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土壤微生物研究技术概论

博士□基地班硕士□

硕博连读研究生□兽医硕士专业学位□

学术型硕士□工程硕士专业学位□

农业推广硕士专业学位□全日制专业学位硕士

同等学力在职申请学位□中职教师攻读硕士学位□

高校教师攻读硕士学位□风景园林硕士专业学位□

西北农林科技大学

研究生课程考试试卷封面

（课程名称：资源微生物学）

学位课□选修课

研究生年级、姓名 2012 级孙富强

研究生学号 2012051516

所在学院（系、部）资源环境

专业学科环境工程

任课教师姓名颜霞（副教授）

考试日期

考试成绩

评卷教师签字处

土壤微生物研究技术概论

孙富强1

（1西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100）

摘要：本文简要介绍了近年来土壤微生物学的国际研究现状及发展趋势对近年来土壤微生物的研究动向进行了报道，对土壤微生物研究方法、微生物修复技术等内容作一综述，并对该研究领域进行了展望。

关键词：土壤微生物研究技术

土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，它在环境气候的形成、地球化学循环、地质演化和生物进化中扮演着重要的角色。在土壤生态系统中，微生物作为物质循环和能量流动的主要参与者起着不可忽视的作用。土壤微生物的多样性研究有助于人们更为深入地掌握土壤微生物的分布特征及其在整个土壤生态系统中的功能与作用，对深入开展土壤生态环境研究具有重要的意义。

土壤中微生物数量庞大，种类极其丰富。虽然微生物仅占土壤有机质总量的很小部分，但它是土壤中极为活跃的生物因子，是土壤中C、N、S、P等重要养分循环的动力，参与土壤有机质的分解、腐殖质的形成和转化以及土壤中有机污染物的降解和转化[1-2]。微生物群落在土壤中处在一个动态平衡过程中，影响土壤的理化因子都会干扰土壤微生物群落的平衡，从而影响土壤微生物的活性及其生态功能，进而影响土壤肥力、土壤环境质量及人类的健康。土壤微生物群落的多样性与土壤生态系统的稳定性密切相关，是陆地生态系统多样性的重要组成部分，丰富的土壤微生物多样性可以降低土传植物病害的发生，保持土壤微生物多样性的稳定，有利于土壤肥力的合理利用并将促进农业的增产[3]。目前，在生态学和环境科学等研究领域，关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中作用的研究已受到越来越多的重视。结合近年来国际上根际微生物的研究动向，对土壤微生物研究的最新进展和技术方法作一概要综述。

1 传统土壤微生物研究方法

微生物种类组成多样性研究方法主要包括微生物平板培养法、电镜方法、染色方法等。微生物平板培养方法是一种传统的试验方法。这种方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。但这种方法太过粗放，对微生物数量的估计一般主要针对三大类群:细菌、真菌、放线菌，有些其他的类群用特殊的培养基培养，但实验室的培养条件不可能同时满足不同类型的微生物对温度、通气状况以及pH值等条件的要求，因而采用某一特定条件就很难将不适应该条件的微生物培养出来，而且，许多微生物在环境变化过程中表现为一种“存活但不能培养”(Viable butnonculturable，VBNC)的状态。有报道称，室内可培养的微生物仅为土壤微生物数量的1%-10%，因而，利用平板培养法不可能全面地获得土壤中所有的或者绝大多数微生物的全部信息[4-5]，并且获得的信息为微生物菌落总数，要想了解细菌类型还需从琼脂平板上将菌落分离出来，并对分离菌进行鉴定，据此得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构。由于平板培养方法还需要使用包括分子生物学手段在内的分析技术才能完成对微生物种的鉴定，分析工作繁琐、工作量大，得到的结果受培养条件等因素影响，误差较大，因此现在很少被采用。后来人们运用染色法在显微镜下观察计数，可得到更多的微生物数量信息，Faegri等用荧光显微镜技术检出的细菌数比用培养基培养得到的细菌数提高100-1000倍[6]。但总的来说，这些传统的方法得到的信息有限，需要结合现代生物技术来更详细地了解土壤微生物状况。

2 磷脂脂肪酸(PLEA)分析法的应用

PLFA分析法是微生物群落结构多样性的主要研究方法，是根据细胞膜磷脂酸的种类和数量来判定微生物多样性的方法。磷脂是生物活细胞重要的膜组分，在真核生物和细菌的膜中磷脂分别占约50%和98%。PLFA是磷脂的构成成分，它具有结构多样性和生物特异性，土壤中PLFA的存在及其丰度可揭示特定生物或生物种群的存在及其丰度。磷脂在细胞死亡后快速降解(厌氧条件下约需2d，好氧条件下需12-16d)，可用以表征微生物群落中“存活”的那部分群体。总之，通过对PLFA的定量测定可了解微生物活细胞生物量，并可根据PLFA 的种类了解土壤微生物群落结构多样性。PLFA方法已经广泛应用于土壤微生物多样性研究，用于揭示植被、作物栽培及土地管理方式、有机污染物、重金属、季节变化、气候条件等诸多因素对土壤微生物群落结构和生物量的影响[7]。但在石油污染土壤中利用PLFA法来分析微生物多样性的，国内未见报道，国外报道也较少。Shi等报道了铅、铬和石油烃复合污染情况下的PLFA法微生物多样性分析，指出微生物多样性和石油烃污染程度显著相关，而与重金属铅、铬污染相关性较小，说明土壤微生物多样性主要受到了石油烃污染的影响[8]。

3 BIOLOG微平板法的应用

BIOLOG微平板法是测定土壤微生物对95种不同C源的利用能力及其代谢差异，进而用以表征土壤微生物代谢功能多样性或结构多样性的一种方法。BIOLOGGN微平板的每个孔中含有一种不同的碳源(共95种)、其他营养物和四氮唑染料。接种微生物悬浮于微滴定板孔后，将滴定板保温合适的时间，定期监测底物的氧化还原作用，而孔中一旦有电子转移，四氮唑染料会变为紫色，同时也表明碳源被接种到其中的微生物所利用。BIOLOG板最初就是根据其中具体类型的代谢指纹来鉴定已分离纯化的微生物物种。1991年，Garland等首次用BIOLOG微平板来描述环境微生物的功能多样性[9]。其理论依据是: BIOLOG代谢多样性类型的变化与群落组成的变化相关，根据BIOLOG颜色反应数据组合模式，利用主成分分析和聚类分析方法可以获得土壤微生物群落结构和代谢功能方面的信息。当然，利用BIOLOG分析也存在一定的不足，如BIOLOG微平板法只能反映土壤中快速生长型或富营养微生物类群的活性，而不能反映土壤中生长缓慢的微生物信息，包括BIOLOG方法在内的微生物培养方法测定的土壤微生物种类数量不到16 SrRNA方法测定的微生物数量的1%[10]，大大低估了土壤中微生物的实际情况等，但由于其操作快速简便，还是得到了广泛的应用。

4 变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术的应用

遗传多样性可认为是遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布，反映微生物群落中总的遗传潜力。其中PCR-DGGE分子生物技术是目前可以探知最为完整的环境微生物菌群结构的分子生物学技术。1993年，Muyzer等首次将PCR-DGGE引入分子微生物生态学研究领域以来，PCR-DGGE在许多微生物实验室被用作分子工具来比较土壤微生物种群的多样性并进行种群动态监测[11]。其基本步骤是提取土壤的总DNA，然后用通用引物或选择性高的引物对土壤微生物总DNA进行PCR(polymerase chains reaction)扩增，通过变性梯度凝胶电泳(DGGE，Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)进行分离，收集不同条带的DNA进行测序，再同基因文库中的现有序列比较，可确定微生物的种类，阐明微生物的分子遗传多样性。但Muyzer等同时指出，DGGE法只能对微生物群落中数量大于1%的优势种群进行分析[11]。此外，待测样品的预处理过程也是DGGE技术能否发挥效能的关键步骤，如DNA 提取的过程以及PCR扩增过程是试验误差的主要来源。基于DNA指纹技术的分子生物学手段还有很多，如限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、末端限制性片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphi-

sm，T-RFLP)、单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)等逐步被收入到土壤微生物学研究中，现代分子生物学技术已经将土壤微生物领域研究带入一个革命性的新时代[12]。

5 结语与展望

土壤微生物多样性在陆生生态系统中具有重要作用，人们对土壤微生物多样性的研究已有多年历史，并且取得了许多有价值的成果。用于测定土壤微生物多样性的方法有很多，从最传统的微生物平板培养技术到PLFA法、BIOLOG微平板法以及最新的现代分子生物学技术PCR-DGGE都得到了广泛的应用，但每种方法都会受到各种条件的限制，存在不同的优缺点，任何一种方法所得的数据都是其他方法的补充，也就是说所有的数据结合起来才能完全描绘土壤微生态特征。因此，为了获取较为全面的微生物多样性信息，在条件许可的情况下，尽可能将其中的几种方法结合起来。由于目前得到的信息有限，因此，将传统的技术与不断完善的现代分子生物学技术结合，探讨土壤微生物的多样性，对于了解土壤生物降解过程中起重要作用的微生物菌群以及理解、评价和进行土壤污染的原位生物修复具有重要意义。

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导学案(教师版)探究土壤微生物的分解作用

班级小组姓名评价等级沅江三中四环八步教学模式生物模块三导学案第1页（共6页）探究土壤微生物的分解作用(教师版) 【学习目标】 1.设计和进行对照实验，尝试探究土壤微生物的分解作用，进一步培养探究和创造能力。 2.分析土壤微生物分解淀粉的情况。 3.学会检测淀粉和还原糖的方法，并根据现象作出合理判断和解释。案例1: 探究土壤微生物对落叶的作用一、提出问题: 秋天，落叶纷飞。春天，绿草如茵。且不见落叶痕迹！落叶去哪里了？结合上面的实例，你能提出什么问题呢？请写下来。落叶在土壤中能被分解掉,这究竟主要是土壤的物理化学因素的作用,还是土壤中微生物的作用呢？注意: （1）要选择有研究意义的问题作为课题来研究（2）要选择我们能力范围之内的问题作为实验研究课题。二、作出假设: 落叶是在土壤微生物的作用下腐烂的提示:假设既可以是基于已有的知识或经验作出的解释,也可以是想像或猜测。三、设计实验 1、设计方案（1）实验原理: 微生物能分泌多种水解酶将大分子有机物分解成小分子有机物，如纤维素酶、淀粉酶可将纤维素、淀粉水解成葡萄糖。然后被分解者吸收到细胞中进行氧化分解，最终形成CO2、水和各种无机盐，同时释放能量。（2）、实验材料: 土壤、落叶、（3）、实验器具: 玻璃容器、标签、塑料d 袋、恒温箱、纱布。（4）、实验设计步骤: ①取两个圆柱形的玻璃容器,一个贴上“甲组”标签,另一个贴上“乙组”标签。 ②将准备好的土壤分别放入两个玻璃容器中,将其中乙组放入恒温箱, 60℃灭菌1h 。 ③取大小、形态相同的落叶12片,分成2份,分别用包好,埋入2个容器中,深度约5cm 。 ④将2 个容器放于实验室相同的环境中, 一段时间后,取纱布包。 ⑤观察比较对照组与实验组落叶的腐烂程度。提示: （1）要确定实验变量是什么需要控制的变量有哪些如何控制这些变量；（2）要注意实验步骤的先后顺序。（3）要注意写出具体的实验步骤以便指导实验的进行。

污染土壤微生物修复技术研究进展

污染土壤微生物修复技术研究进展课程论文摘要针对2014年4月环境环保部公布的首次全国土壤污染状况调查结果，撰写我国最严重的耕地污染中主要污染物镉、砷、滴滴涕和多环芳烃的微生物修复研究进展。关键词土壤污染；微生物修复；重金属污染；有机物污染 2005年4月至2013年12月我国开展的首次全国土壤污染状况调查结果显示全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出。全国土壤总的超标率为16.1%，其中轻微、轻度、中度和重度污染点位比例分别为11.2%、2.3%、1.5%和1.1%。人类赖以生存的耕地中土壤点位超标率高达19.4%，迫在眉睫的主要污染物为镉、砷、滴滴涕和多环芳烃[1]。微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术，它已成为污染土壤生物修复技术的重要组成部分和生力军[2]。由于我国土壤调查结果显示在农田耕地中重金属污染物镉、镍、砷、有机污染物滴滴涕和多环芳烃超标最严重，对这些污染物的治理已经迫在眉睫。所以，本文重点阐述针对这5种污染物的微生物修复技术研究进展。 1、重金属污染土壤微生物修复研究进展土壤微生物种类繁多、数量庞大，是土壤的活性有机胶体，比表面大、带电荷和代谢活动旺盛，在重金属污染物的土壤生物地球化学循环过程中起到了积极作用。微生物可以对土壤中重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的[3]。因此，重金属污染土壤的微生物修复原理主要包括生物富集 (如生物积累、吸附作用)、生物转化(如生物氧化还原、甲基化与去甲基化以及重金属的溶解和有机络合配位降解)、生物固定（如与S2-的共沉淀）、生物滤除（如细菌的淋滤作用）等作用方式。 1.1镉污染将具有重金属吸附能力的天然蛋白或人工合成肽展示在微生物细胞表面,可以提高微生物对重金属的吸附能力。Kuro da等[4]改造了微生物表面蛋白使得当酵母金属硫蛋白( YMT )串联体在酵母表面展示表达后,4 聚体对重金属吸附能力提高5.9 倍, 8 聚

微生物育种技术研究进展

微生物育种技术研究进展摘要：生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。但是有时候微生物育种也不是单一的一种方法，有的是需要多种方法综合使用。本文将各种微生物育种技术进行总结和细致分析。关键词：微生物育种；诱变育种；基因重组育种；基因工程育种 1.常规育种常规育种是以不经过人工处理，利用微生物自发突变为基础，从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方法一般情况下，由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，发生自然突变的几率特别低，一般为106～1010/BP，而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制，所以常规育种时间较长，工作量较大。，通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。因此在生产实践中，常规育种的主要目的是用来纯化、复壮、稳定菌种。 2. 诱变育种 1927年MILLER发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后人们发现其他一些因素也能诱导基因突变，并逐渐弄清了一些诱变因素的机理，为微生物诱变育种提供了前提条件根据育种需要，有目的地使用诱变因素，可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状.凡能诱发基因突变，并且突变频率远远超过自发突变的物理因子或化学物质被称为诱变剂。根据诱变剂的不同可以将诱变育种的方法分为：有物理因子诱变育种和化学因子诱变育种。，前者包括激光、X-射线、"r-射线、快中子等)后者主要是烷化剂（包括EMS、EI、NMU、DES、MNNG、NTG等），天然碱基类似物，亚硝酸和氯化锂在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性,化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎.目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂，以达到预期的育种效果. 2.1物理因子诱变 2.1.1 UV 所有传统的物理诱变手段中，使用得最为普遍的就是紫外线辐照，它是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。对于紫外线的的作用有很多解释，但研究最清楚的是它可引起DNA结构的变化，尤其是可使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体的出现会减弱氢键的作用，引起双键结构变形，就可能影响胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的正常配对，破坏了腺嘌呤的正常掺人，复制就在这一点上突然停止或错误地进行。如果错误地进行复制，且在新形成的链上有一个改变了的碱基次序，则在随后的复制过程中，碱基次序已改变的DNA链照常进行复制，产生了一个在两条链上碱基次序都是错误的分子而引起突变归J。利用紫外诱变的方法可选育出大量产量高，活性强的菌种，由于其设备简单，诱变效率高，操作安全而被广泛应用。白兰芳等用紫外线单因子处理、光复活处理西罗莫司产生菌Streptomyces hygro—scopicus得到了一正变株UV-8-61，效价比出发菌株提高了2—3倍。近些年来紫外线作为一种基本的诱变因子，也常常和其他一些诱变因子联合作用于微生物而提高诱变效果。胡永兰等用UV和DES(硫酸二乙酯)复合处理梧宁霉素产生菌，得到一株较高的突变株，效价比出发菌株提

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。一、基本原理熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。二、试剂配制（1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。（2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶解。（3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g，用蒸馏水溶解并定溶至1L。

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用(新编版)

( 安全论文 ) 单位：_________________________ 姓名：_________________________ 日期：_________________________ 精品文档 / Word文档 / 文字可改微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用(新编版) Safety is inseparable from production and efficiency. Only when safety is good can we ensure better production. Pay attention to safety at all times.

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 (新编版) 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。关键词：城市生活垃圾微生物强化微生物处理技术基因工程随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的环境污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipalsolidwaste,简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitarylandfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)

三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 1.城市生活垃圾生物处理中主要的微生物 MSW生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。 1.1城市生活垃圾好氧生物处理中的微生物 1.1.1细菌在MSW好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在

土壤修复技术及优缺点

土壤修复技术及优缺点 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

土壤是植物生长繁育的自然基地，是农业的基本生产资料，是人类赖以生存的极其重要的自然资源。随着工业、城市污染的加剧和农用化学物质种类、数量的增加，土壤重金属污染日益严重。土壤重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性的特点。土壤中有害重金属积累到一定程度，不仅会导致土壤退化，农作物产量和品质下降，而且还可以通过径流、淋失作用污染地表水和地下水，恶化水文环境，并可能直接毒害植物或通过食物链途径危害人体健康。不同污染类型的土壤污染，其具体治理措施不完全相同，目前，重金属土壤的修复技术主要有工程措施，物理化学方法，植物修复方法以及微生物修复方法。工程措施主要包括客土、换土和深耕翻土等措施。通过客土、换土和深耕翻土与污土混合，可以降低土壤中重金属的含量，减少重金属对土壤-植物系统产生的毒害，从而使农产品达到食品卫生标准。深耕翻土用于轻度污染的土壤，而客土和换土则是用于重污染区的常见方法，在这方面日本取得了成功的经验。工程措施是比较经典的土壤重金属污染治理措施，它具有彻底、稳定的优点，但实施工程量大、投资费用高，破坏土体结构，引起土壤肥力下降，并且还要对换出的污土进行堆放或处理。物理化学方法是当前重金属污染土壤修复研究的热点，也是最为成熟工程上应用最为广泛的修复技术，主要包括固化/稳定化技术，土壤淋洗技术，电动修复技术和电热修复技术等。固化/稳定化技术是通过固态形式在物理上隔离污染物或者将污染物转化成化学性质不活泼的形态，从而降低污染物质的毒害程度。如通过施加水泥等固化土壤重金属的固化修复技术，或向土壤投入无机或有机改良剂，改变土壤的

微生物研究技术与方法重点大全要点

第一章绪论课程主要内容： 1、微生物学研究技术发展 2、微生物材料的准备 3、微生物研究中的物理化学方法基础 4、微生物的观察与微生物分析法 5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离 6、微生物育种技术 7、固相化技术与生物传感器 8、免疫学技术 9、微生物学研究的分子生物学技术微生物学研究技术发展：微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括： 1、显微镜术和制片染色技术 2、消毒灭菌技术和无菌操作技术 3、纯种分离和克隆化技术 4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术 5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术 6、菌种保藏技术 7、原生质体制备和融合技术 8、各种DNA重组技术等第二章微生物材料的准备第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作掌握知识要点：原理、方法、生物活性物质的除菌无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存一、几个基本概念控制害菌的措施： 1）杀灭法： ○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物 ○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌 2）抑制法： ○1防腐：抑制霉腐微生物 ○2化疗：抑制宿主体内的病原菌 1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。 2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：

常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法 1）巴氏消毒法（pasteurization） 2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。 3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。防腐的方法： ①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等。 ②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。 ③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常见的防止霉腐的方法；在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。 ④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的方法。 ⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。 ⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄泥螺等产品，都是特色风味食品。 ⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如：用苯甲酸来使酱油防腐；用尼泊金作墨汁防腐剂；用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂；用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。 4、化疗——化学治疗利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。要点： 1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。 2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。 3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。（4）结果计算

微生物修复技术与环境的关系

微生物与生态环境的关系 ——生物修复技术与生态环境田文涛化工与制药专业理工1005班学号100150135 指导教师刘雪玲摘要微生物是自然生态链中重要的一环，是必不可少的，它们对化学元素在自然界中循环、高分子物的合成与降解、甚至对无机物质形成、能量物质的储存、细胞基因储存复制及未知的方面等具有重要贡献。它的作用是呈两方面的：有益于人类的和病原的。微生物与人类的生活密切相关，在生态环境中发挥着重要的作用。生物修复技术已成功应用对于修复污染环境，并取得很好的成果。本文介绍了生物修复技术，着重叙述了微生物修复技术极其应用，从而说明了微生物在生态环境中的重要性和相关研究进展。关键词：微生物生物修复技术生态环境保护

前言生物修复( bioremediation) 技术是指利用特定的生物吸收、转化、清除或降解环境污染物, 从而修复被污染环境或消除环境中污染物, 实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。它是一类低耗能、高效和环境安全的环境生物技术。它主要是利用土著微生物的代谢能力、活化土著微生物降解能力或者添加具有高速分解难降解化合物能力的特定微生物, 针对不同的污染环境, 可利用不同的修复微生物及改善其生长条件。生物修复技术又包括动物修复、植物修复、微生物修复等技术，其中犹以微生物修复重要。本文主要叙述了微生物修复技术的定义与应用，从而介绍了微生物对污染环境修复中的研究进展。持久有机污染物主要有有机磷农药、芳香族类化合物、卤代有机化合物等，它们在大气、水环境、土壤中广泛存在，对人类产生了巨大威胁。这些环境有机污染物通常被认为是环境外来化合物,一般天然微生物由于缺乏与之降解相适应的完整酶系统,所以表现出难以生物降解。但是在长期的接触驯化过程中,微生物的遗传变异和质粒传递特性,使很多微生物具有了降解或部分降解的能力。下面讨论一下人们所关注的有机磷农药的微生物降解。据研究，假单胞菌及黄杆菌等均能产生一种高水平组合型表达的膜结合性有机磷水解酶,该酶对多种对硫磷结构的化合物都有降解活性,其pH、温度的范围广,稳定性强,底物范围广泛,可裂解包括P - O, P - F, P - CN, P - S等化学键。自可以从上两种微生物中将有机磷水解酶提纯起,人们尝试了借助固定化方法进行有机磷水解酶的应用,载体先是选用三苯甲基琼脂糖,依赖疏水作用将酶分子固定其上,而降解反应体系中补充的为增大农药溶解度的有机溶剂会引起酶与载体的解吸效应。为此将载体改用为聚酰胺纤维,采用共价结合法获得了良好的固定效果。因微生物生长周期较长,酶纯化效率又低、成本高,无法广泛地应用于生产。人们便将更多的目光集中在大肠杆菌宿主的表达系统上,使用强启动子lac实现有机磷水解酶大肠杆菌细胞表面高水平的表达,然后固定化细胞,发展成为生物反应器。土壤受到重金属污染后, 可能导致重金属在农作物体内积累, 造成食物链

含油土壤微生物修复技术

含油土壤微生物修复技术一、国内外研究动态 1.1技术背景石油是原油和石油制品的总称。原油是积累的有机物质经过地质变迁而形成的，主要由链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量硫化物、氮化物、环烷酸类等非烃化合物组成的复杂混合物，其中烃类占所有组分的95~99.5%，其化学组成、颜色和物理性状等随产地的不同而略有不同.【1】石油是现代社会的最主要能源之一，石油工业在国民经济中占有十分重要的地位，也是国家综合国力的重要组成部分，因此世界各国十分重视石油工业的发展。【2】在石油行业，土壤污染主要来源于油气生产、加工过程中产生的落地原油及含油污泥、钻井废泥浆以及含油污水处理产生的废渣等三部分。【3】石油进入土壤后,会破坏土壤结构，影响土壤的通透性，降低土壤质量；油污粘着在植物根系上，形成一层粘膜，阻碍植物根系对养分和水分的吸收，引起根系腐烂，影响农作物生长；石油富含的化学基团能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用,从而使土壤有效氮、磷的含量减少，影响作物的营养吸收；【4】石油中的多环芳烃具有致癌、致畸、致突变等作用【5】。石油烃中不易被土壤吸附的部分能渗入地下污染地下水。 1.2含油土壤的处理方法为了消除土壤中的石油污染，各国的研究人员进行了广泛的研究。处理含油土壤的物理和化学方法主要有焚烧法、固化法、热脱附法、溶剂萃取法、洗涤法等，这些方法存在价格较高、破坏土壤结构和组分、造成二次污染等问题，限制了应用范围。【6】生物修复因其具有成本低、效率高、无二次污染、易操作等优点，被认为是有机污染物修复技术中最有效、最可行和最可靠的方法，越来越引起人们的关注。Hung-Soo Joo等人发现粉末状Candida catenulata 在23%食物残渣和77%柴油污染的土壤（2%柴油）培养13天后，84%最初的石油烃被降解，相比较没有接种的只有48%的降解率。【19】研究表明固定化细胞相比自由细胞有着很高的热稳定性，并且底物浓度明显的影响着降解的能力。【21】 3石油的微生物降解 .3.1微生物降解石油污染物的优势动物、植物、微生物都具有降解污染物的能力，但微生物在污染物降解中的作用最大。这是因为微生物具有种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异的特点。 3.2环境中降解石油的微生物能降解石油烃的微生物非常多，有100余属，200多个各种(顾传辉等，2001)。一般认为，细菌分解原油比真菌、放线菌容易的多，更能有效地降解原油。降解

6学技术及其在环境微生物研究中的应用

分子生态学技术及其在环境微生物研究中的应用张于光!，李迪强!!，肖启明" （!#中国林业科学院森林生态环境与保护研究所，北京!$$$%!；"#湖南农业大学生物安全科技学院，湖南长沙&!$!"’）摘要分子生态学作为一门新兴的学科已经成为国内外科学家关注和研究的热点。目前的分子生态学技术主要有核酸杂交分析技术、特异性()*扩增技术、+,-序列分析、基因芯片技术等。这些技术在环境微生物研究中的应用主要包括对微生物多样性的研究、种群结构和动力学的研究、代谢活性的研究以及在全球气候变化中对微生物影响的研究。最后，对环境微生物的分子生态学研究进行了展望。关键词分子生态学；环境微生物；基因芯片；全球气候变化中图分类号.%/%#%文献标识码-文章编号!$$012$"!（"$$0）$01$$’21$& !"#$%&#’()%"#"*+,$%-."#"*+’./012344#5%’15".5. ).65(".7$.1’#!5%("85"#"*+91&/+ 34-,567897:;9!，<=+>8?>:;9!，@=-A.>8B>;9" （!!"#$%&’(&)*$%+,&-!+#./)&#!0)&%*,%!12/#*$*3,45!&’(&)*$%)6，7*/8/#9!$$$%!； "!1&--!&’0-4#%0)&%*,%!:;#4#39)/,!<#/.!124#9$24&!$!"’） 3821(’%1-C:D7E9F G;>;9C7D H F I J，B G K F I7K:E F I G K G9L M:C D F I G B F:M G J E F C F:E I M C N G J J M:J O E F P P G E K O P>O F C I>F;8 J>C J C’:J J F;J>G;#-J N E F C F;J，B G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L B:>;K L>C;7I K F>I:I>O M L D E>O>Q>;9O F J F I J>G;，()*:B N K>R>8 I:J>G;，+,-C F?7F;I F:;:K L C>C，9F;F I M>N，:;O G J M F E J F I M;G K G9L#S M F L:E F7C F O>;B>I E G D>G K G9L C J7O L B:>;K L>;B>8 I E G D>:K O>T F E C>J L，I G B B7;>J L C J E7I J7E F:;O O L;:B>I C，B F J:D G K>I:I J>T>J L，:;O J M F>B N:I J G R9K G D:K I K>B:J F I M:;9F C J G B>I E G G E9:;>C B C#S M F N E G C N F I J G RB G K F I7K:E F I G K G9L J F I M;G K G9L C J7O L P:C:K C G O>C I7C C F O# :$+;"(/2B G K F I7K:E F I G K G9L；F;T>E G;B F;J:K B>I E G D F；9F;F I M>N；9K G D:K I K>B:J F I M:;9F 分子生物学及其技术的发展和变革为生态学的研究开辟了新途径，分子生物学与生态学的交叉领域，越来越引起人们的重视，分子生态学便应运而生，微生物分子生态学是其中的重要分支。应用分子生态学技术，研究者不必培养微生物，而可以直接对环境微生物进行分析来达到目的。分子生态学技术在环境微生物研究中的应用始于"$世纪’$年代中期，近年来在土壤、环境、海底沉积物、动物肠道等微生物生态系统的研究中得到了快速的发展，已经成为最富有活力的生态学科前沿领域之一。 <环境微生物+,-的获得从自然环境中直接分离微生物核酸，对不能培养的微生物的检测、对决定选择微生物或自然条件下重组基因的命运、对揭示基因型的多态性和在微生态中的变化都是很重要的［!］。目前从环境样品中提取+,-的方法主要有"种。首先是细胞提取法。最初的报道是从土壤中提取细菌+,-，这种方法包括用不同的离心速度从土壤颗粒中分离细菌，然后溶解提取的细胞提取+,-，最后纯化+,-。4G K D F;等以该方法为基础提取的+,-纯度足够可以对土壤细菌群落特定基因型进行探针检测，以及对提取+,-进行U G7J M F E;分析和限制性酶分析［"］。第"种方法是直接溶解法。该方法是由提取沉积物+,-发展而来［/］。直接溶解后在缓冲液中用碱提取+,-，用乙醇沉淀、)C)K浓度梯度离心等纯化提取的+,-。环境样品中提取+,-总是同时提取了腐殖物质的+,-，因而干扰了+,-的检测和收稿日期："$$&1$/1"$ 作者简介：张于光男，博士。现主要从事环境微生物分子生态学研究。项目来源：国家“十五”科技攻关项目（"$$!V-0!$V!$）；林业局重点项目“自然保护区社会经济生态价值研究” !通讯作者 2’ 微生物学杂志"$$0年%月第"0卷第0期W A X*,-