Menke体外产气法（Syringe系统）——管子
（一）基础知识
体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模
拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按
1:2的体积比混合，搅拌均匀而成
影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物
活力是影响实验成败的关键
（二）试验前准备
试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。
称量样品①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。
配制原液正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。
（三）正式试验
配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。
吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。
记录初始微生物培养液量排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml 微生物培养液，标准干草对照以200mg （DM ）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml 微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。
记录产气量 培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h 时（试验样品为粗料，一般培养
到72h 或96h ；精料一般培养到24h 或48h 即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h ），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。
产气量计算 ()[]空白t t GP V V W
GP --?=0200（管子）
式中，GP t 为样品在t 时刻的产气量（ml ）；V t 为样品发酵t 小时后，产气管刻度读数（ml ）；V 0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml ）；W 为样品干物质重（mg ）；GP 空白为空白对照在t 时刻的产气量，其计算方式与GP t 一致。
重复试验 要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准
干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。
(四)样品采集
测定项目 取样时间 取样部位 取样量 重复数 处理
保存温度 VFA 实际需要 上清液 1ml - 加入0.2ml 8.2%偏磷酸，
20000g 离心10min
4℃ NH 3-N 24或48h 混合液 5ml - -20℃ MCP
24或48h
混合液
24ml
-
-20℃
附表1：人工唾液原液配制表 A 、微量元素溶液：
CaCl 2.2H 2O 13.2g; MnCl 2.4H 2O 10.0g; CoCl 2.6H 2O 1.0g; FeCl 3.6H 2O 8.0g; 加蒸馏水至100ml B 、缓冲液：
NH 4HCO 3 4.0g; NaHCO 3 35.0g; 加蒸馏水至1000ml
C 、常量元素溶液：
Na 2HPO 4.12H 2O 9.45g KH 2PO 4 6.2g
MgSO 4.7H 2O 0.6g 加蒸馏水至1000ml
D 、0.1%刃天青溶液：
100mg 刃天青溶解于 100ml 蒸馏水
E 、还原剂溶液（现用现配）：
1M NaOH 4.0ml Na 2S 9.H 2O 625mg 加蒸馏水95ml 附表2：人工唾液配制表（1000ml ）
整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min
2微量元素溶液（A液）0.1 3缓冲液（B液）208.1 4常量元素溶液（C液）208.1 50.1%刃天青溶液（D液） 1.0 6还原剂溶液（E液）62.4
嘌呤法测定体外微生物蛋白产量
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1、试验试剂
标准曲线制备
样品处理
℃水浴4
冷却
加入
6ml 28.5mM NH 4H 2PO 4
90-95℃水浴15min
冷却
6ml 0.2M NH 4H 2PO
4
用85%–3
0.2ml 0.4M AgNO 3
5℃避光、过夜 4℃
4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗
4℃90-95℃水浴30min 40.5M HCl 稀释40倍 0.5M HCl 作参比 260nm 下比色
2、测定步骤
A ．酵母RNA 标准曲线的制作:
① 分别称取5、15、25、35、45、55mg 酵母RNA 于10ml 离心管中，并加入2ml 0.6M HClO 4，于90 - 95℃水浴1小时，冷却；
② 再分别加入6ml 28.5mM NH 4H 2PO 4，于90 - 95℃水浴15min ，冷却后在3000g ，4℃条件下离心10min ；
③ 取1.6ml 上清液，向上清夜中加入6ml 0.2M NH 4H 2PO 4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH 为2–3（一般需85%磷酸25μl）；
④ 取调整pH 值后的溶液3.8ml ，并向其中加入0.2ml 0.4M AgNO 3，混合，于5℃条件下避光、过夜；
⑤ 过夜后于3000g ，4℃条件下离心10min ，弃上清液；用4.5ml pH = 2 的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g ，4℃条件下离心10min ，弃上清液；
⑥ 向沉淀中加入5ml 0.5M HCl 溶液，混匀，在90 - 95℃条件下水浴30min 后，以3000g 离心10min ；
⑦ 上清液用0.5M HCl 稀释40倍后，以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值作出标准曲线。
B ．培养液中微生物蛋白质的测定:
① 取8ml 均匀发酵液于3个10ml 离心管，在20000g ，4℃条件下离心20min ；弃上清液后加入2.104ml 0.6M HClO 4，于90 – 95℃水浴1小时，冷却；
② 按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作；
③ 以0.5M HCl 溶液作参比，在260nm 下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA 测定值；
④ 根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：
其中，RNA 含氮量为17.83%，细菌氮中RNA 含氮量为10%。
浙江大学奶业科学研究所
比色法测定培养液氨态氮浓度
微生物蛋白氮（mg/ml ）=
RNA 测定值（mg/ml ）×RNA 含氮量
×稀释倍数
细菌氮中RNA 含氮量
（一）操作流程图
标准曲线制备
样品处理
8ml 0.2M HCl
摇匀、静置10min 0号管液作参比 700nm 下比色
摇匀
（二）试剂配制及具体操作
1 试验试剂
2 测定步骤
A、氨氮标准系列溶液制备
①准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱
中可存放数月。
②取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。含氮量为10mg/100ml。
③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、
9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。这就是每100ml中含氮量为0、
0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。
B、比色与计算
①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E
液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。
②用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。
③样品处理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液
（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml 0.2M 盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。
比色操作同：准确量取各溶液0.4 ml 置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。
浙江大学奶业科学研究所
柱温
体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定
（一）操作流程图
（二）试剂配制及具体操作
1 混标制备
按表1
或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。
表1 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （umol / ml ）
1 2 3 4 5 6 乙酸 10 20 40 80 160 320 丙酸 1 2 4 8 16 32 丁酸
1 2 4 8
16 32 表2 乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制 （ul / ml ）
1 2 3 4 5 6 乙酸 0.571 1.143 2.285 4.570 9.140 18.280 丙酸 0.075 0.149 0.299 0.598 1.196 2.390 丁酸
0.092
0.184
0.367
0.735
1.470
2.939
2 上机测定
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25μm
200℃ 220℃
采用程序升温，80℃持续1min 后，以15℃/min 升温至170℃后维持1.5min
载气为高纯氮，压力为100kpa ，总流量63.8ml/min ，柱流量1.19ml/min ，分流比50，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 2μl
样品中乙、丙、丁酸浓度测定
色谱柱
检测室温度
载气及流速
检测室气体流速 进样量
浙江大学奶业科学研究所
发酵气体中甲烷含量的测定
（一）标准曲线建立
用10μl 的微量注射器分别抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μl 的甲烷标准气，上机，根据甲烷的浓度和其峰面积的关系，确定甲烷的标准曲线。由于在测定发酵气体时取样量是20μl ，故设定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μl 的甲烷标准气的浓度分别为5、10、15、20、25、30%。
（二）上机条件
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25μm 100℃ 120℃ 80℃
载气为高纯氮，压力为179.5kpa ，总流量46.2ml/min ，柱流量2.7ml/min ，分流比15，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 20μl
浙江大学奶业科学研究所
色谱柱
检测室温度 柱温 载气及流速
检测室气体流速 进样量
压力读取式体外产气法（RPT 系统）——产气瓶
（一）基础知识
体外产气法主要理念 通过体外产气装置模拟瘤胃发酵
体外产气系统组成 体外产气装置：产气瓶（相当于独立的瘤胃）、恒温培养箱（模拟瘤胃温度）；微生物培养液：1:9的瘤胃液与人工唾液；压力传感器；PC
影响实验成败的主要因素
实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键
（二）操作流程图
（三）试剂配制及具体操作 1、试验前准备
称量样品 ①产气瓶编号（因为产气量的计算涉及瓶子体积，所以尽量保留原产气瓶编号，使用新瓶时要
量取瓶子体积）；②加入磁力棒；③准确称取待测样品一般约750mg （DM ，适用0.5-1.5mgDM ），置于体外产气瓶底部。
配制人工唾液 ①计算人工唾液需要量：体外培养时每个产气瓶内人工唾液的量为90ml ，瘤胃液10ml ，
依据试验设计的产气瓶数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；②配制人工唾液中的微量元素溶液（A 液）、缓冲液（B 液）、常量元素溶液（C 液）、刃天青溶液（D 液）（可过量配制，常温下存放）和还原剂（E 液，现用现配，见附表1）。③按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO 2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。
分装人工唾液 不间断地将CO 2通入人工唾液瓶，用100ml 注射器或产气管吸取人工唾液90ml ，注入称有
样品的产气瓶，并用CO 2饱和（可通过三通管完成两路CO 2的同时输入）。盖紧橡胶塞后，39±0.5℃恒温培养箱内过夜（对于青贮类等含酸较多的样品，一定要过夜，而且在正式培养前将里面所产气体排空，不计入产气量）。
微 生 39℃培养 90ml 人工唾液
10ml 瘤胃液
2、4、6、9、12h
读取瓶内气体压力 微量进样器吸取20μl 气体 测定CH 4，放气
24或48h
读取瓶内气体压力
微量进样器吸收20μl 气体
测定CH 4，放气
① ②
1ml 上清液
VFA
3个1ml 混合液
5ml 混合液 30ml 混合液
加入0.2ml 8.2%偏磷酸 4℃ 20000g 10min 4℃保存
物
NH 3-N
MCP
-80℃保存
-20
-20
其它①准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；②贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。
2、正式试验
采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。
①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应时经常热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，盖好盖子；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，依次用二层、四层和六层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液不间断地通入CO2气体；
④将密封的产气瓶从恒温箱中取出，用6.5号针头将产气瓶中多余气体放尽；⑤用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通过另一16号针头注入产气瓶，将两根针头取下，产气瓶置于39±0.5℃恒温箱中培养。
空白对照和标准对照
实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照。空白对照不加样品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，标准对照以750mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。为了消除操作顺序和恒温培养箱条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于培养箱的不同位置。
记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48h时，如果条件允许可延长培养时间，培养粗料时，至少96h或更长（有人培养一周），用压力传感器读取产气瓶内压力（轻拿、轻放），并放气。
产气量计算
()
W
V
P
GP t
t?
-
?
=
3.
101
100
0（瓶子）
式中，GP t为样品在t时间段的产气量（ml）；P t为t时间段读取的压力（mPa）；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压（mPa）；W为样品干物质重。产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。
瘤胃发酵样品制备①培养中途取样时，要求取样同时，向产气瓶内通入CO2，并于39℃水浴中操作; ②取混合液（发酵液及固体残渣）时要求在控温磁力搅拌机上操作。
重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%。
附表1：人工唾液原液配制表
A、微量元素溶液：
CaCl2.2H2O 13.2g;
MnCl2.4H2O 10.0g;
CoCl2.6H2O 1.0g;
FeCl3.6H2O 8.0g;
加蒸馏水至100ml B、缓冲液：
NH4HCO3 4.0g;
NaHCO3 35.0g;
加蒸馏水至1000ml
C、常量元素溶液：
Na2HPO4.12H2O 9.45g
KH2PO4 6.2g
MgSO4.7H2O 0.6g
加蒸馏水至1000ml D、0.1%刃天青溶液：
100mg刃天青溶解于
100ml蒸馏水
要求：使用压力传感器前，熟练软件的操作（有模拟程序可供练习）
E、还原剂溶液（现用现配）：
Cysteine HCl 625mg 蒸馏水95ml 1M NaOH 4.0ml Na2S 9.H2O 625mg
附表2：人工唾液配制表（1000ml）
顺序原液体积（ml）1蒸馏水520.2 2缓冲液（B液）208.1 3常量元素溶液（C液）208.1 4微量元素溶液（A液）0.1 50.1%刃天青溶液（D液） 1.0 6还原剂溶液（E液）62.4
瘤胃液脂肪酸测定
（一）操作流程图
85℃水浴30min
0.67ml 5M NaOH 橙指示剂
2
冷却
①加入 0.67ml 5.1M HCl ②加入
1ml 2mg/ml
C 17：0
③充满
2.5ml 氯仿/甲醇
涡旋2min 2000g 10min N 2吹干 1.0ml 正己烷悬浮 -20℃冻存
上机测定
（二）试剂配制及具体操作
1、样品处理
①. 取1ml 样品于带盖的水解管，加入0.67ml 5M NaOH 和一滴饱和甲基橙指示剂后，充满N 2； ②. 85℃水浴30min ，冷却至室温后，加入0.67ml 5.1M HCl, 使溶液pH 低于2（溶液由橙色变为红色），如果不确定，可以用pH 计检测； ③. 加入1ml 2mg/ml 的内标C 17：0；
④. 加入2.5ml 氯仿/甲醇（2: 1,v/v ）后，涡旋2min ； ⑤. 将样品在2000g 下离心10min ；
⑥. 移去上层甲醇/水层，轻轻拨开中间杂质层，将下层溶液无损失转移； ⑦. 通过含硫酸钠的干燥柱将下层氯仿滤入另一玻璃容量管； ⑧. 用氮气将样品吹干；
⑨. 用1.0ml 正己烷悬浮后，简单涡旋；
⑩. 2000 rpm 下离心10min ，样品-20℃冷冻保存。
2、上机条件
HP-INNOWAX （19091N-133）毛细管柱，30m ×0.25mm ×0.25μm
260℃ 270℃ 采用程序升
温，140℃持续5min 后，以4℃/min 升温至240℃后维持20min
载气为高纯氮，压力为100kpa ，总流量87.9ml/min ，柱流量0.84ml/min ，线
速度：25.6cm/sec ，分流比100，吹扫流量3ml/min ，循环流量30ml/min
H 2流量40ml/min ，空气流量400ml/min 产气管，2μl ；产气瓶4μl
浙江大学奶业科学研究所
色谱柱
气化室温度 检测室温度 柱温
载气及流速 检测室气体流速 进样量