细菌内毒素定量检测的临床意义
1.细菌内毒素的本质
细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物，如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖（Lipoplydscharide, LPS）成分，它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。
2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现
微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应，严重时可导致弥漫性血管内凝血（DIC）及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS)，当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高，而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高，但局部有限的细菌感染，轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克，全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS)，无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者，而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。
3.细菌内毒素水平检测在临床上使用
体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数，通过内毒素水平的定量快速检测可以预示： (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义
体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒素水平不仅是用于鉴别诊断的急性指标，而且是监控炎症活动的参数，内毒素水平的检测应是一系列的。其主要意义表现为：
(1)细菌性炎性疾病的鉴别诊断：在不明原因的炎性疾病中，内毒素水平升高表
明由细菌(尤其是革蓝氏阴性菌)引起的可能，在非细菌性疾病中，相对于临床的严重程度，内毒素水平浓度是低的，在疾病的进一步发展中内毒素水平浓度的升高可能是细菌重复感染或脓毒症，而在严重的病毒性疾病中，内毒素水平也不会升高。
(2)监控具有感染危险的患者：可以通过内毒素水平监控对有感染危险的重症患
者监护，包括大手术后患者及器官移植，免疫抑制等患者，由于内毒素只是在全身细菌性感染(尤其是革蓝氏阴性菌)或脓毒症时释放，所以内毒素水平在监控严重感染时是比CRP(C反应蛋白)、PCT（血小板积压）、 IL-6（白细胞介素6）、体温、白细胞计数、红细胞沉降率更好的工具。
(3)病程监控和预后：在严重的细菌性感染疾病中如脓毒症或MODS，内毒素水
平升高的程度是炎症活动的反映，如果炎性刺激不再存在，如在有成效的感染治疗后，内毒素水平可在几天内恢复到正常参考范围内，可作为一种预后的良好迹象，而对于脓毒症或MODS患者，内毒素水平持续很长一段时间维持在不正常区间或持续升高，此时往往提示持续的炎症性感染，同时也是预后不良的反映指标。
5.内毒素连续检测对治疗效果的判定使用
内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此，内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，内毒素的定量检测，使得内毒素成为指导临床治疗、判断疗效和筛选恰当药物的非常实用的指标。
内毒素血症的临床检测研究
内毒素血症
内毒素血症是由于血中细胞或病灶内毒素释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。内毒素血症分为内源性和外源性两大类。在严重创伤、感染等应激状态下，可出现如下变化，导致内毒素血症的发生：1．全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力；2．胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血； 3．肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环； 4．某些组织、器官
的感染引起外源性内毒素入血。
内毒素血症临床症状不一，主要决定了宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克等。内毒素可引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等的释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足，缺氧及酸中毒等。内毒素血症可以出现多系统的多种疾病中，通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭，弥漫性血管内凝血等，病死率极高，因此，内毒素血症必须引起临床医生的高度关注。
目前使用鲎试验阳性对内毒素血症进行确诊，以鲎试验浊度法或采用基质显色法血浆内毒素浓度大于10pg/ml 为定量标准，并证实它对革兰氏阴性菌败血症的判断优于血培养。使用该法探讨不同类疾病内毒素血症发生率，结果为急性肝炎37%-64% 。爆发性肝炎为58%-100% ，且腹水和无腹水有明显差异。胆石症伴或不伴感染均有不同程度内毒素血症临床表现，在急性梗阻性化脓性感染时，内毒素血症发病率最高（85%）。在烧伤病例中发现，血内毒素阳性病死率为80% ，而阴性仅21% ，且内毒素血症病员低血压和病死率是革兰氏阳性菌血症的2倍。Nachum等使用尿液稀释凝胶法研究了1286例尿路感染病例发现，鲎试验法区分显著性和非显著性菌尿症的能力为93% ，国内报道尿路感染时，尿液内毒素浓度大于5ng/ml为84% ，而非感染者仅2.3% 。采用抗菌药物治疗感染疾病时，由于内毒素释放，也可发生内毒素血症，并把某些个体或病症如新生儿、中暑、临产妇女等可使血浆内毒素试验阳性，称之为生理性或间接型内毒素血症。虽然目前尚无足够资料说明血内毒素浓度和病情及预后的确切关系，但众多危急病症的死亡如肝肾综合症，多器官功能衰竭、感染性休克等和严重的内毒素血症密切相关。寻找能拮抗内毒素或使之灭活的药物和治疗措施已成为当务之急。
内毒素血症---发热病人败血症的早期预测革兰氏阴性菌败血症是住院病人死亡的重要原因。确切诊断要根据血培养结果，需花费几天时间。实验证明，无论是人和动物，革兰氏阴性菌败血症所许多症状是由内毒素血症造成的。内毒素可以激活单核巨什细胞系统，通过白血病介素－1、白血病介素－6、白血病介素－8、肿瘤坏死因子等产生一系列毒性反应。内毒素是革兰氏阴性菌败血症的主要致病因素。用鲎实验法测定病人血中内毒
素，可以预测发烧病人败血症发生率。
Sander等人对473例发烧病人血中内毒素进行了研究，其中发生败血症病人在3天追踪观察期间有6人（32％）死亡，而454个无败血症病人只死亡26（6％）。研究表明，血中内毒素浓度测定是预测败血症的极佳指标，此方法快速、简便，对指导临床用药具有重要意义。
过去的临床工作中，找不到一个可靠的指标准确地预测病人将要发生败血症。Sander等人的研究表明，鲎试验法检测结果预测败血症的敏感性为79％，特异性为96％。从全体发烧病人有4％会发展为败血症来计算，鲎试验的阳性预测值为48％，阴性预测值为99％。凡是内毒素试验结果为阴性的病人基本上排除3日内发生败血症的可能，而内毒素阳性的发烧病人则有发生败血症的高度危险性。
过去认为，菌血症就等于败血症，而败血症血培养的预测值仅为15％，因此用鲎试验检测内毒素的方法对发烧病人是否发展成败血症的预测是一个非常有用的方法。
内毒素血症－免疫低下儿童发热的一个重要原因免疫低下儿童出现原因不明的发热是很普遍的事情，在诊断和治疗上一直曾在着许多问题，能作出正常诊断的只占病例的40％～60％，因此，临床医生往往不得不根据经验使用抗生素治疗，其疗效不甚理想。
Aad Hess 等人对36例免疫低下儿童进行了研究。在发烧期间，利用鲎试剂多次检验了病人血中内毒素的浓度，其中11例的病人（35.5％）的血中内毒素含量 > 10pg/ml（内毒素血症的诊断标准），其中一例检测数值位于23～64pg/ml 之间。25例内毒素< 10pg/ml的病人没有一例血培养阳性，没有一例死亡。在11例内毒素高的病人有5例死亡（45.5%）,而活下来的人，随着血中内毒素含量的下降，逐渐好转至痊愈。
Aad等人的研究表明，免疫机能低下儿童发烧时，如果找不到细菌感染迹象或菌血症候，内毒素血症可能是引起发烧的原因之一。这和Harris等人对免疫低下成人的研究报告相一致。在有些儿童中，尽管同时感染了革兰氏阳性细菌或霉菌，内毒素血症仍可能是造成发烧的主要原因。
烧伤内毒素血症
烧伤可由热水、蒸气、火焰、电流、激光、放射线、酸、碱、磷等各种因子引起、烧伤除了高温直接造成局部组织细胞损伤外，整个机体会产生一系列的改变。处于应激状态可能释放出各种生物物质而引起烧伤的局部炎症和全身反应。
除此以外，应激还可以肠粘膜屏障功能及免疫功能受损，大量内毒素通过肠粘膜释放入血，血中高浓度内毒素，又刺激单核巨噬细胞产生多种炎性介质，如肿瘤坏死因子、白细胞介质-1、白细胞介质-8和白细胞介质-6等，进一步加重机体的病理反应，使临床症状更加严重。
动物试验及临床均表明，烧伤早期即出现内毒素血症。尽管现代医学技术和重症监护水平的在不断提高，但是烧伤后多器官功能衰竭的死亡率仍居高不下，成为进一步提高烧伤救治成功率的一大障碍，而内毒素是诱发多器官功能衰竭的重要因素。因此，早期控制烧伤内毒素血症在减少并发症即死亡率反面是至关重要的。
动物实验模型显示，烧伤后门静脉血浆内毒素于伤后3-6小时即显著升高，7-12小时达高峰，24小时后有所下降，但仍居较高水平。同时，烧伤后肝静脉血清肝功能指标ALT、LDH亦和3－6小时升高，12小时达高峰，且数值大于正常值的2倍以上，伤后24小时下降，且仍显著高于对照组。以上结果提示早期肝脏损害和肠源性内毒素有非常密切的关系，肠源性内毒素可能是导致烧伤早期肝损害的主要因素之一。Winchnrch等人对一组39例不同烧伤面积的病人，在伤后5天内连续进行血浆内毒素，结果表明，血循环中内毒素的平均含量和烧伤面积相关；伤后3～4天有一峰值。他们又对另外29例烧伤面积20％～75％的病人，进行伤后两周内定期抽血检查，内毒素阳性者17例（占58.6％）。结果提示烧伤内毒素血症比较常见，而且内毒素血症和革兰氏阴性杆菌菌血症或创面脓毒症的相关率为71%。
在烧伤的合并症中，如休克、脓毒症、肝损害，尤其是革兰氏阴性杆菌败血症的发生、发展中，如前所述，在某种程度上，内毒素起着“拨机”的作用，因此烧伤早期控制内毒素血症有着十分重要的意义。这一点已经引起了临床医师的高度重视。
内毒素和肝脏疾病
肝脏是阻止肠道内毒素进入大循环的有效屏障，一旦肝脏功能障碍、肝脏受
损后，对内毒素解毒能力大为减弱，内毒素进入血循环并经直接及间接作用引起肝外组织的损伤。
⑴肝炎：
许世清等人研究表明，肝炎病人也常并发内毒素血症。甲肝的内毒素血症发生率为58%，平均内毒素浓度为54.71pg/ml。在肝发病后第1、3、5周检测血浆内毒素，内毒素血症发生率分别为79%、37.8%、17.1%，平均值为65.5pg/ml、37.7pg/ml、26.8pg/ml。到第五周时几乎均恢复正常。其发病率和内毒素水平均随着病程的延长而下降，两者和病程均有非常显著的意义（p<0.01）。乙肝的内毒素血症发生率和病理类型有关。有文献报导急性病毒性乙肝内毒素血症发病率占51.9%，随着病情的缓解内毒素水平逐渐下降。慢性活动性乙肝时出现内毒素血症者占53.7%，并且有80%患者持续存在内毒素血症。丙型肝炎中的慢性活动性肝炎内毒素血症发病率最高，但血清丙氨酸转氨酶水平和内毒素血症发生率及含量无明显关系。
内毒素血症和肝炎病情程度有密切关系。重型病毒重性肝炎内毒素血症的发生率可高达92.8%，这些病人较易并发弥漫性血管内凝血（DIC）及肾功能衰竭，死亡率高。根据综合文献报道，肝炎病人发生内毒素血症可能有下几点原因：
①肝细胞短期内受到大量病毒感染后，可出现一过性的内毒素血症，随着肝细胞的修复而逐渐下降以至恢复正常。当持续受肝炎病毒侵袭时，肝内网状内皮系统功能降低或肝内小叶结构缺陷；肝内外建立起侧枝循环，使内毒素未被肝脏中的枯否氏细胞清除而进入体循环发生内毒素血症。如病变较严重，肝实质出现较严重的碎屑状或桥状坏死，纤维组织增生、广泛侧枝循环的出现从而破坏了肝小叶的完整性，即可出现持续存在的内毒素血症。
②除上述病理变化以外，肠粘膜的充血，血管通透性增加使得内毒素的吸收增加，肠道菌群的异常改变，以及机体防御能力下降也加重和诱发了严重的内毒素血症。由于内毒素本身又具有直接或间接的生物学作用，从而反馈地加重对肝脏的损伤。
综上所述，内毒素的水平和病毒性肝炎的病情程度有很大关系。检测血浆内毒素水平对判断病情轻重和预后有一定临床意义，也为抗内毒素治疗作为病毒性肝炎的辅助治疗提供了理论基础。
⑵肝硬化：
肝硬化并发内毒素血症十分常见。正常情况下内毒素主要被肝脏的枯否氏细胞所清除。肝硬变后由于枯否细胞清除能力下降或由于肝内组织结构和血流的改变，使内毒素不能和枯否细胞充分接触，门脉高压侧枝循环开放，也使内毒素不能在肝内清除或绕过肝脏而进入体循环。肝硬化患者机体免疫功能下降，调理素、IgM等不足或功能减弱，使进入体循环的内毒素不易及时清除，造成严重的内毒素血症。肝脏可摄取血流中内毒素的80%-90%，故血中内毒素的升高反过来加重了对肝功能和结构损伤。故肝硬变时高内毒素水平可造成肝功能的进一步损害。
内毒素和胆道感染
胆道感染致病菌绝大多数为肠源性革兰氏阴性菌。重症急性胆管炎时胆道压力增高，造成毛细胆管破裂、坏死，胆汁中革兰氏阴性菌裂解释放出的内毒素可经肝细胞屏障直接进入肝血流而导致内毒素血症。此外，由于血管从位于小胆管粘膜层下的解剖特点可造成胆汁中内毒素经胆小管——静脉返流途径回流到门静脉和肝血窦。内毒素血症对休克和器官功能衰竭具有重要影响，是导致重症急性胆管炎严重临床过程的病理基础。有的实验表明，死亡病例内毒素水平显著高于存活者，病程中内毒素持续高水平者常发生休克、弥漫性血管内凝血和器官功能衰竭，预后不良；而内毒素水平逐渐下降者预后良好。在死亡4例中3例系胆总管结石合并肝内胆管结石，因病情危重仅行胆总管引流未能清除引流上方结石，以致结石梗阻近端胆汁中内毒素在胆道高压影响下继续进入血循环，造成血浆内毒素水平居高不降，3例临死前内毒素水平分别高达150.7ng/L 、232.0ng/L 、251.0ng/L ,远高于存活者术后7天14.28±5.84ng/L的平均水平。故胆道引流术后加强监测血浆内毒素水平变化有助于客观评价手术疗效。
血浆内毒素对纤维蛋白水平具有重要影响，在内毒素刺激下，肝脏过氧化物（LPO）含量增高，并致肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，以致氧自由基清除障碍，肝细胞因过氧化受损，合成纤维结合蛋白减少。研究证实：经氧自由基作用后5分钟，细胞膜既迅速去极化，35分钟后细胞开始融解，肝细胞暴露于过氧化氢（H2O2）4小时其合成蛋白质功能衰竭。故持续内毒素血症的重要机制。一旦内毒素水平下降则纤维结合蛋白水平趋于回升，二者具有良好的相关性，这不仅提示内毒素水平对纤维结合蛋白质水平具有重要影响，也有助于通过血浆结
合蛋白定量检测间接反映内毒素血症的严重程度，二者联合动态观察则更有助于从机体的感染和抗感染两方面的状况监测病程。
迄今临床上对重症急性胆管炎病程监测、疗效评价和预后判断尚无理想测量方法，血浆内毒素、纤维结合蛋白水平动态观察及其相关性分析作为对这方面临床问题的定量实验室指标及其实用价值值得进一步探讨。
内毒素和肺炎
肺炎是肺实质的炎症，可由多种病原体引起，如细菌、病菌、真菌、寄生虫等，其他如放射线、化学、过敏因素等亦能引起肺炎。肺炎是常见病，我国每年约有250万例肺炎发生，12.5万人因肺炎死亡，在各种致死病因中居第5位，老年或机体免疫力低下者（用免疫抑制剂、器官移植、肿瘤、糖尿病、嗜酒、艾滋病或久病体衰者）伴发肺炎时，病死率尤高。
肺炎按照病因分类可分为细菌性肺炎、病毒性肺炎、支原体肺炎、真菌性肺炎及其他病原体（立克次体、体原体等）所致肺炎。在上述众多病因中，细菌性肺炎最为常见，约占肺炎的80% 。在院外感染的肺炎中，以往致病菌大多数（90%）为肺炎球菌；近二三十年来，由于抗生素广泛使用，致病菌发生很大变化，但仍以肺炎球菌为主（40%），其余还有金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷白干菌。在非细菌感染中，病毒性、支原体肺炎很常见，后者约占成人肺炎的20% ，在密集人群中可高达50% ，近年来肺真菌病发生率亦逐渐上升，如白色念珠菌、曲菌等。
在医院内感染所致细菌性肺炎中，肺炎球菌约占30% ，金黄色葡萄球菌约占10% ，而需氧革兰氏染色阴性杆菌（绿脓杆菌、肺炎克雷白杆菌、流感嗜血杆菌、肠原杆菌、硝酸盐阴性杆菌等）则增至约50% ，其余为耐青霉菌G的金黄色葡萄球菌、真菌和病毒。一些以往较少报道的病原体（如军团菌、卡氏肺孢子虫、衣原体等）相继出现，一些非致病菌也在适应条件下成为机会致病菌。住院病人多数免疫功能低下，加以使用抗癌药物、免疫抑制剂等，以及多种医源性因素（如留置各种导管、辅助呼吸、雾化吸入等的污染）和抗生素的不恰当使用，以致病原体更趋复杂多变。革兰氏染色阴性杆菌肺炎病死率仍高（30%-40%），老年及重危患者尤为难治，住院病人有的以有严重创伤、多脏器衰竭，营养不良和酸碱及电解质平衡紊乱，故诊治肺炎的同时还要全面兼顾，采取综合措施。
产生上述结果的原因在于医务工作者忽略了在肺炎发生发展过程中起重要作用的一个病理过程，即内毒素血症。除革兰氏阴性杆菌、支原体、衣原体等可直接产生内毒素外，其他病原菌肺炎患者血中内毒素均来源于肠道。循环血中内毒素通过刺激单核巨噬细胞系统产生肿瘤坏死因子、白细胞介素–1、白细胞介素–6、白细胞介素–8等炎症因子，激发炎症瀑布效应，加重原有的临床症状。因此在肺炎治疗过程中，如果使用原有常规治疗病情无法控制时，应考虑是否内毒素在从中作梗，严重影响临床疗效。临床医生可根据患者血中内毒素含量判定病人是否存在内毒素血症，以便使用抗内毒素药物及选择诱生内毒素能力弱的抗生素。泸州医学院附属医院、南京中医药大学等几家单位，对收治的103例肺炎住院患者全部进行了血中内毒素含量测定，其结果是患者100%存在内毒素血症。在肺炎的救治中应充分重视内毒素在疾病发生、发展中起的作用，尤其在儿科，由于支原体肺炎的发病率不断升高，患儿临床表现较重，高热不退，在综合诊治的情况下，应该考虑内毒素在疾病中的作用。适当的使用拮抗内毒素药物，在减少死亡率，降低并发症方面都是十分重要的。
内毒素和革兰氏阴性球菌脑膜炎
文献报道，鲎试验对革兰氏阴性菌感染的脑膜炎诊断是敏感的，而且一般假阴性结果不超过1% 。Terg等人的初步筛查表明，脑脊液内毒素水平> 1200pg/ml ，则和革兰氏阴性菌脑膜炎患儿的休克发生和死亡有密切的联系。
内毒素测得的定量值和临床经过有一定的相关性，这对揭示临床上应采取的措施和预告都有极重要的意义。30%细菌性脑膜炎患者有抽搐症状。Terg 等在对1503位脑膜炎患者的研究中发现，脑脊液中内毒素>150pg/ml ，就很容易出现抽风，虽然它的机理尚不完全清楚，但脑脊液中内毒素的局部代谢作用和对血管的作用，很可能是引起抽搐的重要原因。动物实验表明，给事先用短棒杆菌致敏的小鼠静脉注射内毒素就会引起抽搐。血浆内毒素含量增高也会伴随严重的脑电图异常。尽管中枢神经系统的机能障碍病因因子很多，不能完全归罪于内毒素，但内毒素肯定是一个十分重要因子。
上述研究表明，血浆内毒素浓度及脑脊液浓度对指导临床治疗及估计预后都有十分重要的意义。如果脑脊液内毒素≥32 1pg/ml，则明显伴有死亡。如果内毒素<32 1pg/ml，则不伴死亡。
内毒素和急性胰腺炎
急性胰腺炎（acute pancreatitis , AP）是指胰腺极其周围组织被胰腺分泌的消化酶自身消化的化学炎症，是常见的消化系统急症之一，近十年来，国外已有急性胰腺炎伴发内毒素血症的临床报道。Lieger等报道急性胰腺炎病人有65.5%发生内毒素血症，9例死亡病人均有内毒素血症，且持续至死亡。雷文章等在动物模型中发现腹水的内毒素浓度明显高于血浆浓度，说明血浆内毒素来源于肠道，支持急性胰腺炎伴发肠源性内毒素血症的学说。
段伟宏等人在急性坏死性胰腺炎动物模型研究中发现，急性坏死性胰腺炎时内毒素血症和胰腺炎的发展呈密切相关。肿瘤坏死因子在急性坏死性胰腺炎时明显升高，且病情延长更加明显。他们同时还发现，内毒素在急性坏死性胰腺炎时明显高于对照组。同时内毒素的升高反过来加重其他组织缺血，导致细菌易位加强，血内毒素水平升高，并升高血中肾素─血管紧张素水平，形成一种组织缺血─内毒素升高─组织缺血加重的循环链。因此，对于如何采取有效措施降低血中此类物质水平，尤其是内毒素水平，对于改善急性胰腺炎的病理生理过程将有重要意义。
内毒素和口腔疾病
众多的研究表明，感染根管内的厌氧菌，尤其是革兰氏阴性厌氧菌在根尖周感染中起着主导作用。内毒素在根尖周病中的致病作用已经引起越来越多学者的注意。
由于根尖周组织主要是成纤维细胞，当内毒素通过根尖孔侵入根尖周时，对根尖周的成纤维细胞产生细胞毒性作用，这种作用可能取决于内毒素量的大小。在大量内毒素攻击下，出现成纤维细胞的分裂停止或坏死，而破坏了根尖周的屏障作用。但在炎症转化时，小剂量内毒素的刺激作用又有助于成纤维细胞的DNA 合成和分裂，对于炎症的转归和愈合具有促进作用。
骨吸收是牙周病和尖周病的主要组织损伤，严重的骨吸收导致牙齿的丧失，内毒素对牙槽骨的吸收起着十分重要的作用。内毒素可以直接激活造血干细胞转变为破骨细胞而导致骨吸收，也可以通过多形白细胞和T、B淋巴细胞介导的内源性调节因子而导致骨吸收。最近研究发现，白细胞介素–1、肿瘤坏死因子、干扰素在牙槽骨吸收中起着一定的调节作用。
内毒素在根尖周的作用机制是多方面的。随着研究的深入，相信会有更多的代谢产物被提纯和确立其在根尖感染中的作用，并为今后口腔其他感染疾病提供新的研究领域。
内毒素和慢性肾衰
肾脏病最后均可导致慢性肾功能不全（Chronic Renal Fculure ,CRF）国内外学者研究表明，在慢性肾功能不全的氮质血症期特别是尿毒症期，患者血中的内毒素水平明显升高，说明内毒素在慢性肾功能不全的发展及转归中起着一定的作用。
（1）外源性内毒素血症所致慢性肾功能不全患者机体抵抗力低下，特别是细胞免疫功能降低，易继发革兰氏阴性菌感染，感染后全身反应不明显，易漏诊或误诊，未能及时有效治疗，细菌入血引起外源性内毒素血症使血浆内毒素水平升高；（2）肠源性内毒素血症，慢性肾功能不全患者体内各种代谢产物潴留─如尿素、胍类等在血中浓度升高，尿素从肠道排出增加，它被肠道细菌分解产生氨刺激肠粘膜，破坏了完整的肠粘膜，使肠粘膜屏障功能下降，内毒素入血循环使血中内毒素水平升高；
（3）慢性肾功能不全患者肝脏损害加速内毒素血症的形成，慢性肾功能不全患者多数都有不同程度的肝损害，肾脏病程越长，肝脏损害越重，肝受损害，肝枯否氏细胞吞噬功能下降，灭活内毒素的功能降低，则加速内毒素血症的形成。
内毒素对机体有广泛的生物学活性，可引起多种损害，因此寻找防治内毒素血症的方法具有极其重要的临床意义，利用鲎试验方法可准确，及时检测病人血中的内毒素，并及时防治内毒素血症，可减轻肾功能损害或防治肾功能衰竭。因此，在慢性肾功能不全的治疗中，抗内毒素血症也是一个重要环节。
内毒素和慢性阻塞性肺疾病
慢性阻塞性肺疾病（COPD）在我国是常见疾病、多发病，发病率高达6% ，严重的危害人民健康，特别对老年人的危害更大，严重的影响着老年人的生活质量。尽管慢性阻塞性肺疾病的病因及发病机制尚未完全明了，但感染在发病中的作用是不可忽视的。尤其在慢性阻塞性肺疾病的急性发作期，感染是主要致病因素，多为病毒感染和细菌感染。病毒感染后，机体免疫能力下降，可继发细菌感染。在细菌感染中，院外感染主要是革兰氏阳性菌；院内感染多为革兰氏阴性菌，
但老年患者，则均多见于革兰氏阴性杆菌感染。
张慧利等对22例慢性支气管炎患者进行了血浆内毒素的测定，并以30例无肺部感染及其他感染者对照，结果显示慢性支气管炎血浆内毒素明显高于对照组（P<0.01），证实慢性支气管炎感染者血中存有内毒素，从而说明慢性支气管炎常伴发内毒素血症。
在慢性阻塞性肺疾病患者中，由于长期严重的缺氧及二氧化碳潴留，胃肠粘膜瘀血水肿、糜烂渗血、肝细胞损伤、肠粘膜的屏障作用受到破坏，肝脏枯否氏细胞的清除能力减弱，因此血浆内毒素的含量增高，这是造成慢性阻塞性肺疾病患者血浆内毒素升高的又一因素，纠正缺氧及二氧化碳潴留可，是减少肠源性内毒素血症病理损害的一个不可忽视的方面。
内毒素的生物学作用十分广泛，它可引起多种组织器官不同的病理损害，因此，内毒素血症是慢性阻塞性肺疾病患者后期病情恶化的一个重要环节，应该引起临床医生的高度重视。在过去的救治过程中，主要注重细菌在感染中的作用，忽视了内毒素在疾病发展过程中的作用。有文献表明，高碳酸血症，通气障碍均和内毒素有关，而且内毒素能增强气管、支气管的反应性，它触发释放的炎性介质加重原有的临床症状，使病情进一步恶化。
内毒素和中耳炎
中耳炎一般是流感嗜血杆菌和卡他性摩拉克氏杆菌引起的，而渗出性中耳炎的发病机理仍不十分清楚。近年来，内毒素在中耳炎的发病中的作用引起了极大的关注。许多研究人员对中耳炎患者的中耳渗液（MEE）中内毒素进行了测定。Bernstern等发现7%的无菌中耳渗液中含有内毒素，且发现67%的培养阴性的中耳渗液中有内毒素，且粘液性中耳渗液比浆液性中耳渗液中内毒素阳性率高。
许多实验表明，在受到内毒素攻击的实验动物都可见中耳粘膜下结缔组织增厚，细胞密度增大，毛细血管通透性增强。毛细血管被破坏及血清漏出可能是实验性内毒素引起中耳炎的主要原因。Nonomura等最近基于组织学观察提出出了血清漏出外，内毒素还破坏了正常的粘膜纤毛转运系统。
有报道表明，在中耳炎发作后，感音神经性聋及鼓膜分离的发生率很高。细菌抗原或毒素能否穿过圆窗膜而损伤内耳尚无定论。林基祯等的动物实验表明，内毒素能引起蜗神经功能何结构的变化，提示内毒素可能穿透圆窗膜进入内
耳，引起中耳炎的内耳后遗症。另有报道，大肠杆菌内毒素引发血管致耳毒性损害，严重扰乱耳蜗的水和离子代谢，导致内耳能源衰竭，这可能是中耳炎并发感冒性聋的重要因素。林圆经等人对86例成人分泌性中耳炎患者的中耳积液进行涂片检查、细菌培养、鲎血试验，结果表明，分泌性中耳炎中耳腔中细菌和内毒素的存在是中耳积液发生或使积液迁延不愈的重要原因之一。
细菌性痢疾和内毒素血症
细菌性痢疾（bacillary dysentery）是痢疾杆菌引起的一种常见肠道传染病。根据肠道炎症特征、全身变化和临床经过的不同，菌痢可分为三种：急性细菌性痢疾、中毒性细菌性痢疾、慢性细菌性痢疾。全年均可发生，但以夏秋季为多见。儿童发病率一般较高，其次是20～39岁青壮年，老年患者较少。病因及传染途径痢疾杆菌是革兰染色阴性的短杆菌。所有痢疾杆菌均能形成内毒素，志贺氏菌除内毒素外，还可产生外毒素。
菌痢患者和带菌者是本病的传染源。痢疾杆菌从粪便中排出后，可直接或间接（通过苍蝇等）污染食物、饮水、食具、日常生活用具和手等，再经口传染给健康人。食物和饮水的污染有时可引起菌的暴发流行。
痢疾杆菌经口进入消化道后，当儿童全身及局部抵抗力降低时，如一些慢性病、过度疲劳、暴饮暴食及消化道疾患等，即使感染小量病菌也容易发病。痢疾杆菌侵入肠粘膜上皮细胞后，先在上皮细胞内繁殖，然后通过基底膜侵入粘膜固有层，并在该处进一步繁殖，在其产生的毒素作用下，迅速引起炎性反应，其强度和固有层中的细菌数量成正比，肠上皮细胞坏死，形成溃疡。菌体内毒素吸收入血，引起全身内毒素血症。
临床上，本病由于内毒素血症，可出现发热、头痛、乏力、食欲减退等全身症状和白细胞增多；由于病变肠管蠕动亢进并有痉挛，引起阵发性腹痛、腹泻等症状。由于炎症刺激直肠壁内的神经末梢及肛门括约肌，导致里急后重和排便次数频繁。随着肠炎症的变化，最初为稀便混有粘液，待肠内容物排尽后即转为粘液脓血便，偶尔排出片状假膜。排便每天10～20次或更多，但因量少，故脱水不明显。严重病例，大便次数频繁乃至失禁，并常伴有呕吐，可引起明显脱水、酸中毒和电解质紊乱、血压下降，甚至发生休克。
中毒型菌痢大多发生于儿童，其发病机制尚未查明，可能因患者为特异体
质，故对细菌内毒素呈强烈过敏反应。
内毒素和皮肤软组织感染
由于在感染、创伤等应激状态下，内毒素入血液可引起相应的临床症状。因此动态监测软组织感染病人的血浆内毒素，有助于了解和发现感染的程度，也可作为临床治疗和预后的指导依据。
朱子诚等对47例不同类型软组织感染病人包括急性蜂窝组织炎，创口感染，新生儿坏死性筋膜炎、糖尿病下肢溃烂感染，糖尿病并发多发性疖肿，以及烧伤感染等进行了血浆内毒素的监测，结果显示：感染初期（如局限感染组），血浆内毒素即有增高（和对照组比较P<0.001），但在重症感染时，由于大量繁殖致病菌及其内毒素的强烈刺激，加上机体处于免疫抑制状态，血中I g G和I g A处于低值，血中内毒素的峰值和持续时间较长，预后较差。在死亡病例中，血浆内毒素均随病情加重而呈进行上升，其余病人的内毒素峰值均在治疗10天后下降。他们认为，血中内毒素水平动态监测，可作为治疗和预后判断的客观指标。
小儿急性器官功能衰竭和内毒素血症急性器官功能衰竭是儿童时期常见且发展迅速的急症，不及时诊治常影响健康甚至危及生命。如何根据小儿年龄特点及病理生理特点对急性器官功能衰竭进行早期诊断及合理治疗，以免进入不可逆衰竭或发展成多器官功能衰竭（multiple organ failure, MOF），是儿科危重症领域面临的挑战。
全身炎症反应综合征（systemic inflammation response syndrome,SIRS）不是新发现的一种疾病，它是在临床研究中对多系统器官功能衰竭（multiple system organ failure, MSOF）发生机制深入认识的基础上提出的一个概念。SIRS 是指在感染和非感染的严重刺激下产生的一种失控的全身炎症反应。在体温、呼吸、心率三项生命指征加一项周围白细胞异常，共四项中有2项异常即可诊断为SIRS。SIRS是MODS的早期表现，并出现在MODS的全过程，所以是MODS的实质。SIRS的临床表现是全身高代谢、高动力循环状态及过度炎症反应的结果。诱发SIRS和MODS的高危因素包括：不充分的延迟复苏；感染病灶的持续存在；基础脏器功能失常（如肾功能衰竭）；年龄＜1岁；营养不良；肠道缺血性坏死；肿瘤；糖皮质激素大量长期使用；重大外科手术、意外事故等。
在感染因素中，内毒素血症可致MODS或MOF已被临床所证实。但抗生素治疗革兰阴性菌感染时，菌体被杀灭、溃解，而生成内毒素，抗生素杀灭的革兰阴性菌越多，生成的内毒素也越多，对人体危害也越大，这一问题尚未被部分医生所认识。大剂量、广谱抗生素滥用致使对患儿疾病的治疗更加棘手。
总之， MODS为儿童时期的危急重症，应早期诊断、早期治疗，并应改变经验治疗模式，在观念上更新方可取得更好的治疗效果。
内毒素和肾孟肾炎（尿路感染）
肾孟肾炎（pyclinephritis）是尿路感染中的一种重要临床类型，是由细菌（极少数为真菌、病菌、原虫等）直接引起的肾孟肾炎和肾实质的感染性炎症。本病好发于女性，女:男约为10:1 ，其中尤以已婚育龄女性、女幼婴和老年妇女患病率更高，临床上将本病分为急性或慢性两期。
在肾孟肾炎的感染中，以杆菌为主要致病菌，其菌体死亡和在繁殖期间释放的内毒素也是不可忽视的致病因素。内毒素具有多种生物活性，它可损害动力工厂线粒体，使ATP产生减少，造成细胞供能不足，引起细胞水肿，加速了细胞自溶死亡。除其之外，内毒素还可以损伤溶酶体膜，影响微粒体的功能，使细胞利用氧过程被破坏，因此，肾孟肾炎发病过程中，内毒素是一个不可被忽视而不为临床医生重视的因素。近年来有关这方面的研究正日益增多。有学者报道，鲎试验对判断尿中革兰氏阴性细菌感染有显著的特异性，如对尿培养细菌数大于105/ml的尿标本中，鲎试验阳性率为87%，对革兰氏阴性菌数大于105/ml时，鲎试验阳性率为99% 。肾孟肾炎过去在治疗方面一直主张用抗生素配合其他治疗，忽略了抗内毒素治疗，并且肾孟肾炎在治疗上疗效长，病人往往不能坚持，易使疾病得不到彻底的治疗，而转变成慢性，从而损害肾功能。有研究表明在炎症的迁延过程中，内毒素起主要作用。因此，肾孟肾炎在原有治疗的基础上，应该加用抗内毒素的治疗。这对于缩短病程，防止转为慢性炎症是至关重要的。
细菌内毒素检查 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 1、实验原理：利用鲎试剂与微量内毒素产生凝聚反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 2、实验试剂： ①鲎试剂：从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 ②细菌内毒素国家标准品：系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 ③细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 ④细菌内毒素检查用水：指内毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005 EU/ml （用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 3、实验器具：刻度吸管、凝聚管（10×75mm）、三角瓶、小试管（10×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30分钟以上）去除，塑料用具应选用无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热源的一次性用品）。 4、检验方法概述 ①凝胶法：限量法、半限量法 ②光度测定法：浊度法（终点浊度法和动态浊度法）、显色基质法（终点浊度法和动态浊度法） 凝胶法：最简单、经济、应用广泛、中国药典的“仲裁”方法，对干扰相对不敏感，较光度测定法不灵敏。 5、供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸取制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。 6、内毒素限值的确定 一般按公式：L≡K／M 式中： L为供试品的细菌内毒素限量，以EU／ml，EU／mg、或EU／U（活性单位）表示。
Q4B Evaluation and Recommendation of Pharmacopoeial Texts for Use in the ICH Regions Annex 14: Bacterial Endotoxins Test General Chapter This draft guidance, when finalized, will represent the Food and Drug Administration's (FDA's) current thinking on this topic. It does not create or confer any rights for or on any person and does not operate to bind FDA or the public. You can use an alternative approach if the approach satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. If you want to discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for implementing this guidance. If you cannot identify the appropriate FDA staff, call the appropriate number listed on the title page of this guidance. For questions regarding this draft document contact (CDER) Robert King 301-796-1242, or (CBER) Christopher Joneckis 301-827-0373.
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素定量检测的临床意义 1.细菌内毒素的本质 细菌内毒素为革蓝氏阴性菌及某些阴性菌样微生物，如立克次体、螺旋体、衣原体细胞壁外膜中的一种脂多糖（Lipoplydscharide, LPS）成分，它往往在细菌生长时释放或细菌死亡时裂解出来。 2.细菌内毒素在机体内反应及临床表现 微量的细菌内毒素进入机体后即可引起机体内发热、血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞增多、补体激活、机体血压下降等一系列病理、生理反应，严重时可导致弥漫性血管内凝血（DIC）及多器官功能衰竭直至休克、死亡。细菌内毒素(内毒素)作为革蓝氏阴性菌细胞壁最外层中的脂多糖(LPS)，当严重细菌感染以及脓毒血症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的浓度升高，而自身免疫过敏和病毒感染时内毒素水平不会升高，但局部有限的细菌感染，轻微的感染不会导致其升高。内毒素水平的升高一般出现在严重休克，全身性炎症反应综合症(SIRS)和多多脏器功能紊乱综合症(MODS)，无细菌性感染患者中水平通常低于那些有细菌性病灶的患者，而从肠道释放因子或细菌移位可能引起诱导。 3.细菌内毒素水平检测在临床上应用 体液细菌内毒素水平检测是诊断和监测细菌性(尤其是革蓝氏阴性菌)疾病感染的一个重要参数，通过内毒素水平的定量快速检测可以预示： (1)作为一个急性重要参数用来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。(2)监测有感染危险的患者(如外科术后和器官移植后免疫抑制期以及多处创伤后)以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。(3)评价严重炎性疾病临床进程及预后，如腹膜炎、脓毒症、SIRS和MODS。4.体液内毒素水平测定的临床意义 体液内毒素水平是严重细菌性炎症(尤其是革蓝氏阴性菌)的一个重要的特异性指，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。内毒
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.doczj.com/doc/9b10723790.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：
批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱
细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。
细菌内毒素的检测 摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。 本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。
关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查 0引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1) 附图1 内毒素脂多糖结构示意图 <一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。 内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作 目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。 范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。 责任人：质量检测人员 材料： 一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。 二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。 四、旋涡混合器。 五、可调式移液器 六、0.25EU/ml鲎试剂。 七、细菌内毒素工作品。 八、凝胶法细菌内毒素检查用水。 九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。 操作方法 一、取样 1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。 2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。（可存放多长时间）。 3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。 二、鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
行鲎试剂灵敏度复核实验。 （一）实验操作 1、细菌内毒素工作品溶液的制备 取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 2、待复核鲎试剂的准备 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 3、加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4、加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 （二）实验结果计算
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
细菌内毒素检验方法验证方案 1 概述:为了符合2010版GMP的要求，为了确保生产检验出符合预定用途和注册要求的产品，确保产品质量合格。保证用药安全。确认检查方法的科学持续稳定可靠适用性理想。本方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。 2 验证目的:为确保注射用水细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度在本实验室条件下的适用性保证检测结果科学准确可靠，特制定此方案对注射用水细菌内毒素检查方法进行验证。 3 验证方式:结合实验室实际情况，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查。由合格的检验人员对同一批供试品进行检查同一操作方法同一批供试品检查重复检查3次记录检查结果对比，看检查结果是否符合要求，重复性稳定性是否符合要求。 4 验证范围:适用于注射用水细菌内毒素检查方法验证，按照2010版药典附录细菌内毒素检查方法检查项下要求逐一进行。 5 验证结果的评价:根据药典合格标准来验证确认，确认检查方法检查结果的重现性稳定性是否符合要求。适用性是否理想。 6 验证机构组成 6.1验证委员会根据验证工作需要，常设验证委员会，负责所有验证工作的领导和组织，负责审批验证方案和验证报告、发放验证证书。验证委员会针对每一个具体验证项目成立专门的验证小组，负责该验证项目的验证方案起草，实施、组织与协调，负责验证结果记录与评定，负责完成验证报告。 6.2验证委员会组成: 姓名部门及职务验证委员会中职务验证工作中职责 6.4职责: 6.4.1 验证委员会:
6.4.1.1 负责验证方案的审批。 6.4.1.2 负责验证的总协调工作，以保证本验证方案顺利实施。 6.4.1.3 负责验证数据及结果的审核。 6.4.1.4 负责发放验证证书。 6.4.2 验证小组: 6.4.2.1 负责验证方案的制定和实施。 6.4.2.2 负责验证工作的组织与协调。 6.4.2.3 负责验证数据的收集和结果评定。 6.4.2.4 负责完成验证报告。 7文件准备和培训 7.1所需文件已准备齐全。 7.2培训:在确认实施前，依据验证小组通过的方案，对参加验证人员培训，明确分工。 培训记录: 培训内容日期培训人接受培训人注射用水细菌内毒素检查方法验证方案8验证进度计划 8.1验证小组提出完整的验证计划，经验证委员会批准后实施，整个验证活动分以下几个阶段完成。 : 从年月日至年月日 ; 培训 注射用水细菌内毒素检查方法验证 :从年月日至年月日 ; 9验证依据参考文献 培训内容日期培训人接受培训人注射用水细菌内毒素检查方法验证方案9.1根据2010版药典附录细菌内毒素检查方法、附录XVIII A 中药质量标准分析方法验证指导原则验证方案的编写、实施、结果的评价。