蓝藻）是进行植物型光合作用的原核生物，兼具植物自养生长和原核生物遗传背景简单的特性，便于基因操作和利用光能进行无机培养。因此，近年来蓝细菌开始被用作廉价高效表达外源目的基因的受体系统。酵母菌是十分简单的单细胞真核生物，具有与原核生物很多相似的性状。酵母菌营异养生长，便于工业化发酵；基因组相对较小，有的株系还含有质粒，便于基因操作。因此酵母菌是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。酵母菌不仅是外源基因（尤其是真核基因）表达的受体，建立了一系列工程菌株，而且成为当前建立人和高等动物、植物复杂基因组文库的受体系统。真核生物单细胞小球藻和衣藻也被用于研究外源基因表达的受体系统。随着克隆载体的发展，至今高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目前用作基因工程受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单子叶植物水稻、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。动物鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞
或胚细胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。动物体细胞也用作基因工程受体，获得了系列转基因细胞系，用作基础研究材料，或用来生产基因工程药物。随着克隆羊的问世，对动物体细胞作为基因工程受体的研究越来越被重视，将成为21世纪初重要研究课题之一。人的体细胞同样可作为基因工程的受体，转基因细胞系用于病理研究。近年来还以异常生长的细胞作为受体，通过转基因使其回复正常生长状态（基因治疗）。
3、目的基因研究
基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。因此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有基因专利多，谁就在基因工程领域占主导地位。基因工程研究的基本任务是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因统称为目的基因。具有优良性状的基因理所当然是目的基因。而致病基因在特定情况下同样可作为目的基因，具有很大的开发价值。即使是那些今天尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。近年来也广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出需要的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。现在已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。近年来越来越重视基因组的研究工作，试图搞清楚某种生物基因组的全部基因，为全面开发各种基因奠定基础。据统计，至1998年完成基因组测序的生物有11种，如嗜血流感杆菌（1830 137bp，1743个基因）、产甲烷球菌（1664 976 bp，1682个基因）、大肠杆菌K-12（4 639 221bp，4288个基因）、啤酒酵母（～12 x 10 bp，5882个基因）、枯草杆菌（Bacillus subrilis）（4．21 X 10bp，4100个基因）。早在20世纪80年代就有人对人类基因组产生了兴趣，提出人类基因组研究计划。从1990年开始，先后由美国、英国、日本、德国、法国等国实施“人类基因组计划”，我国于1999年9月也获准参加这一国际性计划，在北京和上海分别成立了人类基因组研究中心，承担人类基因组1％的测序任务。这些国家聚集了一批科技人员，经过十年的辛勤工作，于2000年6月宣告人类基因组“工作框架图”已经绘制完毕。同时已破译了近万个基因。至1999年，美国对6500个人类基因提出了专利申请。一般认为人类基因组含有数万个基因，各司其职，控制着人的生长、发育、繁殖。一旦人类基因组全部被破译，就可了解人类几千种遗传性疾病的病因，为基因治疗提供可靠的依据，并且将保证人类的优生优育，提高人类的生活质量。除“人类基因组计划”以外，目前正在实施“水稻基因组计划”。以稻米为主食的我国早在1992年8月正式宣布实施“水稻基因组计划”，并且是目前国际“水稻基因组计划”的主要参加者，并于2001年10月12日，中国科学院、国家计委、科技部联合召开新闻发布会，宣布具有国际领先水平的中国水稻（税稻）基因组“工作框架图”和数据库在我国已经完成。这一成果标志着我国已成为继美国之后，世界上第二个能够独立完成大规模全基因组测序和组装分析能力的国家，表明我国在基因组学和生物信息学领域不仅掌握了世界一流的技术，而且具备了组织和实施大规模科研项目开发的能力。籼稻全基因组“工作
框架图”的完成，将带动小麦、玉米等所有粮食作物的基础与应用研究。此外，中国、美国合作的“家猪基因组计划”也已经启动。
4、基因工程工具酶的研究
基因工程工具酶指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNA把提供的DNA原材料切割成具特定末端的DNA片段。现已从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNA分子的需要。耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热门课题。DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。现在常用的DNA连接酶只有两种，即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶，前者只能连接具勤性末端的DNA片段；后者既能连接具默性末端的DNA片段，也能连接具平末端的DNA片段。DNA聚合酶用于人工合成连杆、引物等DNA小片段以及含基因的较大的DNA片段，还用于制备DNA探针。多种耐热性DNA聚合酶的发现，使使PCR技术迅速发展．给当今生命科学提供了先进的研究手段。
5、基因工程新技术研究
围绕外源基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高了外源DNA转化的效率。围绕基因的检测方法，在放射性同位素标记探针的基础上，近年来又发展了非放射性标记DNA探针技术和荧光探针技术，如生物素标记DNA探针、Dig标记DNA探针、荧光素标记DNA探针等。PCR技术的发展不仅大大提高了基因检测的灵敏度，而且为分离基因提供了快速简便的途径。PCR技术自从1985年建立以来，发展很快，除一般采用的常规PCR技术外还发展了多种特殊的PCR技术，如长片段PCR技术、反转录PCR技术、免疫PCR 技术、套式引物PCR技术、反向PCR技术、标记PCR技术、复合PCR技术、不对称PCR技术、定量PCR技术、锚定PCR技术、重组PCR技术、加端PCR技术等等。凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同分子大小的DNA分子或DNA片段分开，但是只能分辨几万碱基的DNA分子或片段。脉冲电泳技术的问世，不仅能分开上百万碱基的DNA分子或片段，而且能够使完整的染色体彼此分开。
编辑本段二、应用研究
基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。（将在后面基因工程应用中重点讲）。
编辑本段基因工程的应用和发展
应用重组DNA技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。这方面的
工作按其发展水平可以分为二个不同的阶段：第一阶段，主要集中于有重要农业经济意义的目的基因的分离与改造：第二阶段的主要目标是培育出具有改良的重要经济性状的工程植株；第三阶段的发展方向是培育出具有生物反应器功能的工程植株。现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草剂性状的转基因农作物。例如，应用反义RNA技术培育成功的具有耐贮藏的转基因西红柿已开始在美国投放市场。利用植物合成微生物甚至哺乳动物的一些特殊蛋白质，例如干扰素、人血清蛋白等也已有—些成功的报道。从理论上讲，在将来还有可能通过转基因植物生产更多的药用蛋白质。我们有理由相信，重组DNA技术在农业生产中的应用，是具有光辉的前景的。重组DNA技术的一个显著特点是，它注往可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人们可以在大虽扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。重组DNA技术还有力地促进了医学科学研究的发展。它的影响所及有疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的研究等诸多科学，并且均已取得了相当的成就。早在基因工程刚刚诞生的时候，它就被迅速地应用于肿瘤发生和细胞癌变理论的研究，为肿瘤诊断、药物治疗、肿瘤转移及其预防等提供了有效的新手段。这方面的重要突破是发现了致癌基因，弄清了肿瘤的起因。现在一些靠传统的接种疫苗无法预防的疾病，正在通过基因克隆技术发展有效的新型疫苗。还有一些遗传疾病如今已能在胎儿身上得到诊断，而且有希望使囊性纤维化、乳腺癌以及其它一些严重危害人类的疾病，在不久的将来得到有效的治疗。1、在医药业的应用（1）转基因细菌生产激素类药物（2）转基因细菌生产抗生素：（3）转基因微生物生产疫苗： 2. 在工业原料生产上的应用（1）转基因微生物生产高分子多聚物（2）转基因微生物与环境净化和废料再生
编辑本段基因工程的安全性
一、基因工程的安全隐患
1. 对环境的影响重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。
2. 新型病毒的出现制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。
3. 癌症扩散将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
4. 人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。
二、重组DNA研究的安全准则
1. 公众的担忧1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。
2. 专家的态度1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。
3.制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。
4. 基因工程的安全措施由于同一地区只种一种作物,造成抗性基因专一化,使得抗性基因所不能对付的病虫害暴发,从而造成农作物的减产。转基因作物的大规模商业种植可能会导致被转移基因在自然生态系统中的广泛流动,还可能波及到非目标生物,从而对生态环境产生不可逆转的严重破坏。此外,基因工程技术生物的推广将使数以千计的品种被淘汰,导致自然界一些食物链切断,生态平衡破坏。专家认为,经一二十年后,杂草、虫害和病菌适应了环境,使基因工程作物的抗性丧失,则这些特性有可能转给杂草昆虫病菌或某些动物,产生超级杂草、超级害虫、超级细菌和超级病毒,从而给人类及生态环境带来严重危害。（1）杂草化问题（2）基因扩散（3）ＲＮＡ重组的潜在危险控制措施：对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去。这种措施只能用于控制在实验室里的转基因生物，而且用于控制转基因微生物和通过花粉进行扩散的植物的效力实际上是非常有限的。当转基因动、植物必须用于开放的环境里生产时，物理控制的方法便不再有实际的意义。根本性的措施还是生物学的控制方法。即造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离。如利用三倍体不育的特性，将用于生产的转基因动物或植物成为三倍体，这样，转基因生物在进入到自然环境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可能对生态系统造成长期的影响。也可以利用生理学原理，如激素诱导等方法使转基因生物不育等。P1-P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。P1级实验室．为一般的装备良好的普通微生物实验室；P2级实验室，在P1级实际室的基础上，还需装备负压的安全操作柜；P3级实验室即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；P4实验室，是具有前高安全队护措施的实验室。要求建设专用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带，细菌操作需带手套进行，以及使用其它必要的隔离装置，使研究者不会直接同细菌接触等等。生物防护方面:EK1～3级是专门针对大肠杆菌菌株而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EK1级的大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都是要死亡的，而符合EK2一3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。第一个“安全”的大肠杆菌K12菌株，是在1976年由美的Alabama 大学的Roy CurrissIII发展出来的。由于这个菌株是在庆祝美国独立200周年（1776一1976）期间交付使用的，所以被命名X1776菌株。能够防它在实验室外传播的…安全”特性之一是，该菌株是一种营养缺陷突变体，它必须在有二氨基庚二酸和胸腺嘧啶核苷酸的培养基上才能生长。二氨基庚二酸是赖氨酸生物合成的一种中间产物，在人类的肠道中并不存在这种物质。因此，即便X1776菌株偶然被吞食至人类肠道，也不可能存活下去。X1776菌株安全特性之二是，它的细胞壁十分脆弱在抵浓度的盐离子环境中，甚至只有微量的去污剂的存在，都会造成细胞的破裂而致死。根据NIH安全准则，在DNA重组实验中，除了使用“安全”的寄主细菌之外，还必须使用“安
全”的质粒载体。这样的…安全?质粒的一个基本特征是，它应该失去了自我迁移的能力。
2、消费安全用转基因生物生产的转基因食品和药品要进入市场，必须进行消费安全性评价。消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：导人的外源目标基因本身编码的产物是否安全，例如用某些细菌的杀虫基因所培育的转基因杀虫作物中，杀虫基因所编码的产物是否会对人类产生毒性作用等；（２）外源目标基因是否稳定，在新的生理条件下和基因环境里，导人的外源目标基因会不会产生对人体健康有害的突变；使用的载体是否安全，载体本身是否会编码对人体有害的产物，例如用于人类的基因工程产品一般是应避免使用病毒作为基因载体的；在使用了选择和报道基因的情况下，这些基因是否会产生有害的物质，例如用抗生素作为选择标记基因的转基因食品，是否会在食用后使人产生对抗生素的抗性；外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。
第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基
基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。 10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。 11．EDTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测 不出质粒，这种现象叫。 19．pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。 20．Y AC的最大容载能力是，BAC载体的最大容载能力是。 21．pSCl01是一种复制的质粒。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。 23．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。 24．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是 和。 25．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。 26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 27．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。 28．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基 因组的的范围内。 29．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。 30．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加人单价的阳离子，如NaCl和NaAc， 其目的是。 31．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1) (2) (3) (4) 。 32．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出 碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的。 33．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在 。 34．乙醇沉淀DNA的原理是。 35．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
基因工程的定义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造， 将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 基因工程的基本过程：切、接、转、增、检 基因工程理论依据：a) 生物的遗传物质是DNA。b) DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。c) 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立 遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。 克隆。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 限制性核酸内切酶。是一类能识别双链DNA 中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。限制性内切酶由三个基因位点所控制：hsd R---限制性内切酶，hsd M---限制性甲基化酶，hsd S---控制两个系统的表达。Hsd S－识别特定DNA序列，Hsd M－甲基化，Hsd R－限制性内切酶功能。 命名法：例如Haemophilus influenzue）d 株中分离的第三个酶：Hin d III 同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切割位点。同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶 粘性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称之。 酶活性单位。在合适的温度和缓冲液中，在50μl反应体系中，1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为1个酶活性单位U。 星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。引起星活性原因：若使用buffer不当, 会有star activity，而star activity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专一性, 当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果。连杆：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
基因工程复习题 题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。 第一章绪论 1.名词解释： 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 2．什么是基因克隆及基本要点? 3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。 A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用； C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。 4.基因工程研究的主要内容是什么？ 基础研究： 基因工程克隆载体的研究 基因工程受体系统的研究 目的基因的研究 基因工程工具酶的研究 基因工程新技术的研究 应用研究：
基因工程药物研究 转基因动植物的研究 在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究 第二章基因克隆的工具酶 1.名词解释： 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。 同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列 黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 平末端：DNA片段的末端是平齐的。 限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 连杆（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。 激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 2.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以
基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末） 异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取 制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。
基因工程技术的现状和前景发展 摘要:从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 关键词:基因工程技术；前景；现状 一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。 由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。 二、基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程
药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。三、基因工程应用于环保方面 工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。 四、前景展望 由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究
基因工程技术的现状和对人类前 景发展的分析 1.基因工程的发展与进步（摘要） 提纲 2.基因工程的应用范围 3.基因工程前景，现状，发展 4.及有关文献 前语：关于基因工程对人类的发展在当今社会中也有了广泛的应用，它主要表现在植物方面，医药方面，环保方面。展望现状很乐观，我自己认为对于我们现在的社会条件来看，基因工程的发展至关重要，我们是一个多人口的国家，对于粮食的需求面临着严重的缺乏。不管是什么事，没有粮食什么都不会做好，因此我们要应用好基因工程技术来增加我们的粮食产量，确保我们发展的前提条件。目前我们也有很多在基因工程方面有了很大的发展。但是我们也不要否认我们的不足，我们要更加的努力做得更好。那我就说一下它用于的几个方面和前景；现状；发展。 【摘要】从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 【关键词】基因工程技术；前景；现状；发展 一、基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。 由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐
基因工程技术在生产实践中的应用 姓名 学号 专业
基因工程技术在生产实践中的应用 随着科技的发展，人类在为自己生产出越来越多的生活资料的同时，也向 大自然排放了越来越多的有害和难降解物质。如农药、塑料和各种芳香烃类化合物，这些物质正严重破坏环境和危害着人类的身体健康。因此，有意识地利用生物界中存在的净化能力进行生物治理，已渐渐成为环境治理的主要手段。自然界中的生物, 往往在有毒物质的选择压力下经过基因突变、基因重组、物种间基因的交流，进化出代谢这些有毒物质的能力。利用基因工程技术提高微生物净化环境的能力是现代生物技术用于环境治理的一项关键技术。20世纪50 年代初，由于分子生物学和生物化学的发展, 对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸(DNA)的结构和功能有了比较清晰的阐述。20世纪70年代初实现了DNA重组技术，逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程的生物技术。这一技术发展到今天，正形成产业化品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门，并日益显示出其巨大的潜力, 将为世界面临的环境保护等问题的解决提供广阔的应用前景。 基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法,按照人类的需要, 用DNA重组技术对生物基因组的结构或组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或对人类有益的生物性状。首先该技术高效、经济, 这是传统产业工程无法比拟的。它能按人类需要来设计和改造生物的结构和功能, 生产出优良的动物、植物和微生物品种。在低投入的情况下, 能够高效生产出所需商品。而且外源基因只要进入受体细胞的基因组中就可以遗传给后代, 育出的优良品种, 可持久利用。其次, 该技术具有清洁、低耗和可持续发展的特点。现代基因工程所利用的原料是可再生及可循环使用的, 不需消耗大量的不可再生资源, 所以极少产生对生态环境有害的废物。再次, 该技术应用于疾病的诊断与治疗方面也具有优势。基因诊断更具预见性和准确性, 而且基因治疗可从基因水平上纠正疾病, 从而使疾病得以根治。 环境污染主要是指有害物质对大气、水体、土壤和动植物的污染。20 世纪 50年代以来，随着工业的迅速发展，环境污染的问题日趋严重，尤其是在一些工业发达的资本主义国家，相继出现了一系列公害事件。因此，研究污染物质在环境中的运动规律以及防治污染的原理和方法，已成为世界各国重点探索 的课题之一。 20 世纪 70 年代以来，发现许多具有特殊降解能力的细菌其降解途径所需要的酶，不是由染色体基因编码，而是由染色体外的质粒基因编码。这类质粒叫降解质粒或代谢质粒。他们的分子量一般都比较大，大多具有接合转移能力，即通过两个细菌的相互接触，可以把质粒从一个细菌传递到另一个细菌中去，提供质粒的细菌通过复制作用仍能保持这种质粒，这样，能使降解基因在微生物群体中广泛扩散。含有这类质粒的细菌，在某些环境污染物的降解过程中起着重要的作用。 到目前为止，共发现了四类降解质粒。第一类是发现于假单细胞菌属中的石油降解质粒，这些质粒所编码的酶能降解各种石油组分或他们的衍生物，如 樟脑、辛烷、萘、水杨酸盐、甲苯和二甲苯降解质粒等。第二类是农药降解质粒，这些质粒上的基因决定除草剂 2，4 一 D、杀虫剂“666”和烟碱等农药的降解
基因工程技术 百科名片 DNA与基因工程 基因工程技术:将重组对象的目的基因插入载体,拼接后转入新的宿主细胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术. 目录 概念 1基因工程的概念A 重组DNA技术的基本定义 1B 基因工程的基本定义 1基因工程诞生的理论依据（1）DNA是遗传物质 1（2）DNA双螺旋结构 1（3）中心法则和遗传密码 1（4）基因是可切割的 1（5）基因是可以转移的 1（6）多肽与基因之间存在对应关系 1（7）基因可以通过复制把遗传信息传递 1基因工程的发展史（1）基因工程的准备阶段 1（2）基因工程问世 1（3）基因工程的迅速发展阶段 1一、基础研究2、基因工程受体系统的研究 13、目的基因研究 14、基因工程工具酶的研究 15、基因工程新技术研究 二、应用研究 基因工程的应用和发展 1基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患 1二、重组DNA研究的安全准则
展开 编辑本段概念 基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规模合成.80年代以来,表达真核cDNA,细菌毒素和病毒抗原基因等,为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径. 基因工程技术生产药品的优点:生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽,胰岛素,干扰素等,细胞因子等; 可以提供足够数量的生理活性物质;发现更多内源生理活性物质;定向改变内源生理活性物质;获得新化合物,扩大药物来源 编辑本段基因工程的概念 A 重组DNA技术的基本定义 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 B 基因工程的基本定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。
基因工程技术对人类的影响 基因工程的兴起，是二十世纪科学技术最具革命性的成就之一，开创了人类认识自然、改造自然的新纪元。1996年诺贝尔奖获得者、莱斯大学的化学家罗伯特?柯尔说：“本世纪是物理学和化学的世纪，但下个世纪显然将是生物学的世纪。”随着“人类基因组计划”的初步完成，及其基因工程操作技术的不断完善，人类在基因领域已经取得了巨大的进步，基因工程技术正在以令人目不暇接的速度和不可思议的方式改变着这个世界，已经或即将对人类社会产生重大影响。 基因工程在其产生的短短30多年时间，已经发展到了相当成熟的地步。其应用范围之广、应用领域之多，已渗入到社会生活的方方面面。 1. 基因工程对医疗领域的影响 随着人类对基因研究的不断深入，分子医学的新时代已经开始显现。这个新时代的特点不是治疗疾病的症状，而是寻找引起疾病的根本原因。医学研究人员还将能够根据新的药物和免疫疗法技术，设计新的治疗机制、避开可能引发疾病的环境条件、通过基因疗法更换出现缺损的基因。 人类基因工程研究取得的技术成果和资源已开始对生物医学研究产生深刻的影响，并将给更广泛的生物学研究和临床医学带来革命。越来越详细的基因组图谱的绘制完成，有助于研究人员寻找诸如脆弱的X综合征、1型和2型神经纤维瘤、遗传性结肠癌，阿耳茨海默氏症和家族乳腺癌等几十种与遗传疾病有关的基因。目前，已发现的遗传病有7746种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。 基因诊断是基因工程技术在医学上的一项重要应用。它是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转入病患者的细胞中，以取代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。 第一例基因治疗是美国在1990年进行的。当时，两个4岁和9岁的小女孩由于体内腺苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们进行了基因治疗并取得了成功。这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例Ｂ型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。 同时，基因工程技术在药物研究中的应用，带来了无与伦比的社会价值和经济价值。利用基因工程技术生产临床治疗中非常有价值的活性多肽，不仅解决了来源困难的问题，降低了生产成本，而且可以利用在体外操作基因的优点，制造出更有效、副作用更少的药品。除此之外，基因疫苗也是医学界又一重大突破。传统的免疫方法一般是用去毒或低毒的病源微生物的抗原免疫人体，使人体产生抗体以抵抗疾病。但是，这种传统的免疫方法可能因为其抗原蛋白的毒性而对人体有害。现阶段发展起来的DNA疫苗则突破了这一缺陷，它是将能表达外源抗原蛋白的质粒DNA或其它形式的DNA注入机体后，产生对人体无危害或危害极低的抗原蛋白，令机体产生细胞免疫或体液免疫，抵抗外源微生物的侵害。而且DNA疫苗相对较稳定，成本低，使用方便，作用时间也长，所以，DNA疫苗已广泛在临床上使用。目前正在研制的DNA疫苗有甲肝、乙肝疫苗、以及抗艾滋病病毒的疫苗等。 除基因工程药物和疫苗之外，人们还正设法通过基因工程技术来改造一些动物（如猪）的器官，使其不被人体排斥，以便用于移植。目前，许多需要进行器官移植的病人在排队等待器官时丧失了生命，而且费用昂贵，基因工程器官若能成功的话，将给这些患者带来福音。
基因工程的核心技术是( )技术 基因工程的核心技术是（DNA的重组）技术 DNA重组技术一般知 第一节工具酶 基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要结合基因或其中的一个片段，需要DNA酶（DNa polymerase）等。因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。 一、DNA限制性内切酶 Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA受到后一种宿主的“限制”。由此发现了限制-修饰系统。 各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。限制-修饰系统是细胞的一种防卫手段。如果用噬菌体去感染限制-修饰系统有活性的细菌，噬菌体DNA 没有先经修饰，它与先经修饰的噬菌体相比，感染效率要低几个数量级。未经修饰的噬菌体DNA进入细胞后被限制酶切成片段，片段的数目与DNA分子中限制酶的识别点数目成正比，这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解，就会开始裂解感染，由此产生的子代噬菌体