HEREDITAS (Beijing)
2007年7月, 29(7): 785―792 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/9314149978.html,
综 述
收稿日期: 2006?11?06;修回日期: 2007?02?04
作者简介: 谢飞（1981?）, 男, 在读硕士生, 研究方向: 动物遗传资源评价、保护与利用。E-mail: asdxiefei@https://www.doczj.com/doc/9314149978.html,
通讯作者: 宋成义（1974?）, 男, 博士, 研究方向: 动物遗传育种, 动物生物反应器研究。E-mail: chengyilab@https://www.doczj.com/doc/9314149978.html,
DOI: 10.1360/yc-007-0785
“睡美人”转座子的研究进展
谢飞1, 高波, 宋成义, 陈国宏
扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009
摘要: “睡美人( Sleeping Beauty, SB) ”转座系统是Tc1/mariner 转座子超家族中的一员,已经失活了一千多万年。1997年，Ivics 等根据积累的系统发生数据,利用生物信息学的方法, 对其进行分子重建, 终于唤醒了其转座活性。近年来对“睡美人”转座系统的转座效率和转座机理进行的研究，已证明SB 转座子在基因筛选，转基因及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。文章重点论述了SB 转座子在结构及其优化、转座机制和应用等方面的进展，同时对其研究中出现的各种问题进行了总结并提出了一些解决方案。 关键词: “睡美人”转座子; 脊椎动物; 转座机制
Advances in studies of Sleeping Beauty transposon
XIE Fei, GAO Bo, SONG Cheng-Yi, CHEN Guo-Hong
College of Animal Science and Technology , Yangzhou University , Yangzhou 225009, China
Abstract : The Sleeping Beauty (SB) transposon is a Tc1/mariner family transposon that has been transpositionally inactive
for over 10 million years. The SB transposon system was awakened from inactiveTc1-like transposable elements by using molecular phylogenetic data in 1997. Recent studies on its transposition efficiency and mechanism have shown its broad applications in vertebrate animals for gene-screening, gene transfer, and human gene therapy. In this review, we summarize our current knowledge of Sleeping Beauty, such as structure, transposition mechanism and potential applications, and bring forward some means aiming at the limitations of transposon technology.
Keywords: Sleeping Beauty transposon; vertebrates; transposition mechanism
转座子又称可移动基因, 跳跃基因, 是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA 序列。早在20世纪50年代, 首先由McClintock 在玉米中发现[1], 以后又陆续在细菌、
真菌及动植物中都有发现, 如细菌中的Tn5, 酵母中的Ty 以及来源于鳞翅目昆虫的piggyBac 转座子等。
转座子从一个位置转座到另一个位置的转入和切出过程, 改变了原有基因的结构和排序, 从而产生了突变。目前生物体中所发现的10%的突变是由于它抑制其他基因的表达而形成的。利用转座子在受体基因组的可整合性,构建了果蝇P 因子、hobo 因
子、piggyBac 转座子、mariner 因子等多种转座表达载体, 已成功地转化了多种外源基因[2,3]。最近Ding
等[4]在研究中发现, 一般用于昆虫的piggyBac 转座系统还具有在小鼠的生殖细胞中转座的能力, 表明一些转座子可能并不具有严格的物种特异性。
脊椎动物基因组中也存在着大量的转座子, 主要分为两类: 一类是具有类似反转录病毒结构的Ι型转座子, 采用“复制粘贴”机制, 首先将DNA 转录为RNA ，在反转录酶的作用下合成DNA, 反转录的DNA 插入染色体的其他部位, 结果在染色体上的位置发生了移动。另一类是Ⅱ型转座子，主要采用
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“剪切粘贴”的转座机制, 将DNA 从染色体上切下来后直接插入到别的部位, 由两端较短的反向重复序列(inverted terminal repeat , ITR) 和编码转座酶的基因组成, 但是此类转座子的转座酶大都在漫长的进化中失活。作为基因转移和表达系统的转座子只是在细菌、真菌、植物和无脊椎动物中应用较多, 长期以来在脊椎动物中仍然是空白。直到1997年Ivics 等[5]基于积累的系统发生数据, 利用生物信息学的方法, 收集8个不同鱼类品种的12个失活的鲑鱼科亚家族, 对Tc1 类转座酶的基因序列多重序列比对(multiple sequence alignment) , 以其中5个同源性较高的保守结构域进行了重建。
重建的第一步是通过将两个不同来源的片段互补拼接在一起, 从而恢复一个完整的开放阅读框 (图1:a, SB1~SB3), 在此过程中还要消除中间未成熟的终止子和移码突变, 由于SB3的序列还有24个位置上与保守区域的一致序列不符, 因此它还不具
备转座能力。然后, 通过PCR 引入定点突变的方法, 构建了一系列序列(图1: a, SB4~SB10), 最终完成的SB10基因编码长340个氨基酸的蛋白质。在T 元件的选择上, Ivics 等选择了保守性最好的一个品种Tanichthys albonubes 的IR/DR 作为“睡美人”转座酶特异识别的DNA 序列, 这样带有T 元件的转座子和介导其转座的转座酶一同构成了完整的“睡美人”转座系统(图2, 图1: b) 。至此, “睡美人”终于苏醒了[6]。
与其他转座系统的效率相比, “睡美人”在脊椎动物中的转座效率最高[7], 它不仅能在体外培养的鱼、小鼠和人[8]等大多数脊椎动物的细胞中发生转座, 还可以在动物体内介导外源基因的稳定整合和长期表达[1,6], 但体内的转染效率要比体外高[9]。近
年来, 通过对转座子的反向重复序列和转座酶的优化, 睡美人的转座效率成倍增加, 而且大片段的转座效率也有所提高[10~13]。整合的“睡美人”可以通过生殖细胞稳定地传递给后代, 在后代中表达外源基
图1 “睡美人”转座酶的重建
a: “睡美人”转座酶基因的重建过程。与一致序列不同的氨基酸残基用黑色字母表示, 顶端黑色箭头表示其位置; 经突变成为一致序列的氨基酸残基用白色斜体字母表示; “ * ”表示未成熟的终止密码子; “ # ”表示移码突变; 右侧箭头旁的说明文字显示在重建的特定阶段SB 转座酶的结构或功能的恢复情况。b: “睡美人”转座酶基因各结构域的示意图。
Fig. 1 Reconstruction of SB transposase
a:Reconstruction progress of SB transposase. Amino acid residues are typed black when different from the consensus and their positions within the transposase polypeptide are indicated with arrows; Amino acids changed to the consensus are typed white italic; Translational termination codons appear as asterisks; Frame shift mutations are shown as number signs; In the right margin, the various functional tests that were done at certain stages of the reconstruction procedure are indicated. b: Domains of SB transposase .
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因[3,14,15], 因此“睡美人”将很有可能替代目前应用
繁琐的基因敲除和RNA 干扰技术, 在功能基因组学研究及基因治疗等领域发挥重要的作用。
图2 转座子的结构
Fig. 2 The structure of transposon
1 SB 转座系统的结构
“睡美人”转座子属于Tcl/mariner 家族, 在结构上与Ⅱ型短的插入性转座子相关,在分类上属于第二类型, 这一类型的转座子还包括Hobo 、Hermers 、mariner 、P 、Tcl 、CA 和piggyBac 等。“睡美人”全长1.6 kb, 与其他转座子相似, 它也由转座酶基因和两端的反向重复序列组成。 1.1 转座酶基因
转座酶基因的开放式阅读框编码340个氨基酸的蛋白质, 它可以与两端的反向重复序列相结合, 促进转座的发生, 主要包括5个保守结构域: N 端的DNA 结合域; 靠近转座酶中心的一段未知功能的富糖结构域; C 端催化转座的DDE3个区域。
DNA 结合域编码123个氨基酸, 主要与转座子两端的反向重复序列相结合, 在序列组成上与NLS 具有一定的重叠, 主要由螺旋－转角－螺旋(PAI 和RED)两个结构域组成。两结构域之间由一个AT 钩状域相连并形成一个与Pax 蛋白paired 结构域相似的结构[16](图1:b)。PAI 与左侧重复序列内部的增强子结合, 携同RED 和AT 钩状结构域在与转座子的特异结合中起主导作用。此外, PAI 还可以利用其内部的亮氨酸拉链结构使转座酶聚合, 促进了突起复合物的形成(Synaptic Complex Formation, SCF)。而对于亚结构域RED 的功能还不清楚, 有待于进一步研究。同在N 端的还有一个核定位信号序列(nuclear localization signal, NLS), 在转座酶表达后, 主要起到介导其顺利进入细胞核从而使转座作用增强的作用。转座酶中心还具有一个比较保守的富糖结构域, 但功能尚不清楚。转座酶的C 端为转座酶的催化中心, 主要介导DNA 的断裂与整合, 是一种进化性保守区域, 在一些细菌转座酶 反转录转座子/反转录
病毒整合酶及RAG1免疫球蛋白重组酶中均有发 现[16]。它由高度保守的氨基酸三联体组成的DDE
结构域, 其中在此结构域中起关键作用的是第153位与第244 位的天冬氨酸和279 位的谷氨酸, 抗性筛选实验证实了该区域已具备转座酶活性[5]。
经自然界进化选择的转座酶活性并不一定是最强的, 这可能是转座子和宿主细胞都在竭力避免产
生插入性突变或破坏一些必要的基因, 所以自“睡美人”恢复活性以来, 一直有人尝试改造转座酶以获得更高的转座活性。Geurts 等[12]对SB10的第136位 (T －R), 243位(M －Q), 253位(VVA －HVR)和255位(A －R)进行定点突变, 获得的转座酶命名为SB11, 结果发现此转座酶活性提高了约3倍, 用SB11进行转座发生的染色体整合率是随机整合的100倍。Zayed 等[13]应用PCR 定点突变技术对SB10的第115位(R －H ) 和 第260(D －K)进行了碱基替代, 并 命名为SB12, 其转座酶的活性提高了近4倍。Baus 等[10]对转座酶位点进行了一系列突变实验, 发现 活性最强的是对转座酶的第13位(K －A), 第33位(K －A), 第83位(T －A), 第115位(R －K),第205位(A －K) ,第207位(HK －VR),第210位(D －E)和 第214位 (RKEN －DAVQ)进行共突变后的序列命名为HSB17, 其转座活性是SB10的近17倍。 转座酶与转座子相互作用, 将外源基因整合到染色体中进而表达外源基因。但是Masuda 等[17]研究发现, 将一组不含转座子序列的表达荧光素酶的质粒与转座酶质粒协同注射, 另一组只注射表达荧光素酶的质粒。结果发现前者比后者荧光素酶的表达水平提高了5倍, 表明转座酶本身就可以增强外源基因的表达, 与转座子的存在与否无关, 但荧光素酶基因均没有整合到染色体中。 1.2 反向重复序列
SB 的末端反向重复序列(inverted terminal re-peats, ITRS)大约长为230 bp, 由外侧的32 bp 反向重复序列(IR) 内侧与IR 相似的同向重复序列(DR)及两者间相距的165~166个碱基3个部分组成(图2)。两个ITRS 的DR 均能与转座酶相结合, 这是高效转座所必需且位置不可互换[11]。在转座子两端ITRS 的外侧存在的TA 双核苷酸, 对于转座是非常重要的, 去除任意一端的TA 会使转座效率明显降低, 若将两端的TA 基序均除去, 则转座子完全失去转座
功能。
SB 转座子的转座效率受到多种因素的影
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响[11,12,18~20], 其中的一个重要因素是ITRS 内部及其
外部的DNA 序列。对SB 转座子的反向重复序列内部进行修饰, 与对其外部序列修饰一样, 都会对转座产生影响。Cui 等
[11]
在SB 转座子右端的反向重复
序列中对第80位(G －T), 第87位(G －A), 第101位,△ 第217位(A －T)利用PCR 定点突变, 并在转座子两个末端加上TA 碱基因, 得到转座子pT2, 发现其转座的效率可以提高4倍左右。Zayed 等[13]根据自然界中已存在的复合转座子如Tn5和Tn10的结构, 构建了一种能携带10 kb 或更大基因片段的“三明治式”SB 转座子结构, 即在原始转座子ITRS 内侧再构建上一对反向重复序列, 增加了载体携带大片段的能力, 并提高了大片段基因的转座效率。Liu 等
[21]
在体内对SB 转座子的序列进行了一系列的实验,
发现在pT2的基础上, 同时去除IR/DR 内部和外部部分序列的转座子pMSZ 可以合转座活性提高约3.6倍。
2 转座的机制
SB 转座过程分为4步: 转座酶结合到DR 内的位点上; 突起复合物的形成; 从原整合位点切除; 整合到新的靶位点(图3)[22]。在转座的起始阶段, 转座酶能从仅相差3个碱基对的序列中特异地识别DR 区, 然后与细胞因子HMGB1共同作用于两端的1TRS, 并使之配对形成SCF
[23]
。 而在SB 转座子切
除的过程中, 转座子未端产生一个向内3个核苷酸的交错切口, 在转座子后面的供体位点也产生一个3′端悬垂, 然后一些非同源性末端连接因子(NHEJ ) 如Ku , DNA -PKcs 等将链接处修复, 这样就产生了3个碱基的转座子足迹[24,25]
, 但不同修复因子对应的
修复机制不同, 因此转座子足迹也不完全相同[26]。
最后SB 转座子被切出并特异地插入TA 双核苷酸处, 使插入位点的两侧序列重复。
在转座子靶位点的选择上, 一些辅助蛋白可能
起到了一定的作用, 而有些转座子则主要是由自身决定的, SB 转座子就属于后者。Vigdal 等[20]发现一些具有某种物理特性的结构, 如潜在的弯曲的结构或氢键都可能对靶序列的选择产生一定的影响, 对138个插入位点分析表明整合位点大多位于基因的内含子中; 而Yant 等[27]对1,336个发生转座的SB 整合位点进行了分析, 发现大多SB 的整合位点均偏向整合于非编码区的微卫星序列中。最近Geurts 等[28]基于合成参数Vstep, 自行设计的ProTIS 方法, 可对已发生的转座事件建立档案, 预测已知的一段基因组序列可能的整合位点, 这对运用SB 转座子进行功能基因组及基因治疗等研究中是非常有用的。 一些反转录病毒, 如基于HIV 和AAV 等的基因转移载体在整合后都有插入基因的倾向, 而且经常会产生大片段的丢失和染色体重排[29], 而SB 转座子能够代替病毒, 安全稳定地整合到基因组中, 因此应该有着广阔的应用前景。
3 SB 的应用前景
3.1 用作转基因载体
SB 转座子能将LacZ 和GFP 等报告基因整合, 进入多个物种和细胞系中, 并可以稳定地表达。Dupuy 等[30]将带有GFP 或agodi 基因(决定小鼠毛 色)的转座子线性化后, 与体外转录的编码SB10转座酶的mRNA 一同注射入小鼠的单细胞胚胎, 结果提高了转基因的效率, 转入的外源基因也能通过 生殖细胞传递给后代。Harris 等[31]选取稳定转染
图3 转座流程
Fig. 3 The process of transposition
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SB-RFP质粒的克隆放于不含G418的培养基中继续传代培养6个月, 有90%的HeLa细胞仍可以高效地表达红色荧光蛋白, 表明外源基因已经稳定地整合到染色体中。
SB作为基因转移载体具有以下优势: (1)结构简单, 与外源基因共同整合入受体基因组的只是两侧各250 bp 的IR/ DR 序列, 对外源基因的影响较小, 在整合位点也没有发现大片段的丢失和染色体重排现象; (2)与反转录病毒载体相比, 对插入片段的长度限制较小; (3)转座的外源基因可以稳定整合到染色体中, 而且通过生殖细胞传代后也能够长期地表达; (4)转座酶可以催化单拷贝的基因精确的插入受体序列中, 不再依靠随机整合且插入片段的大小也不会发生变化; (5)转座子系统可全部以裸露的DNA 形式给予, 也可以DNA(转座子)与RNA/蛋白质形式提供的转座酶相结合进行转座, 所以其免疫原性较低。
3.2基因治疗
在基因治疗中, 目的基因整合后能够表达并且维持一段时间, 才能起到治疗的效果, 而SB转座子满足了上述要求。Chen等[32]将SB转座系统和RNAi 技术结合, 将htt(亨廷顿舞蹈病)基因导入小鼠体内, 降低了htt基因的表达。Yant等[2]用带有hAAT cDNA 的SB载体注射后得到的转基因小鼠, 在血液中表达hAAT并可持续6个月以上, 更重要的是在实验中, 反复注射SB载体并没有引起毒性和免疫反应。Liu 等[8]利用SB转座子将血友病基因转入缺乏凝血因子Ⅷ的小鼠的肝脏内, 患鼠表型也有所改善, 再次印证SB转座系统应用于基因治疗的可行性。
SB转座系统必须进入细胞中才能转座, 但是它本身并不能够穿过细胞膜, 如果转座子可以结合病毒载体, 利用其高效的转染率, 则可以提高转座效率。Yant等[33]将SB与腺病毒结合起来, 形成腺病毒/SB杂合性载体, 转染效率高而且又能够实现与基因组的稳定整合。
3.3 新基因的发现
SB转座子在种鼠生殖细胞中的转座复杂度大约是10,000, 这就意味着1只种鼠将能生出10,000只不同的突变小鼠, 其转座的复杂度是非常高的[6]。根据一些性状的出现, 利用转座子插入位点标签, 通过反向PCR技术等确定相应可能的候选基因。Yae 等[34]利用SB转座所产生的插入性突变系小鼠, 就成功地确定了一个与胚胎滋养层发育及胚胎植入相关的基因Arpc3。如果将SB转座子注射到不同组织制作各种模式小鼠, 用于诱导多种癌基因甚至肿瘤, 还可以显著加快癌基因的定位和癌症治疗的步伐[35]。相对于通过基因打靶或RNA干扰技术来进行功能基因组学研究, 这种方法不需要组织培养和胚胎操作, 只需根据转座子插入基因组时留下“足迹”标签就可以迅速地识别出来, 效率可得到显著提高。
4 SB转座子的检测
实验过程中, 检测外源基因是否发生转座及其转座效率如何是必要的。一般用于检测转座效率的方法主要有以下几种: 一是将抗生素抗性基因导入转座子中, 观察在有无转座酶的情况下经抗性培养基筛选后得到的阳性克隆数的变化[2,3]; 二是将半乳糖苷酶基因或GFP导入转座子中, 通过蓝白斑筛选或FISH技术观察报告基因的表达; 三是以转座子中的特异片段作探针进行杂交, 观察转座前后被标记的限制性酶切片段数量和长度的变化(还可以测定转座的拷数)[15]。此外, 通过反向PCR技术即酶切宿主基因组并环化, 以两侧的T 元件序列为引物扩增出转座子新整合位点旁侧的基因组序列, 不仅可以用于表征转座的发生, 还可用于研究转座的机制[24]。但是检测过程中有时却难以分清外源蛋白是由质粒还是由整合后的外源基因表达的, 最近Score等[36]将LoxP/Cre重组系统与SB转座子系统相结合, 可以特异地筛选出由转座引起的特异性表达。
5存在的问题及解决方案
5.1 转座效率的影响因素
5.1.1 转座子的长度
Izsvak等[18]通过HeLa 细胞的转座实验发现转座子的长度在2.2 kb 至10.3 kb 的范围内, 每增加1 kb 转座效率就会降低30% 这可能是由于转座子过长妨碍了反向重复序列的配对, 而后者恰恰是突起复合物形成所必需的。最近, Karsi 等[37]用小鼠的3T3细胞进行的研究也得出了类似的结果。Zayed等[13]构建的“三明治式”SB转座子结构, 增加了载体携带大片段的能力, 并提高了大片段基因的转座效率。
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5.1.2产物过剩抑制
产物过剩抑制是指当转座酶产物过多时, 转座率反而下降, 这在其他转座子如mariner中也有发现[38]。Yant 等[2]发现在小鼠肝脏内当转座子质粒与转座酶的质粒比例为25: 1进行共转染时转座效率最高。而Geurts等[12]在体外转染HeLa细胞的研究中, 却发现当转座子与转座酶的比例为5: 1时, 转座的效率最高。这说明在不同的组织和细胞中实现高效率转座, 转座子与转座酶的比例不同, 其最佳比例需要在试验中进一步确定。
过剩抑制的分子机制目前仍不清楚, 可能是当细胞内转座酶分子转录或翻译过多时, 细胞来不及合成全长的转座酶分子或进行正确的折叠, 而这些缩短了的多肽或不正确折叠则会抑制转座的发生。失活的转座酶仍然具有同活性转座酶竞争初始结合位点的能力, 并且通过其优势剂量来阻断转座的发生。在转座酶形成四聚体的过程中, 即使是一个无活性的转座酶与其他3个有活性转座酶结合也可以在SCF阶段阻断其转座行为。
Matthew等[39]在转座酶的N端融合一段锌指序列后也可以减弱过剩抑制效应, 并且融合后SB转座酶活性要比原转座酶明显增强。研究还表明在转座酶的C端融入同样的锌指序列会使转座酶失去活性。如果对转座酶进行突变, 使其对过度表达抑制的敏感性降低或在体外预先制备整合前的转座子和转座酶的复合物也有可能解决过度表达抑制问题。
通过对转座酶选择不同的启动子, 也可以优化转座酶与转座子的比例, 实现高效转座。Liu等[21]用CMV增强子与鸡β-actin 启动子相连并与HSB结合并命名为pTRUF-HSB, 研究发现转座效率明显增强, 但经Western blot发现一种分子量比转座酶大的未知蛋白质, 可能是由上游实验的一些疏忽使mRNA发生了可变剪接的缘故。
5.1.3一些宿主因子的参与
SB转座子可以在脊椎动物细胞中进行广泛转座, 这表明一些宿主因子可能参与了转座的过程。因此若宿主的蛋白确实参与了转座过程, 那么这些因子在脊椎动物中应该是高度保守的。Zayed等[23]发现了一种在细胞内较为丰富的(106个分子/细胞)高度保守蛋白—高迁移率族蛋白(high-mobility group, HMG)的HMGB1参与了SB的转座, 并通过对照实验证明, 加入HMGB1组的转座效率确实可以提高1.5倍。
研究还发现SB在同种动物的不同组织转座的效率也不相同[18], 例如在老鼠的胚胎干细胞中SB 的转染效率为10?5次/细胞[24], 而在生殖细胞中却可以达到0.2~2次/细胞[3,14], 这意味着一些组织特异性因子可能也参与了转座的发生。
5.1.4染色质的结构
SB的转座效率随着插入基因片段大小的减小而增高, 这表明从线性分子获得的转座子可能要比从环形中获得的转座子转座效率低, Yang 等[2]的研究证实了这一点。然而染色体上发生转座的序列均以线性存在的, 但转座的效率却很高, 这说明染色质的结构也可能是影响转座效率的一个重要因素。
5.1.5 甲基化
Yusa等[40]在实验中发现, 将引入CpG甲基化的转座子和没有引入甲基化的转座子结构分别重组到染色体的相同区域,注射转座酶质粒发现前者比后者的转座效率提高了100倍, 研究还发现CpG甲基化的转座子对于从质粒到基因组的转座同样具有增强作用。最近Park等[41]在对转座的整合位点进行分析发现, 在插入位点的两端出现丰富的CpG甲基化现象, 但是这对于外源基因的表达是否具有一定的影响, 还需要进一步探讨。
5.1.6 载体转染细胞的效率
SB转座系统必须进入细胞中才能发生转座, 而它本身并不能穿过细胞膜, 因此将SB与病毒载体相结合利用其高效的DNA转染效率, 通过转座实现基因的稳定整合; 也可以利用非病毒载体已经确立简单的质粒转移技术如: 基因枪, 电穿孔, 注射, 脂质体及PEI包裹等来实现外源基因的整合。
5.1.7 其他
通过在转座酶基因的前端融入一段信号肽, 增加转座子的拷贝数或加入不同的转座子, 对提高转座效率及促进外源基因的表达可能也具有一定的意义。
5.2安全性
一些病毒载体如HIV载体等都倾向于整合到具
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有活性的基因中, 即使是一直被认为是较为安全的AAV载体, 也具有插入基因内部的偏好性[42]。载体的整合引起的插入性基因突变是一个很严重的问题, 在对10个人应用这种反转录病毒载体进行基因治疗时, 其中2人因此患上了癌症[43], 而SB转座子则没有整合进入基因的偏好性, 而且在整合的位点也没有出现大片段的缺失和重组, 因此它比反转录病毒载体要安全的多。
SB转座子的相对随机整合可能产生的内源性基因失活问题, 有待于应用某些定点整合技术加以避免。此外, 转座过程中, 转座酶质粒也可能随机整合到基因组中, 转座酶的持续表达会使转座子持续转座, 其后果是非常严重的, 因此转座酶可以mRNA或蛋白质的形式给予[30,44]。
一旦这些问题得以解决后, SB转座子很有希望成为一种功能基因组学研究和基因治疗的理想工具。
参考文献(References):
[1] McClintock B. Chromosome organization and gene ex-
pression. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol, 1951, 16(3): 13?17.
[2] Yant SR, Meuse L, Chiu W, Ivics Z, Izsvak Z, Kay MA.
Somatic integration and long-term transgene expression in normal and haemophilic mice using a DNA transposon system. Nat Genet, 2000, 25(1): 35?41.
[3] Fischer SE, Wienholds E, Plasterk RH. Regulated trans-
position of a fish transposon in the mouse germ line. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(12): 6759?6764.
[4] Sheng D, Hui WX, Li G, Han M, Zhuang Y, Xu T. Effi-
cient transposition of the piggyBac resource (PB) trans-
poson in mammalian cells and mice. Cell, 2005, 122(3): 473?483.
[5] Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvak Z. Molecular
reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell, 1997, 91(4): 501?510.
[6] Horie K, Yusa K, Yae K, Odajima J, Fischer SEJ, Keng
VW, Hayakawa T, Mizuno S, Kondoh G, Ijiri T, Matsuda Y, Plasterk RHA, Takeda J. Characterization of Sleeping Beauty transposition and its application to genetic screen-
ing in mice. Mol Cell Biol, 2003, 23(24): 9189?9207. [7] Izsvak Z, Ivics Z, Plasterk RH. Sleeping Beauty, a wide
host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. Mol Biol, 2000, 302(1): 93?102.
[8] Liu L, Mah C, Fletcher BS. Sustained FVIII expression
and phenotypic correction of Hemophilia A in neonatal
mice using an endothelial-targeted Sleeping Beauty transposon. Mol Ther, 2006, 13(5): 1006?1015.
[9] DING Sheng, WU Xiao-Hui. Sleeping Beauty transposi-
tion system. Prog Biochem Biophys, 2003, 30(1): 43?48.
丁昇, 吴晓晖. “睡美人”转座系统研究进展. 生物化学
与生物物理进展, 2003, 30(1): 43?48.
[10] Baus J, Liu L, Arnold D, Sanz HS, Fletche BS. Hyperac-
tive transposase mutants of the Sleeping Beauty Transpo-
son. Mol Ther, 2005, 12(6): 1148?1156.
[11] Cui Z, Geurts AM, Liu G, Kaufman CD, Hackett PB.
Structure-function analysis of the inverted terminal re-
peats of the sleeping beauty transposon. Mol Biol, 2002,
318(5): 1221?1235.
[12] Geurts AM, Yang Y, Clark KJ, Cui Z, Dupuy AJ, Lar-
gaespada DA, Hackett PB. Gene transfer into genomes of
human cells by the Sleeping Beauty transposon system.
Mol Ther, 2003, 8(1): 108?117.
[13] Zayed H, Izsvak Z, Walisko O, Ivics Z. Development of
hyperactive Sleeping Beauty transposon vectors by muta-
tional analysis. Mol Ther, 2004, 9(2): 292?304.
[14] Dupuy AJ, Fritz S, Largaespada DA. Transposition and
gene disruption in the male germline of the mouse. Gene-
sis, 2001, 30(2): 82?88.
[15] Horie K, Kuroiwa A, Ikawa M, Okabe M, Kondoh G, Ma-
tsuda Y, Takeda J. Efficient chromosomal transposition of
a Tc1/mariner-like transposon Sleeping Beauty in mice.
Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(16): 9191?9196.
[16] Doak TG, Doerder FP, Jahn CL, Herrick G. A proposed
superfamily of transposase genes:transposon-like element
in ciliated protozoa and a common “D35E” motif. Proc
Natl Acad Sci USA, 1994, 91(3): 942?946.
[17] Masuda K, Yamamoto S, Endoh M, Kaneda Y. Transpo-
son independent increase of transcription by the Sleeping
Beauty transposase.Biochem. Biophys Res Commun, 2004,
317(3): 796?800.
[18] Izsvak Z, Ivics Z, Plasterk RH. Sleeping Beauty, a wide
host-range transposon vector for genetic transformation in
vertebrates. Mol Biol, 2000, 302: 93?102.
[19] Izsvak Z, Khare D, Behlke J, Heinemann U, Plasterk RH,
Ivics Z. Involvement of a bifunctional, paired-like DNA-binding domain and a transpositional enhancer in Sleeping Beauty transposition. Biol Chem, 2002, 277(37):
34581?34588.
[20] Vigdal TJ, Kaufman CD, Izsvak Z, Voytas DF, Ivics
https://www.doczj.com/doc/9314149978.html,mon physical properties of DNA affecting target site selection of Sleeping Beauty and other Tc1/mariner
transposable elements. Mol Biol, 2002, 323(3): 441?452. [21] Liu L, Sanz S, Heggestad AD, Antharam V, Notterpek L,
Fletcher BS. Endothelial targeting of the Sleeping Beauty
792 HEREDITAS
(Beijing)2007第29卷
transposon within lung. Mol Ther, 2004, 10(1): 97?105. [22] Izsvak Z, Ivics Z. Sleeping Beauty transposition: biology
and applications for molecular therapy. Mol Ther, 2004,
9(2): 147?156.
[23] Zayed H, Izsvak Z, Khare D, Heinemann U, Ivics Z. The
DNA bending protein HMGB1 is a cellular cofactor of
Sleeping Beauty transposition. Nucleic Acids Res, 2003,
31(9): 2313?2322.
[24] Luo G, Ivics Z, Izsvak Z, Bradley A. Chromosomal
transposition of a Tc1/mariner-like element in mouse em-
bryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(18):
10769?10773.
[25] Izsvak Z, Stuwe EE, Fiedler D, Katzer A, Jeggo PA, Ivics
Z. Healing the wounds inflicted by Sleeping Beauty
transposition by double-strandbreak repair in mammalian
somatic cells. Mol Cell, 2004, 13(2): 279?290.
[26] Liu G, Cui Z, Aronovich EL, Whitley CB, Hackett PB.
Excision of Sleeping Beauty transposons: parameters and
applications to gene therapy. Gene Med, 2004, 6(5): 574 ?583. [27] Yant SR, Wu X, Huang Y, Garrison BA, Burgess SM, Kay
MA. High-resolution genome-wide mapping of transposon
integration in mammals. Mol Cell Biol, 2005, 25(6): 2085 ?2094.
[28] Geurts AM, Hackett CS, Bell JB, Carlson CM, Collier LS,
Largaespada DA, Hackett PB. Structure-based prediction
of integration-site preferences of transposons into chro-
mosomes. Nucleic Acids Res, 2006, 34(9): 2803?2811. [29] Miller DG, Rutledge EA, Russell DW. Chromosomal ef-
fects of adeno-associated virus vector integration. Nat
Genet, 2002, 30(22): 147?148.
[30] Dupuy AJ, Clark K, Carlson CM, Fritz S, Davidson AE,
Markley KM, Finley K, Fletcher CF, Ekker SC, Hackett
PB, Horn S, Largaespada D A. Mammalian germ-line
transgenesis by transposition. Proc Natl Acad Sci USA,
2002, 99(7): 4495?4499.
[31] Harris JW, Strong DD, Amoui M, Baylink DJ, Lau KH.
Construction of a Tc1-like transposon Sleeping Beauty-
based gene transfer plasmid vector for generation of stable
transgenic mammalian cell clones. Anal Biochem, 2002,
310(1): 15?26.
[32] Chen ZJ, Kren BT, Wong PY -P, Low WC, Steer CJ.
Sleeping Beauty-mediated down-regulation of huntingtin
expression by RNA interference. Biochem Biophys Res
Commun, 2005, 329(2): 646?652.
[33] Yant SR, Ehrhardt A, Mikkelsen JG, Meuse L, Pham T,
Kay MA. Transposition from a gutless adeno-transposon
vector stabilizes transgene expression in vivo. Nat Biotech,
2002, 20(10): 999?1005.
[34] Yae K, Keng VW, Koike M, Yusa K, Kouno M, Uno Y,
Kondoh G, Gotow T, Uchiyama Y, Horie K, Takeda J.
Sleeping Beauty transposon-based phenotypic analysis of mice: lack of arpc3 results indefective trophoblast out-
growth. Mol Cell Biol, 2006, 26(16): 6185?6196.
[35] Dupuy AJ, Jenkins NA, Copeland NG. Sleeping Beauty: a
novel cancer gene discovery tool. Hum Mol Genet, 2006,
15(Suppl. 1): R75?R79.
[36] Score PR, Belur LR, Frandsen JL, Geurts J, Yamaguchi T,
Somia NV, Hackett PB, Largaespada DA, McIvor RS.
Sleeping Beautymediated transposition and long-term ex-
pression in vivo: use of the Cre-LoxP recombinase system
to distinguish transposition-specific expression. Mol Ther,
2006, 13(3): 617?624.
[37] Devon RS, Porteous DJ, Brookes AJ. Splinker-
ettes-improved vectorettes for greater efficiency in PCR walking. Nucleic Acids Res, 1995, 23(9): 1644?1645. [38] XIAO Qiao-Xue, CAO Yang, HUANG Zi-Ran, LIU Li-
ang-Shi. The mariner transposon in insects. Heredi-
tas(Beijing), 2000, 22(2): 114?118.
肖巧学, 曹阳, 黄自然, 刘良式. 昆虫中的mariner类转
座子. 遗传, 2000, 22(2): 114?118.
[39] Wilson MH, Kaminski JM, George AL Jr. Functional zinc
finger/sleeping beauty transposase chimeras exhibit at-
tenuated overproduction inhibition. FEBS Lett, 2005, 579(27): 6205?6209.
[40] Yusa K, Takeda J, Horie K. Enhancement of Sleeping
Beauty transposition by CpG methylation: possible role of
heterochromatin formation. Mol Cell Biol, 2004, 24(9): 4004?4018.
[41] Park CW, Park J, Kren BT, Steer CJ. Sleeping Beauty
transposition in the mouse genome is associated with changes in DNA methylation at the site of insertion. Ge-
nomics, 2006, 88(2): 204?213.
[42] Hiroyuki N, Eugenio M, Sally F, Theresa AS, Markus G,
Mark AK. AAV serotype 2 vectors preferentially integrate
into active genes in mice. Nat Genet, 2003, 34(3): 297 ?302. [43] Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, McCor-
mack MP, Wulffraat N, Leboulch P, Lim A, Osborne CS,
Pawliuk R, Morillon E, Sorensen R, Forster A, Fraser P, Cohen JI, de Saint Basile G, Alexander I, Wintergerst U,
Frebourg T, Aurias A, Stoppa-Lyonnet D, Romana S, Radford-Weiss I, Gross F, Valensi F, Delabesse E, Mac-
intyre E, Sigaux F, Soulier J, Leiva LE, Wissler M, Prinz
C, Rabbitts TH, Le Deist F, Fischer A, Cavazzana-Calvo M. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two pa-
tients after gene therapy for SCID-X1. Science, 2003, 302(5644): 415?419.
[44] Wilber AC, Frandsen JL, Geurts JL, Largaespada DA,
Hackett PB, McIvor RS. RNA as a source of transposase
for Sleeping Beauty mediated gene insertion and expres-
sion in somatic cells and tissues. Mol Ther, 2006, 13(3): 625?630.
生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名：魏斌聪 学号：200806016139 专业/班级：生物工程081班 课程名称：生物工程原理 指导教师：陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
转基因作物的研究进展 魏斌聪 （浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015） 摘要：人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程，对其基因问题的研究作了讨论，并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析，最后对此项技术作出展望。 关键词：转基因作物；DNA技术；基因导入；安全性 前言 转基因植物（transgenic plant），是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面，如可食用的大豆、玉米等，或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来，转基因作物同普通植物似乎没有任何区别，它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来，生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它具有某种新的特性：抗除莠剂的特性，抗植物病毒的特性，抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体：细菌、病毒、昆虫等。这样，通过生物工程技术，人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性，这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年，全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年，首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年，美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、
分子生物学基础和技术教学大纲 （适用于医学检验和医学相关专业） 课程性质与目的 分子生物学是医学领域发展最快的学科之一，日新月异的技术使它逐渐成为医学发展的重要支柱。随着本世纪初人类基因组计划的完成，医学发展进入了一个全新的时代。疾病基因的不断发现和克隆，使人们对疾病的认识也不断深入，而这些重大的医学进步离不开技术上的更新和发展，生物芯片技术、基因测序技术、毛细管电泳技术等，每一次技术的进步都为分子生物学的发展提供了有力的保障。 分子生物学技术是一门重要的基础和应用课程，教学方式目前主要以理论课程为主，分基础理论和基础技术两个部分，重点讲述分子生物学检验技术的基础理论和基础知识，并引入近年发展的新理论、新技术，使学生了解和学习最新进展和相关内容。同时分子生物学技术最主要的作用是作为研究医学的一种媒介和工具，具有很强的实践性，其基本知识和理论来源于科学实验，因此现在现针对本科学生开展了分子生物学实验课程，实验教学是强化理论课的重要方式，是培养医学生实验科学概念和实验技能的重要途径，通过综合性的实验可以强化学生对理论的深入理解和实际运用，可以更全面直观的分析理论知识。更重要的是，实验教学是培养学生综合分析和解决问题的能力以及科学创新能力的重要方式。 本课程的目的是通过分子生物学重要技术的学习，使学生掌握一门可运用于医学研究的技术和工具，了解医学发展的最新进展和前沿技术，通过理论与实践的结合将分子生物学融入医学研究的各方面，分析疾病基因、从分子水平分析疾病发生的原因、跟踪疾病发展过程、检测感染人类的病原生物以及未来根据个体化治疗奠定理论和技术基础。 课程的设置与要求 本课程是在学生系统学习了前期课程的基础上由检验系临床化学教研室负责开设的， 与本课程相关的基础课程有生物化学和生化技术等。本课程分为理论课程和实验课程两部分。理论课主要包括基础理论和基本技术，基础理论主要讲授基因和基因组、原核生物和真核生物基因组、人类基因组计划、蛋白质组学、肿瘤分子生物学等；基本技术包括了核酸提取、DNA重组技术、核酸干扰技术、核酸分子杂交、聚合酶链反应、DNA芯片等。实
转座子及其相关技术的研究 摘要：转座子是一类在细菌的染色体,质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列，转录组的活动对生物体基因组的转录以及演变存在着严重影响，本文就转座子的基因机理及特征、转座子沉默、转座子的标签技术以及其在植物中的运用进行阐述。 转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。MclCintockl’嗜次在玉米中的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排列的传统理论。目前认为，多数生物体有自发突变且有重要表型效应出现的原因源于转座子的可动性，并且可以导致宿主基因组发生从点突变到染色体重排的一系列变化，转座子在进化上为建立宿主基因特性起着重要作用。 1.转座子特征与分类 基因转座时发生的插入作用中受体分子都有一段3-12bp的靶序列DNA会自我复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座子可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段,重新插入基因组DNA中。第二类转座子又称为返座元，在结构和复制上与反转录病毒类似，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。 2转座子相关技术 2.1转座子分离方法 有4种方法用来分离转座子:(l)转座子诱捕法，此法适用于分离具有相当高的整合和切割频率的转座子。(2)Southern杂交法，此种方法需要有适当的探针，用于检测已知的转座子。(3)重复DNA序列鉴定法，适用于高拷贝数的无论是否有活性的转座子。(4)PcR扩增法，对己知序列的转座子可以设计引物直接PCR扩增。
平板上的转座突变株机器自动挑蓖落 ?-————-----—-畸到38好L板上培养转到96孔板上 ?-—__—_____--—’进行P僳 I 转另一个板I 山
l 转另一个板l 山 戬.gsT分析数据整理 ●÷————————————一●}--—---————-—一 图1建立转座子突变株库的技术路线 子在铜绿假单胞菌PA01基因组中的转座插入采样数不符合泊松分布,虽然如此,但毕竟在最终还是获得了一个近饱和的突变株库。而Garsin(71等在构建粪肠球菌的Tn917转座插入突变株库时发现,测序的8865个Tn917转座突变株突变基因只对应了610个不同的开放阅读框,远远低于预期的2400个。这些结果说明使用随机性差的转座子会大大增加建库的成本。因此,有的研究利用了两种类型转座子构建突变株,这是为了防止一种转座子可能有的插入热区,而造成在基因组插入位点的随机性不佳,进而造成某些基因的突变株在筛选中漏选,而另一些基因的突变株则被多次重复筛选。两种类型转座子的使用,可以互相弥补,降低发生漏选或者重复筛选的可能性。例如在建立铜绿假单胞菌PAl4突变株库工作中,最开始采用的是Tn5来源的细菌转座子——hphoA。如前所述,尽管Tn5来源的转座子插入随机性非常好,研究者还是发现了至少一个热区(Hot spot,即gacA基因,同样也存在一些冷区(Cold spots。为了避免转座位点的选择性,研究者又采用了真核生物来源的mariner转座子,该转座子能够在很多原核生物中进行转座,而且预计与TnphoA在靶位偏嗜上存在 差异,故联合使用可以降低转座选择性;②对突变基因测定方法采用随机引物PCR的方式,以达到自动化的目的。确定突变株突变基因的方法有很多,如反向PCR等,但 这些方法的最大问题是需要人工参与,无法实现完全自动化测序,从而使确定突变基因的工作几乎不可能完成。而随机引物PCR的方法可以采用机器自动化 79
浅谈我国转基因水稻的研究(一) 论文关键词]水稻转基因论文摘要]稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。目前，水稻转基因研究在我国已取得显著进展。详细介绍转基因技术，并阐明我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展， 水稻是我国的重要经济作物和粮食作物。水稻分布极其广泛，由于生态环境的复杂性和所处地理环境的影响，水稻在漫长的进化过程中，形成了极其丰富的遗传多样性，染色体组型和数目复杂多样，成为研究稻种起源、演化和分化必不可少的材料。 植物转基因技术是利用遗传工程手段有目的地将外源基因或DNA构建，并导入植物基因组中，通过外源基因的直接表达，或者通过对内源基因表达的调控，甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达，使植物获得新性状的一种品种改良技术。它是基因工程、细胞工程与育种技术的有机结合而产生的一种全新的育种技术体系。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的各种抗性或抗性相关基因转入水稻，进一步拓宽了水稻抗病基因源，为抗病育种提供了一条新途径。 一、国内外的转基因技术 转基因技术自20世纪70年代诞生以来，已经取得迅速的发展。到目前为止，中国已经是全球第4大转基因技术应用国。 转基因生物技术的应用，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。中国是继美国之后育成转基因抗虫棉的第二个国家。现在河北省与美国孟山都合作育成33B抗虫棉（高抗棉铃虫、抗枯萎病、耐黄萎病）。由中国农科院生物中心、江苏省农科院导入Bt基因，由安徽省种子公司，安徽省东至县棉种场共同选育的抗虫棉“国抗1号”在安徽省已通过审定。国际水稻所将抗虫基因导入水稻，育成抗二化螟、纵卷叶螟的转基因水稻。中国农科院、中国农业大学、中国科学院、河南农科院等许多科研单位和高校将几丁质酶和葡聚糖酶双价基因导入小麦育成抗病转基因小麦、转基因烟草、转基因水稻等等。英国爱丁堡大学将水母发光基因导入烟草、芹菜、马铃薯等作物，获得发光作物，驱赶害虫。 至于油菜方面利用转基因工程培育雄性不育系及其恢复系的研究，亦取得了突破性的进展。比利时为了提高菜饼粗蛋白质的含量，将一种草控制的蛋白质基因转移到油菜上来，选出高蛋白质含量的转基因油菜品种。瑞典Svalow-Weibull等公司利用基因工程技术将外源基因导入甘蓝型油菜，培育成抗除草剂油菜新品种；比利时PGS公司采用基因工程手段创造出新的油菜授粉系统；法国应用原生质体融合技术将萝卜不育细胞质的恢复基因引入甘蓝型油菜，充分利用萝卜不育细胞质不育彻底的特性，实现了萝卜不育细胞质的三系配套，对推动全球杂交油菜育种具有革命性的影响。 二、我国转基因技术在水稻上的应用及研究进展 我国是农业超级国，因此，中国人吃饭问题的关键是水稻问题（高产和抗性问题），而水稻问题的核心便是转基因技术在水稻中的成功应用。 近年来，植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟，国内外相继开展了水稻东格鲁病、条纹叶枯病、黄矮病、矮缩病等8种病毒病的转基因育种研究，将各病原病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、编码结构或非结构蛋白基因干扰素CDNA等分别导入水稻，获得了抗不同病毒病的转基因株系或植株。在我国，转基因技术在水稻中的应用已经取得了惊人的成果。（一）转基因技术在提高水稻植株的抗Basra除草剂的成果 王才林等利用花粉管通道法将抗Basta除草剂的bar基因导入水稻品系“E32”，获得转基因植株。抗性鉴定表明，转基因植株能充分表达对Basta除草剂的抗性；通过对转基因植株后代PCR分析，证实bar基因已整合到受体植株的基因组中，遗传分析表明，bar基因能在有性生殖过程中传递给后代，并在T代开始分离出抗性一致的稳定株系。段俊等利用转基因技术，
表观遗传学与疾病及其研究进展概述 摘要：表观遗传学是在基因组DNA 序列不发生变化的条件下，基因表达发生的改变也是可以遗传的，导致可遗传的表现型变化。表观遗传学主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控、基因组印记、假基因、内含子、核糖开关等。和表观遗传学相关的疾病主要有肿瘤、心血管病、成瘾、自身免疫系统性病等。本文就表观遗传学与疾病进行综述。 关键词：表观遗传学疾病 一、表观遗传学的基本概念 经典遗传学认为遗传的分子基础是核酸，生命的遗传信息储存在核算的碱基序列上，碱基序列的改变会引起生物体表现型的改变，而这种改变可以从上一代传递到下一代。然而，随着遗传学的发展，人们发现，DNN、组蛋白、染色体水平的修饰也会造成基因表达模式的变化，并且这种改变是可以遗传的。这种通过有丝分裂或减数分裂来传递非DNA序列遗传信息的现象成为表观遗传，表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰，即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门学科[1]。Epigenetics这一名词的中文译法有多种，常见的有“表观遗传学”、“表现遗传学”、“后生遗传学”、“外因遗传学”、“表遗传学”、“外区遗传学”等等。表观遗传学是Waddington于1942年在描述生物体的基因型与表型之间的因果关系时提出的，他指出基因型的遗传(heredity)或传承(inheritance)是遗传学研究的主旨，而基因型产生表型的过程则属于表观遗传学研究的范畴，他把表观遗传学描述为一个控制从基因型到表现型的机制。随着遗传学的快速发展，这个词的意思越来越窄[ 2]。1987年，Holliday指出可在两个层面上研究高等生物的基因属性：第一个层面是基因的世代间传递的规律，这是遗传学；第二个层面是生物从受精卵到成体的发育过程中基因活性变化的模式，这是表观遗传学。1994年，Holliday又指出基因表达活性的变化不仅发生在发育过程中，而且也发生在生物体已分化的细胞中；基因表达的某种变化可通过有丝分裂的细胞遗传下去，他进一步指出表观遗传学研究的是“上代向下代传递的信息，而不是DNA序列本身”，是一种“不以DNA序列的改变为基础的细胞核遗传”。1999年，Wollfe把表观遗传学定义为研究没有DNA序列变化的、可遗传的基因表达的改变。 表观遗传学 (epigenetics) 与遗传学是一个对应的关系，是研究表观遗传变异的遗传学分支的学科。它现在有很多新的定义，在非神经学中它的定义是不依赖于染色体上DNA序列的改变却能稳定遗传的表型变化。在Allis et al最近的一本书中可以找到两种定义，一个是：表观遗传是和DNA突变无关的可遗传的表型变化；另一个定义是：染色质调节的基因转录水平的变化，这种变化不涉及DNA序列的改变[ 3]。从1989到2008年期间和表观遗传相关的著作将近6000多本，不论人们怎样定义表观遗传学，它始终在研究中占有重要地位，The National Institutes of Health 把表观遗传学描述为：在控制基因的活性和表达方面和遗传的变化相关，是一个细胞转录水平长期、稳定的改变因素，但并不一定是必须的遗传因素。本文就针对表观遗传学的内容以及与其相关的疾病进行综述。
RNA干涉的研究进展及应用前景 摘要：RNA干涉是广泛存在于生物体中的一种转录后基因沉默( post-transcriptional gene silencing ,PTGS )，它是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的同源mRNA高效特异性降解，从而导致基因表达沉默。从RNAi现象发现以来，进行了许多的研究，对其的基本作用机制有了初步的了解。作为一种阻断基因表达的新手段,RNAi 技术日趋成熟完善,开辟了一条基因治疗的新途径。RNAi技术在很多人类疾病的基因治疗上都有应用，如肿瘤、癌症、病毒性感染疾病等方面。 关键字：RNA干涉；基因沉默；机制；应用 RNA干涉（RNA interference, RNAi），是真核生物中普遍存在的一种自然现象，在生物体内双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解，从而导致基因表达沉默。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达, 用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此,RNA技术又被形象的称为基因敲除(knockout) 或基因沉默(gene silencing),RNAi是一种典型的转录后基因调控方法,又称转录后基因沉默( post-transcriptional gene silencing ,PTGS )[1]。它广泛存在于生物界，是生物体抵御病毒或其他外来核酸人侵而保持自身遗传稳定的保护性机制[2]。 1. RNAi的发现历史 九十年代初期,科学家在向牵牛花转导色素合成基因时,观察到“共抑制”(cosuppression)现象。Jorgensen 等将产紫色素基因导入矮牵牛属植物中, 希望花的紫色更深, 却发现转基因后部分花的颜色不但没有加深, 反而变成白色, 这表明外源和内源产紫色素基因的表达都受到抑制, 他们将这一现象称为共抑制(cosuppression)[3]。所谓共抑制是指内源基因在转基因或病毒感染的诱导下发生的基因沉默现象，大部分是转录后水平的基因沉默(PTGS)[4]。1994年，意大利的Cogoni[5]将类胡萝卜素合成所需基因转入到粗糙红色链胞酶中,结果导至30%的转化细胞中的霉菌自身基因失活，他们叫这种基因失活现象为压制（Quelling）。1995年，Guo[6]等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire[7]等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。在后来的研究中，不断发现由dsRNA介导的RNAi现象出现在多种真核生物中，如真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等。 2.RNAi的作用机制 根据现有研究显示，可能的作用机制可分为三个阶段：起始阶段、效应阶段和循环放大阶段。效应阶段即当病毒基因、人工转入基因及转座子等外源性基因随机整合到真核宿主细胞基因组内,并利用宿主细胞进行转录时,常常产生一些与这些基因的mRNA同源的dsRNA。
医学微生物学复习要点 第1章绪论细菌的形态与结构 名词解释 微生物：是一类肉眼不能直接看见，必须借助光学或电子显微镜放大几百或几万倍才能观察到的微小生物的总称。 医学微生物学：是研究与人类疾病有关的病原微生物的基本生物学特性、致病性、免疫性、微生物学检查及特异性防治原则的一门学科。 中介体：是细菌细胞膜向内凹陷，折叠、卷曲成的囊状结构，扩大膜功能，又称拟线粒体。多见于革兰阳性菌。 质粒：是染色体外的遗传物质，为双股环状闭合DNA，控制着细菌的某些特定的遗传性状。 异染颗粒：用美兰染色此颗粒着色较深呈紫色，故名。用于鉴别细菌。 荚膜：某些细菌在其细胞壁外包绕的一层粘液性物质。 鞭毛：细菌菌体上附有细长呈波浪弯曲的丝状物。鞭毛染色后光镜可见。菌毛：菌体表面较鞭毛更短、更细、而直硬的丝状物。电镜可见。 芽胞：某些细菌在一定的环境条件下，胞质脱水浓缩，在菌体内形成一个圆形或椭圆形的小体。 简答题 1.简述微生物的种类。 细胞类型特点种类 非细胞型微生物无典型细胞结构、在 活细胞内增殖 病毒 原细胞型微生物仅有原始细胞的核、 缺乏完整细胞器 细菌、放线菌、衣原 体、支原体、立克次 体 真核细胞型微生物有完整上的核、有完 整的细胞器 真菌 2.简述细菌的大小与形态。 大小：测量单位为微米（μm） 1μm = 1/1000mm 球菌：直径1μm 杆菌：长2~3μm 宽0.3~0.5μm 螺形菌：2~3μm 或3~6μm 形态：球形、杆形、螺形，分为球菌、杆菌、螺形菌。3.分析G+菌、G-菌细胞壁结构与组成特点及其医学意义。细菌细胞壁构造比较 G+菌G-菌 粘肽组成 聚糖骨架 四肽侧链 五肽交联桥 同左 同左 无 特点三维立体框架结构，强 度高 二维单层平面网络，强度 差 含量多，50层少，1~2层 其他成分磷壁酸外膜：脂蛋白、脂质双层、 脂多糖 医学意义： 1、染色性：G染色紫色（G+）红色（G-） 2、抗原性：G+：磷壁酸G-：特异性多糖（O抗原/菌体抗原） 3、致病性：G+：外毒素、磷壁酸G-：内毒素（脂多糖） 4、治疗：G+：青霉素、溶菌酶有效G-：青霉素、溶菌酶无效 4.简述L型菌的特性。 1、法国Lister研究院首先发现命名。 2、高度多形性，不易着色，革兰阴性。 3、高渗低琼脂血清培养基2-7天荷包蛋样、颗粒、丝状菌落。 4、具致病性，常在应用某些抗生素（青霉素、头孢）治疗中发生，且易复发。 5、临床症状明显但常规细菌培养（-），予以考虑L型菌感染 5.分析溶菌酶、青霉素、链霉素、红霉素的杀菌机制。 溶菌酶：裂解 -1,4糖苷键，破坏聚糖骨架。 青霉素：竞争转肽酶，抑制四肽侧链和五肽交联桥的连接。 以上两者主要是抑制G+菌。 链霉素：与细菌核糖体的30S亚基结合，干扰蛋白质合成。 红霉素：与细菌核糖体的50S亚基结合，干扰蛋白质合成。 6.为什么G-菌的L型菌比G+菌的L型菌更能抵抗低渗环境？ G+菌细胞壁缺陷形成的原生质体，由于菌体内渗透压很高，可达20—25个大气压，故在普通培养基中很容易胀裂死亡，必须保存在高渗环境中。G-菌细胞壁中肽聚糖含量较少，菌体内的渗透压(5—6个大气压)亦比G+菌低，细胞壁缺陷形成的原生质球在低渗环境中仍有一定的抵抗力。 7.叙述细菌的特殊结构及其医学意义。 荚膜：a、抗吞噬作用——为重要毒力因子 b、黏附作用——形成生物膜 c、抗有害物质的损伤作用 鞭毛：a、细菌的运动器官 b、鉴别细菌（有无鞭毛、数目、位置） c、抗原性——H抗原，细菌分型 d、与致病性有关（粘附、运动趋向性） 菌毛：普通菌毛：粘附结构，可与宿主细胞表面受体特异性结合，与细菌的致病性密切相关。 性菌毛：a、传递遗传物质，为遗传物质的传递通道。 b、作为噬菌体的受体 芽胞：a、鉴别细菌（有无芽胞、位置、大小、形状） b、灭菌指标（指导灭菌，以杀灭芽胞为标准） 8.分析细菌芽胞抵抗力强的原因。 1、含水量少（约40%）—繁殖体则占80% 2、含大量的DPA（吡啶二羧酸） 3、多层致密膜结构 第2章细菌的生理 名词解释 热原质：热原质（致热源），是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质。产生热致源的细菌大都为格兰阴性菌，热原质即其细胞壁的脂多糖。 菌落：单个细菌分裂繁殖成肉眼可见的细菌集团。分为三型： 1.光滑型菌落 2.粗糙型菌落
基因组学课程论文 所在学院生命科学技术学院 专业14级生物技术（植物方向） 姓名金祥栋 学号2014193012
水稻基因组学的研究进展 摘要：随着模式植物——拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻基因组测序的完成及种质资源的基因组重测序，为水稻功能基因组研究奠定了基础。现综述我国水稻基因组测序和功能基因组研究历史，重点介绍了近年来在水稻基因组序列分析中获得的几项最新的研究结果。 关键词：水稻；基因组测序；功能基因组；研究历史；基因组学；研究进展 The recent progress in rice genomics research Abstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant-- Arabidopsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent years. Rice i s one of the most important crops in the world, raised nearly half of the world popul ation. At the same time in south rice Keegan group is smaller, with linear and linear features such as easy transformation and other gramineous plant genome, has been use d as a model crop for plant genome research of Gramineae. Genome sequencing and germplasm resources the rice genome sequencing completed laid the foundation for ric e functional genomics research. This article reviews the history and function of our ge nome sequencing of rice genome research, introduces several latest research results in recent years in the analysis of rice genome sequences. 前言 基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念，是研究生物基因结构与功能的学科，是在遗传学的基础上发展起来的一门现代生物技术前沿科学，也是现代分子生物学和遗传工程技术所必要学科，是当今生物学研究领域最热门、最有生命力、发展最快的前沿科学之一。基因组学的主要任务是研究探索生物基因结构与功能，生物遗传和物理图谱构建，建立和发展生物信息技术，为生物遗传改良及遗传病的防治提供相关技术依据。 进入21 世纪，随着全球化、市场化农业产业发展和全球贸易一体化格局的逐步形成，我国种业正面临前所未有的严峻挑战，主要表现在：依靠传统育种技术难以大幅度提高粮食单产；土地资源短缺，农业环境污染日益突出；种质资源发掘、基因组育种技术亟需创新等。水稻不仅是重要的粮食作物，由于其基因组较小且与其他禾本科作物基因组存在共线性，以及具有成熟高效的遗传转化体系，已成为作物功能基因组研究的模式植物。因此，水稻基因组研究对发展现代农作物育种技术、提升种业国际竞争力和保障粮食有效供给具有重大战略意义。 基因组研究主要包括三个层次:①结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。②功能
植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 667?676, https://www.doczj.com/doc/9314149978.html, 收稿日期: 2006-11-08; 接受日期: 2007-04-09基金项目: 国家自然科学基金(No. 30471066) * 通讯作者。E-mail: gao －dongying@https://www.doczj.com/doc/9314149978.html, .专题介绍. 水稻转座子研究进展 高东迎*, 何冰, 孙立华 江苏省农业科学院粮食作物研究所, 南京 210014 摘要 转座子是植物基因组的重要组成部分, 对于研究植物基因组进化等具有重要意义。随着水稻全基因组测序计划的开展和完成, 水稻转座子研究取得了极大进展, 目前已经在水稻基因组中发现了几乎所有类型的转座子, 约占水稻基因组的35%。在正常情况下, 大多数水稻转座子不具有转座活性, 但是在特定的条件下(如组织培养或辐射等), 水稻基因组中沉默的转座子可以被激活, 从而可能导致插入突变并影响基因的表达。在水稻中已鉴定出6个有活性的转座子, 其中Tos17已被应用到水稻功能基因组研究中。转座子序列的新的分子标记转座子展示(transposon display, TD)现已被开发, 并在水稻遗传作图和遗传分化研究中得到应用。 关键词 基因表达, 水稻, 转座子, 转座子展示 高东迎, 何冰, 孙立华 (2007). 水稻转座子研究进展. 植物学通报 24, 667?676. 转座子(transposable elements 或 transposons)是指基因组中那些能够移动或复制自己并整合到新位点的DNA 片段(Curcio and Derbyshire, 2003), 其对于研究植物基因组的组成、进化和基因的表达调控等都具有重要意义(Feschotte et al., 2002)。水稻是世界重要粮食作物, 禾本科植物分子生物学研究的模式植物。近年来, 水稻转座子研究受到越来越多学者的重视, 并已取得较大进展。本文将对水稻转座子研究所取得的一些新进展进行归纳。 1 水稻基因组中转座子的种类 传统观念认为, 水稻基因组中不存在转座子, 但随着水稻分子生物学的发展, 特别是水稻全基因组测序的开展和完成, 科学家们意外发现, 在水稻基因组中不仅有转座子,而且几乎包括所有类型转座子(Mao et al., 2000;Turcotte et al., 2001; Jiang et al., 2004b; International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。转座子约占水稻基因组组成的35%, 其中第1类转座子(Class I, 也称反转录转座子)和第2类转座子(Class II, 也称DNA 转座子)分别占19.4%和14.0%, 但从数目上讲,第2类转座子要远多于第1类转座子, 这是因为第2类转座子包括了大量微小转座子 (表1)(International Rice Ge-nome Sequencing Project, 2005)。现对水稻的主要类型转座子介绍如下。 1.1 MITEs 微小反向重复转座子(miniature inverted repeat trans-posable element, MITEs)是水稻基因组中数量最多的一类转座子, 大约有90 000个(Jiang et al.,2004b)。MITEs 为非自主DNA 类转座子, 但是其序列小(一般为100－500 bp)且拷贝高, 具有插入位点偏爱性, 使得其与一般非自主DNA 类转座子又有明显不同。由于MITEs 不编码转座酶(transposase), 其分类主要依据非编码区的相似性, 如MITEs 的末端反向重复(terminal inverted repeats, TIRs)及其插入到基因组后所形成的2－3 bp 的同向重复序列(target site duplications, TSDs)。根据这个标准, 大多数水稻MITE 被分为Tourist (3 bp 的TSD,
水稻转基因育种研究进展 王彩芬,安永平,韩国敏,张文银,马 静 (宁夏农林科学院农作物研究所,宁夏永宁 750105) 摘要:对水稻转基因技术在抗虫、抗病、抗逆及改良米质等方面的进展进行了综述。 关键词:水稻; 转基因育种; 进展 中图分类号:S511.035.3 文献标识码:A 文章编号:1002-204X(2005)06-0055-03 20世纪下半叶以来,由于分子生物学研究的巨大成就,使生物学成为自然科学的带头学科,它的理论和方法已渗透到生命科学的许多领域,为生命科学的研究带来新的思维方式和研究手段。基因工程技术在植物遗传育种上应用很广泛,并取得了显著成就。 水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。据专家预测,到2025年在现有稻谷产量的基础上再增加60%才能满足需要(K hush,1995)。随着人口的增长和耕地面积的减少,世界尤其是我国将面临粮食问题的严峻挑战,培育优良品种是提高稻谷产量的主要途径。传统的育种技术已为培育水稻新品种做出了巨大贡献,并将在今后继续发挥主导作用,但由于品种资源的贫乏,单靠传统育种已很难有大的突破。基因工程技术为水稻分子标记辅助育种、水稻转基因育种提供了一条新途径。转基因技术可以将水稻基因库中不具备的抗病、抗虫、抗除草剂、抗旱、耐盐、改善品质、提高产量等基因转入水稻,从而实现水稻种质创新和为生产提供优良品种。自1988年以来,国内外已得到了许多水稻转基因植株,涉及到抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、耐盐、改良品质等重要农艺性状,有些已进入田间试验和应用阶段。 1 水稻转基因育种进展 植物转基因育种是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达,使植物获得新的性状的一种品种改良技术。在植物分子生物学研究的众多材料中,水稻不仅是世界重要粮食作物,而且由于其基因组较小、重复序列较少的优点而成为一种重要的分子遗传学研究的单子叶模式植物,基因组测序已完成。自1988年首次获得转基因水稻以来,水稻转基因技术已获得突飞猛进的发展,目前已成功获得籼稻、粳稻、爪哇稻的转基因植物。随着基因枪转化技术的建立和根癌农杆菌介导转化法的成功,水稻基因转化技术日益完善。而且转移目标基因已从报告基因或筛选标记基因进入改良水稻抗性和适应性,以及改善品质,提高产量等重要基因的利用。 1.1 抗虫转基因水稻育种 水稻是虫害最多的大田作物,稻螟虫和稻飞虱危害最为严重,水稻中抗虫资源贫乏,转基因技术为抗虫品种的培育提供了一条新途径。自从1989年实现苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)抗虫基因转化水稻并得到再生植株以来,转抗虫基因水稻的研究取得了很大进展。转抗虫基因水稻包括转Bt基因、转蛋白酶抑制基因和转凝集素基因。在转Bt基因的研究方面,中国农科院生物技术中心杨虹等(1989)将Bt基因导入水稻品种台北309、中花8号的原生质体并获得再生植株;Fujim oto等(1993)通过电激法将cry LAb 基因导入水稻,首次报道了转Bt基因水稻对二化螟和稻纵卷叶螟的抗性。项友斌等(1999)利用农杆菌介导实现了苏云金杆菌抗虫基因cryI A(b)和cryI A(c)在水稻中的转化;黄健秋等(2000)利用农杆菌介导获得转(Bt)基因秀水11和春江11植株;薛庆中等(2002)利用农杆菌介导获得转双价抗虫基因(cryI Ac和豇豆胰蛋白酶抑制基因C pTI)浙大19植株;朱常香等(2002)获得Bt和X a21共转化水稻(C48)植株。近几年转Bt基因研究越来越多,进展很快,在籼稻、香稻、爪哇稻、杂交稻、深水稻中获得成功,选育出克螟稻1号、2号、3号(舒庆尧等,1998)。转Bt基因水稻在我国已进入环境释放阶段,有望培育出应用于生产的抗虫品种。 在转蛋白酶抑制剂基因水稻研究方面,通过电激介导原生质体转化,Xu等(1996)把豇豆胰蛋白酶抑制剂基因C pT i转入粳稻品种台北309,转基因植株对大螟和二化螟2种水稻虫害都具有抗性;通过基因枪介导马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ转化水稻,Duan等(1996)获得了Nipponbare、台南67和Pi4等3个粳稻品种的抗大化螟转基因株系;Lee等(1999)利用PEG介导法将大豆K units胰蛋白酶抑制剂(SK TI)的cDNA转入粳稻Nagdongbyeo的原生质体,再生转基因植株的后代抗褐飞虱。曾黎琼等(2004)利用农杆菌介导将马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)导入玉优1号、HT-7中;孔维文等(2004)利用农杆菌介导将PT A和马铃薯高赖氨酸蛋白基因(S B401)同时转入超级杂交稻亲本材料1826中。在转凝集素基因水稻研究中,主要是转雪莲花凝集素(G NA)基因,采用基因枪法,英国John Innes Centre(Maqbool等,1999;Rao等,1998;Sudhakar等,1998)把G NA基因导入AS D16、M5、M7、M12、FX92D、Basmati370等籼稻品种中,得到200多株转基因植株,G NA在水稻中呈高水平的组成性表达(用Ubi启动子)或韧皮部专一性表达(用Rssl启动子),转基因植株抗褐飞虱。在我国,傅向东等(1997)用G NA基因枪转化水稻IR72、IR76、珍汕97和秀水11等品种,部分转基因植株子代对褐飞虱有一定抗性;T ang(唐克轩等,1999)通过基因枪介导实现了G NA 基因和X a21基因的共转化,得到了转基因植株。唐克轩等(2003)利用农杆菌介导将半夏凝集素基因(pta)导入粳稻鄂宛105、中花12和籼稻E优532中,获得7个转基因纯系。 1.2 抗病转基因水稻育种 抗病转基因水稻包括转抗病毒基因、抗真菌病害基因和抗细菌病害基因。抗病毒转基因已开展了8种病毒的转基因研究,包括水稻通枯罗病毒(rice tungro disease)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged 收稿日期:2005-07-21 作者简介:王彩芬(1968-),女,副研究员,从事水稻花培育种研究。T el:0951-*******E-mail:caifen-68@https://www.doczj.com/doc/9314149978.html,
水稻基因组进化的研究进展 水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻是第一个被全基因组测序的作物，目前栽培稻2个亚种全基因组测序工作已经完成：粳稻品种日本晴(Nipponbare)通过全基因组鸟枪法和逐步克隆法被测序，籼稻品种扬稻6号(9311)通过全基因组鸟枪法被测序。除核基因组外，水稻叶绿体和线粒体基因组也于1989年和2002年分别被测序。水稻2个亚种的全基因组测序完成，一方面开启了植物比较基因组学的大门，另一方面为人们在基冈组水平上鉴定出所有水稻基因并分析其功能奠定了基础，同时也使得人们对植物进化的认识，尤其是对禾本科植物进化的了解，逐步从系统分类和分子标记水平进入到了基因组序列水平。许多研究者通过对水稻基因组序列的分析，利用生物信息学工具，对水稻在基因组水平上的进化进行了大量研究。 1 水稻及其他禾本科植物基因组的古多倍体化过程 水稻是典型的二倍体植物，其核基因组中共有12条染色体。在水稻基因组被完整测序之前，人们就已经采用分子标记、DNA重复元件等方法探究水稻基因组的古多倍体化(polyploidization)过程，并发现了一些重复的染色体片段。随着水稻基因组测序计划的完成，越来越多的证据表明水稻基因组曾发生过全基因组复制(whole genome duplication)，即古多倍体化过程。 Golf等利用鸟枪法完成了粳稻品种日本晴全基因组的测序工作，并利用同义替换率分布方法(Ks- based age distribution)提出水稻基因组可能发生过一次全基因组复制过程。此后多家研究机构和一些研究者对水稻基因组中的重复片段进行了研究，虽然得出的结论不尽相同，但均发现水稻基因组中存在大量的重复片段。根据所采用方法和参数的不同，这些重复片段占整个水稻基因组的15％～62％。Yu 等在水稻基因组中发现了18对大的重复片段，大约占整个基因组的65．7％。其中17对重复片段形成的时间很相近，发生在禾本科物种分化之前；最近的一次片段复制事件发生在水稻11和12号染色体之间，在禾本科物种分化之后。 水稻基因组被测序之后，许多科研机构对基因组数据进行了详尽的注释。其中应用比较广泛的是美国基因组研究院(the institute for genome research，TIGR)和日本农业生物科学研究所(national in- stitute of agrobiological sciences，NIAS)的水稻基因组注释信息。TIGR根据其注释的结果和基因相似性矩阵(gene homology matrix，GHM)方法，检测到大量染色体间的重复片段，这些重复片段几乎覆盖了整个水稻基因组。TIGR水稻基因组注释数据库从第4版开始便增加了对片段重复的注释，该分析是利用DAGChainer程序进行的，重复片段采用100 kb和500 kb 2种参数模型进行了染色体片段的基因共线性分析(图1)，这是全基因组复制的有力证据。根据复制片段上同源基因的分子进化分析，估计全基因组复制发生在大约7 000万年前，在禾本科物种分化之前。此外，Zhang等利用TIGR更新的数据进行分析，采用同义替换率分布方法检测到另一次更古老的(单、双子叶植物分化前)基因组复制事件，说明水稻基因组至少经历了2次全基因组复制过程。 全基因组复制或多倍体化是植物尤其是禾本科作物物种形成和进化过程中非常重要的事件，大部分开花植物在进化过程中均经历了多倍体化过程。基因组加倍后，再经历所谓的二倍体化过程(diploidization)，进化成当代的二倍体物种，并造成大量重复片段中基因的重排和丢失。Salse等研究发现基因组复制事件对禾本科植物的物种形成和演变具有重要作用。他们认为禾本科植物的祖先物种是一个基因组内包含5条染色体的物种，在进化过程中，首先在距今5 000～7 000万年前经基因组复制产生了10条染色体；此后，在基因组内发生了2次染色体置换和融合而形成了12条中间态染色体。以这12条中间态染色体为基础，逐渐分化出水稻、小麦、玉米和高粱的基因组，其中水稻基因组保留了原有的12条中间态染色体，而小麦、玉米和高粱均又发生了染色体丢失和融合才形成了现有的基因组。水稻全基因组复制片段是至今为止在动、植物基因组中发现的最为清晰、完整的基因组复制的遗迹。水稻之所以保存这么完整，一方面是水稻基因组保持了12条中间态染色体的基本形态，另一方面可能与水稻基因组相对较稳定有关。 2水稻籼粳2个亚种的分化 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11 500多年的栽培历史中，因适应不同的农业生态环境而产生了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化。长期以来，基于形态性状、同工酶以及对一些化合物不同反应的研究，把亚洲栽培稻(Oryza sativa L．)分为籼稻(indica)和粳稻(japonica)2个亚种。其中籼亚种耐湿耐热，主要适应于热带和亚热带等低纬度地区，而粳亚种则耐寒耐弱光，适应于高纬度和高海拔地区种植。这2个亚种间不仅产生了生殖隔离的基因库，还在形态特征、农艺性状和生理生化反应等方面存在明显的差异。近期群体
干细胞研究进展与应用综述 摘要: 本综述通过举例，简要阐述了近年来干细胞研究进展以及干细胞的应用情况。 关键词：胚胎干细胞；成体干细胞；应用 前言： 干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透,干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究己成为生命科学中的热点。同时，干细胞的研究对人类的疾病的治疗等也有着其绝对的重要意义。 1干细胞的分类及其研究进展 干细胞（stem cell）是机体内存在的一类特殊细胞，具有自我更新及多向分化潜能。能根据来源的不同，干细胞可分为胚胎干（embryonic stem cell，ES）细胞、诱导性多潜能干（induced pluripotent stem cells，iPS）细胞及成体干（adult stem cell）细胞。不同种类的干细胞具有各自的优势和不足。胚胎干细胞是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外培养而筛选出的细胞，具有发育全能性，理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞。成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并特化形成该类型组织的多能细胞。 1.1ES 细胞胚胎干细胞是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，发育等级较高，可以分化为人体的所有体细胞，是全能干细胞。ES 细胞是目前研究最广泛、最成熟的干细胞体系。自2009 年起，全球共批准了3项人ES（hES）细胞的临床试验，标志着hES 细胞向临床应用迈出了重要的一步。然而，hES 细胞临床应用面临的一个瓶颈问题是免疫排斥反应。体细胞核移植（SCNT）技术能够制备携带患者基因型的hES 细胞，可解决免疫排斥的难题。2013 年，美国Mitalipov 研究团队将人类皮肤成纤维细胞核移植到供体去核卵细胞中，成功建立了SCNT 的hES 细胞[1]，标志着治疗性克隆又向前迈出关键性的一步。然而，hES 细胞建系必须摧毁人类早期胚胎，故存在剧烈的伦理学争议。此外，hES 细胞来源的分化细胞移植到体内存在发展为肿瘤的潜在风险。 1.2iPS 细胞2006 年Yamanaka 实验室利用Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 4 种因子将鼠成纤维细胞重编程为诱导多功能干细胞，标志着一种新型类胚胎干细胞的问世。PsCs 诱导的本质是使终末分化的细胞重新获得多能干细胞相似的调控网络和表观遗传学特征,迄今,已建立了大鼠[2, 3]、人[4, 5]、猪[6, 7]、猴[8]、兔[9]和绵羊[10]的iPSs细胞系,并证实具有ES细胞的发育全能性。采用体细胞重编程技术可从患者自体细胞获得的iPS 细胞，这不但可解决免疫排斥的难题，而且避免了hES 细胞和SCNT 研究存在的伦理学争论。近年来，采取非整合的病毒载体、mRNA 转染、小分子化合物化学诱导等方法均可将体细胞重编程为iPS 细胞[2,3]。这些技术的改进既可避免肿瘤形成和DNA与宿主整合的相关风险，又可降低iPS 细胞的制备成本，使得大规模制备自体干细胞成为可能。Yamanaka 带