间接ELISA检测抗血清效价
姓名：王贤臣学号：1125400080
（成都医学院医学检验成都610500）
【摘要】目的：通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术（ELISA）的原理及
操作过程及间接ELISA检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。方法：间接ELISA双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。结果：经过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度，然后在正式实验确定其浓度，从而再进行研究。讨论：间接ELISA检测抗血清效价的影响因素。并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比，和分析在实验过程中的注意事项。
【关键词】抗人白蛋白ABL ELISA
前言：1971年Engvall和Perlmann 发表了酶联免疫吸附测定用于IgG 定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微量物质的测定方法。之一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持器免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
实验方法：
预实验设计方案：
1、材料与方法
1.1仪器：洗板机（BIO-RAD MODEL 1575 ）
SM自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所 BIO-RAD 680）
电热恒温箱（上海恒科技仪器有限公司）
移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）
微孔反应板刻度吸管（5ml、1ml）
吸耳球试管架塑料试管封口纸烧杯
1.2试剂：人ALB标准品（SIGMA :A1653 SIZE:250MG storage:2-8℃）
PBS缓冲液：0.1M pH7.4(PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化
钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL)
包被液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液
洗涤液：0.05%Tween-PBS(即PBST) (0.05%Tween-PBS 1000mlPBS
加500ul吐温）
封闭液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液 100mlPBS加1g干酪素）
显色液（A液、B液Cat:ME002 可溶性TMB显色液)
终止液：2M H2SO4
酶标抗体（兔抗羊--HRP ，武汉博士德生物工程有限公司）
1.3待测标本：羊抗人ALB （效价1:70 批号：201106 贮存于4-20℃，有效
期：2年）
1.4方法： ①预实验
包被抗原(100ul/孔)
↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次 拍干 加封闭液(300ul/孔)
↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次 拍干 加入标本(100ul/孔)
↓37℃1h 洗涤5次 拍干 加入酶标抗体(100ul/孔) 拍干 ↓37℃1h 洗涤5次
加入显色剂A 、B 液各50ul/孔 ↓37℃15-20min 加入终止液(100ul/孔) ↓ 检测
表1：包被抗体和酶标记抗体棋盘滴定
羊抗人ALB 血清 羊抗人ALB 血清 兔抗羊
IgG-HRP 1: 10 1: 40 1: 160
1: 640
1: 2560 P B S 兔抗羊 IgG-HR P 1: 10 1： 40 1： 160 1： 640
1： 2560 P B S 1:500 1:500 1:2000 1:2000 1:8000 1:8000 1:16000
1:16000
羊抗人ALB 血清 羊抗人ALB 血清 兔抗羊
IgG-HRP 1: 10 1: 40 1: 160
1: 640
1: 2560 P B S 兔抗羊 IgG-HR P 1: 10 1： 40 1： 160 1：
640
1： 2560 P B S 1:500 1:500
1:2000 1:2000 1:8000
1:8000 1：16000
1:16000
（1）将人ALB 用包被液稀释为：
0.01ug/ml 0.1ug/ml 1ug /ml 10ug/ml
（2）酶标结合物（兔抗羊IgG-HRP ）稀释为： 1:500 1:2000 1:8000 1:16000
（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB 血清）稀释为：
人ALB ：10ug /ml 人ALB ：1ug /ml 人ALB ：0.1ug /ml 人ALB 0.01ug /ml
1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560
在初步结果的基础上继续细化工作浓度，重新检测以确定最终最适包被抗原和酶标抗体的最终工作浓度，即建立间接ELISA法检测抗人白蛋白血效价。
②正式
包被抗原(100ul/孔)
↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次拍干
加封闭液(300ul/孔)
↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次拍干
加入标本(100ul/孔)
↓37℃1h 洗涤5次拍干
加入酶标抗体(100ul/孔) 拍干
↓37℃1h 洗涤5次
加入显色剂A、B液各50ul/孔
↓37℃15-20min
加入终止液(100ul/孔)
↓
检测
表2：包被抗体和酶标记抗体棋盘滴定
包被抗原的浓度为0.1ug /ml 0.01 ug /ml，每个浓度做三排，共做六排，测出OD值
羊抗人ALB血清
兔抗羊IgG-H RP 1:10 1:40 1:16
1:64
1:256
1:102
40
1:409
60
PBS
1:8000
1:1000
1:1600
羊抗人ALB血清
兔抗羊IgG-H RP 1:10 1:40 1:16
1:64
1:256
1:102
40
1:409
60
PBS
1:8000
1:1000
1:1600
2、结果人ALB：0.1ug/ml 人ALB：0.01ug/ml
①预实验：
表3：我们组预实验结果
确定最适抗原浓度 取每个区域中二抗浓度同一行的五个数据进行分析，共得出20张线性关系图，取R 值最大且稀释比例最大的区域为最适抗原浓度
确定二抗浓度 在确定包被抗原浓度后取该区域中二抗浓度同一行的五个数据进行分析共得出4张线性关系图，取R 值最大OD 值最大不超过2且稀释比例最大的区域为最适二抗浓度
人ALB：10ug/ml
1231
2345
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3系列4
人ALB：1ug/ml
1231
2345
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3系列4
人ALB：0.1ug/ml
1231
2345
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3系列4
人ALB 0.01ug/ml
1231
2345
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3系列4
注：1、系列1、2、3、4分别为兔抗羊IgG-HRP 1:500、1:2000、1:8000、1:16000稀释与不同羊抗人血清稀释浓度（1:10、1：40、1：160、1：640、1：2560）对应所得的吸光度图像 2、X 轴1、2、3、4、5分别对应羊抗人血清稀释浓度1:10、1：40、1
：160、1：640、1：2560
由上述四图得：包被抗原浓度在10 ug/ml 1 ug/ml 0.1 ug/ml 时数据跳动大对结果意义不大。而包被抗原浓度在0.1ug/ml 时跳动稍小。因此的包被抗原浓度在0.1~1ug/ml 二抗浓度在1/8000~1/16000最适。 ②正式：
表4：我们组正式实验结果跳动很大不成线性关系无分析意义我们以第四组的正式实验结果进行分析
注：H 、G 、F 、E 、D 、C 、B 、A 分别对应羊抗人ALB 血清稀释浓度1:10
、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240、1:40960、PBS
1、2、3、4、5、6分别对应兔抗羊IgG-HRP 稀释浓度1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000、1:16000 将人ALB ：0.1ug/ml 0.01ug/ml 条件下兔抗羊IgG-HRP 稀释浓度1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000、1:16000同一行的7个数据进行分析，共得出6张线性关系图，
取OD 值最大不超过2且吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化的曲线所对应的数值作为正式实验结果分析的依据得出效价
人ALB：0.1ug/ml
12
1
2
34567
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3
人ALB：0.01ug/ml
0.511.51
234567
羊抗人ALB血清稀释浓度
吸光度
系列1系列2系列3
注：系列1、2、3分别对应兔抗羊IgG-HRP 稀释浓度1:8000、1:10000、1:16000
X 轴1、2、3、4、5、6、7分别对应羊抗人血清稀释浓度1:10、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240、1:40960
取OD 值最大不超过2且吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化的曲线所对应的数值作为正式实验结果分析的依据得出效价
由上两图六张曲线的对比在人ALB: 0.1ug/ml 兔抗羊IgG-HRP 稀释浓度1:8000条件下吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化最为明显，所以本次实验应以该组实验数据来计算抗血清效价。 1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560 1:10240 1:40960 阴性对照
1.71 1.331 1.046 1.063 0.684 0.702 0.451 0.798
COV=0.1 + OD 阴性对照 COV=0.1+0.798=0.898 阳性：OD 样品≥COV 阴性：OD 样品＜COV 所以抗血清效价为1：640
3、讨论
在本次实验中我们组顺利测出预实验结果数据，正式实验未能准确的测量到位，可能原因有
①在实验加样过程中，溶液加样量不均；
②当再加入显色液A、显色液B时在孵育过程中对于颜色变化没有掌握好从而导致颜色过深无法检测其吸光度；
③在加二抗孵育结束后再洗完板后由于时间关系必须得等几天才能继续试验，但在保存过程中没有将板拍干，从而会使结果偏差；
④在实验时，拍板未能拍干；
同时在用间接酶联免疫吸附测定技术ELISA的双抗体夹心法测定抗血清效价中影响实验结果的因素有：
(1) 实验是由多个人进行操作个人手法不一样很容易引起误差；
（2）包被抗原时,因为试剂没有配够，整块板子的抗原前后配制了3次，浓度误差大大增加，对结果造成影响；
（3）加入封闭液后放入冰箱内隔了好几天才拿出来进行洗板，拿出来时看到板子的底部有很多白色的沉淀物，很有可能是滋生了很多杂菌，污染了抗原；（4）第一次预实验的封闭过程进行了三天，极有可能是造成背景过高的首要原因；
（5）加入显色液后看到显色梯度但是没有立即加入终止液导致测量结果没有出现理想值。而且大家由于操作不熟练加液速度非常慢，也可能影响显色进而影响结果；
（6）在加一抗和二抗时用手指放在反应板上，手上很多杂质比如蛋白质，汗液污染了板，继而影响了板底得抗原或者一抗二抗等物质。
4、结论
在本次实验中我们组顺利测出预实验结果数据，正式实验未能准确的测量到位。根据数据得出包被抗原最适浓度在0.01ug/ml-0.1ug/ml ，二抗最适比例在1：8000及1：16000 。在正式实验时数据跳动大没有多大的实际参考价值。但测得第四组的结果效价为1：640
参考文献：
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[6]李宏杰，祖华，王元桂，等.ELISA板条预检的三种方法比较[J]. 中华现代医学与临床，2005，2（12）：47-49.
摘要............................................................................. .. (4) 【实验过程】 (5) PartⅠ. NDV 抗血清制备 (5) 一、实验原理 (5) 二、实验仪器、材料和试剂 (7) 1. 仪器 (7) 2. 材料 (7) 3. 试剂 (7) 三、方法和步骤 (7) （一）NDV 兔抗血清制备 (7) 1. 家兔捉拿方法 (7) 2. 家兔固定方法 (8) 3. 初次免疫 (9) 4. 二次免疫 (10) 5. 终末免疫 (10) 6. 试血 (10) 7. 颈动脉放血 (10) 8. 血清分离 (12)
9. 抗血清保存 (12) （二）NDV 鼠抗血清制备 (12) 1. 小白鼠的捉拿和固定 (12) 2. 初次免疫 (13) 3. 二次免疫 (15) 4. 终末免疫 (15) 5. 试血 (16) 6．放血 (18) 7．血清分离 (19) 8．抗血清保存 (19) Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 (19) 一、基本原理 (19) 二、实验仪器、材料和试剂 (20) 1. 仪器 (20) 2. 材料 (20) 3. 试剂 (20) 三、方法和步骤 (20) 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 . 20 2. 1%琼脂糖配制 (20) 3. 倒平板 (21) 4. 打孔 (21) 5. 稀释抗血清 (22)
6. 加样 (22) 7. 孵育 (23) 8. 结果观察 (23) Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 (23) 一、基本原理 (23) 二、实验仪器、材料和试剂 (24) 1. 仪器 (24) 2. 材料 (24) 3. 试剂 (24) 三、方法和步骤 (25) 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取 . 25 2、抗原包被 (25) 3. 封闭 (25) 4. 洗板 (25) 5. 稀释抗血清 (25) 6. 加抗血清 (26) 7. 洗板 (26) 8. 加酶标二抗 (26) 9. 洗板 (27) 10. 显色 (27) 11. 终止 (27) 12. 读数 (27)
Q/HBY 抗体检验标准操作规程 杭州博茵生物技术有限公司发布
前 言 本规范由杭州博茵生物技术有限公司提出。 本规范起草单位:杭州博茵生物技术有限公司。 本规范主要起草人：李因来、徐东鑫、陈浙、潘剑用。本规范于2016年7月27日首次发布
编制人陈浙日期2016.07.26部门抗体研发部审核人徐东鑫日期2016.07.27部门质量部 批准人潘剑用日期2016.07.27部门抗体研发部发放编号Q/HBY QF0001‐2016生效日期2016.07.27 抗体检验标准操作规程 1.目的 对单克隆抗体成品的检验操作做出规定，以保证成品质检结果的准确性。 2.范围 适用于下述第6条“合格标准”表格中所列抗体成品的效价测定。 3.职责 操作人员依据本规程进行抗体检验。 4.材料与设备、试剂与溶液 见下述相关文件。 5.检验方法 5.1外观 包装完好，无漏液现象，标签准确。 5.2物理性能 自然光下目测，观察产品溶液是否澄清、是否有沉淀或悬浮物。 5.3浓度 按QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》测定样品的浓度。 5.4纯度 将样品稀释到1mg/ml，按QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》进行检测并作记录。其中，样品缓冲液含DTT或β-巯基乙醇，样品应加热处理，浓缩胶浓度为3%，分离 胶浓度为12%，染色方法为考染。 5.5效价 按QC-0002《效价检测标准操作规程》进行。
6.合格标准 项目 产品 M010101M010102 外观包装完好，无漏液现 象，标签准确 包装完好，无漏液现 象，标签准确 物理性能无色澄清液体、无沉 淀、无悬浮物 无色澄清液体、无沉 淀、无悬浮物 浓度≥3mg/ml，且偏差± 5% ≥3mg/ml，且偏差± 5% 纯度≥95%≥95% 效价 1.28ng/ml 1.28ng/ml 7.相关文件 QC-0002《抗体效价检测标准操作规程》 QC-0003《蛋白SDS-PAGE检测标准操作规程》 QC-0004《抗体浓度测定（A280）标准操作规程》 8.相关记录 QF-0001-RE-01《抗体检验报告》 QF-0002-RE-01《抗体效价检测记录》 QC-0003-RE-01《蛋白SDS-PAGE检测记录》 QC-0004-RE-01《抗体浓度测定（A280）记录》
ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第 10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。 2．离心后试管内上清液出现溶血，表明不仅有抗原抗体反应，而且有补体激活，具有重要临床意义。 血型抗体效价测定 目的了解血型抗体效价测定的操作方法。 原理将被检抗血清作倍比稀释后，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。 器材小试管、刻度吸管、37°C水浴箱。 试剂1.标准2%A型红细胞生理盐水悬液。 2．生理盐水。 标本被检者血清。 操作以抗A效价测定为例。 1．血清倍比稀释取10支小试管，每管加入生理盐水0.1ml。在第1管中加入0.1ml被检者血清，混匀后吸取0.1ml加入第2管，依此类推，至第10管，最后弃去0.1ml。 2．加入抗原红细胞于每管中加入2%A型红细胞生理盐水悬液0.1ml，混匀。 3．温育置15~20°C室温中温育15min。 4．离心和观察结果以1000r/min离心1min，以出现1个（+）凝集强度试管的血清稀释倍数的倒数定为该抗血清效价。 注意事项 1．倍比稀释要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。
5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）
新生儿溶血病血清学检查标准操作规程 (一)检验目的 检测孕妇产前与其丈夫ABO及Rh血型相容性、孕妇IgG 抗体效价、产后新生儿体内不相容抗体存在情况、新生儿与产妇之间血型相容性，为新生儿溶血病的预防、诊断及治疗提供可靠的实验室依据。 (二)检验原理 新生儿溶血病是由母婴血型不合，母亲体内与新生儿红细胞抗原不配合的IgG性质的血型抗体进入新生儿体内，破坏新生儿或胎儿红细胞而引起，可发生在胎儿期和新生儿早期，溶血严重者可出现死胎而流产，存活者则有不同程度的新生儿黄疸。新生儿溶血病产前诊断方法主要包括检测胎儿父母的ABO及Rh血型、孕妇不规则抗体筛查、外周血抗A ／抗B或Rh抗体效价来判断新生儿溶血病发生的可能性及严重程度；新生儿溶血病产后诊断主要包括母子ABO及RhD 血型鉴定试验、新生儿标本三项试验，为临床诊断及进一步采取治疗手段提供可靠的依据。 (三)适用范围 适用于新生儿溶血病产前、产后血型血清学试验。 (四)设备性能参数 参见血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Ortho BioVue离心机及各全自动血型／配血系
统使用说明书。 (五)器材与试剂 1.器材血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Or-tho BioVue离心机、塑料软试管、塑料硬质试管(75mmXl2mm)、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液枪、一次性移液枪头。 2.试剂DiaMed ABO／RhD血型卡、OrthoBioVueABO ／RhD血型卡、抗A、抗B血清、Rh分，型血清、生理盐水、抗球蛋白试剂(市售单克隆)、抗体筛查试剂红细胞、抗体鉴定试剂红细胞、致敏的阳性对照细胞(自制)。 (六)标本要求 1.夫妇标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。 2.患儿标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无明显乳糜。 (七)校准步骤 参照血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、OrthoBioVue离心机及各全自动血型／配血系统使用说明书中的校准要求执行。 ’ (八)操作程序
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程 [样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。 [样品准备]： 试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存. 红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右. 血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃ 放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有 絮状物或沉淀； [配套试剂]：孕妇IgG抗体 效价卡，标准A、B、O红细 胞（取决于父亲血型）， 0.2M(2-Me)应用液 [实验步骤] 1、试剂卡室温平衡， 离心一次，标记编 号； 2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和 0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体） 既得到孕妇的中和血浆。 3 4、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔 中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul 5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟； 6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。判定结果。 [结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 [参考值] 1、RH系统抗体效价16有临床意义 2、ABO系统抗体效价64有临床意义 [注意事项] 1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度 （根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》） 2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不 得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
抗体效价测定操作规程 操作步骤： 一.IgG 类 I.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200］加等体积2—Me溶液混合，封口，置37C水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清 600L 生理盐水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；） 3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1 液3d,混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点, 终点血清稀释度的倒数为效价（Titer ）,或称滴度。 二.IgM 1?血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐
水备用，排列6 支试管按顺序编号。第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L,第一管和第二管中各加入稀释血清200L,第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L 暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是 1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256 。 2. 加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L,混匀。（如待检血清抗体为抗A,则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B,则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B,则倍量稀释两份血清，一份加入A 型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）三．此类为IgM 类盐水抗体可立即离心后观察。 四． 五．（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）
输血相容性检测作业指导书范本 目录 第一章规章制度 第一节临床输血管理委员会一、临床输血管理委员会组成 二、临床输血管理委员会工作职责三、临床输血管理委员会工作计划第二节临床用血申请与审批管理一、临床用血计划的拟定 二、临床用血申请和审批制度 三、临床退血管理 第三节临床输血操作步骤及岗位职责 一、临床输血操作步骤 二、各岗位职责流程图 第四节输血科管理制度 一、科室工作守则 二、临床用血有控制感染的方案及管理制度三、输血反应及输血感染疾病的登记报告与调查处理制度 四、消毒隔离及污物处理制度 五、工作人员健康体检制度 六、考勤制度 七、请假制度 八、人事考核制度 九、奖惩制度 十、计算机使用管理制度 十一、仪器设备管理制度
十二、值班工作制度 十三、临床用血计划申报登记制度十四、配输血查对制度 1 十五、血型鉴定与交叉配血的复查与核对制度十六、血液储存、发放、临床输血和血液报废制度 十七、血液质量监测制度 十八、仪器设备认购、验收、使用管理、保养、维修及报废制度 十九、试剂的认购与入库、领用制度二十、计量管理制度 二十一、差错事故登记、报告制度二十二、方便病人配合临床制度二十三、科学合理用血制度 二十四、紧急用血制度 二十五、输血治疗知情同意制度二十六、各种登记记录管理和保存制度二十七、库房管理制度 二十八、档案保管制度 二十九、输血不良反应处理和回报制度三十、交接班制度 三十一、血液标本的留取接收保存制度三十二、实验室管理制度 第五节、岗位职责 一、输血科主任岗位职责 二、主任、副主任技师岗位职责三、主管技师职责 四、输血科技师岗位职责 五、输血科技士岗位职责 六、临床医师在用血时的职责 七、临床护士在用血时的职责 第二章仪器、设备使用操作规程
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固
NDV抗血清制备及抗体效价测定 【实验目的】 1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采 血技术。 2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。 3. 学习酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理，掌握间接ELISA的基本程序和结果判读 方法。 4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。 PartⅠ. NDV抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程 【原理】 新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合，血型系统最主要的类型为ABO血型系统，本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A（B）IgG抗体效价。 【试剂】 6%牛血清白蛋白；生理盐水；凝胶卡 【标本采集】 孕妇静脉血3毫升，肝素钠抗凝，孕妇爱人静脉血3毫升，肝素钠抗凝。将孕妇标本制作成血清标本，孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本（用生理盐水洗涤后配制）。 【操作步骤】 1．取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育30～60分钟；2．将血清倍比稀释成9管，依次为1：4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管；3．将卡作好标记，在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul； 4．然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本； 5．37度孵育15分钟（专用孵育箱）； 6．专用离心机离心5分钟；900rpm2分钟，1500rpm3分钟； 7．取出判定结果； 【结果判定】 阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中； 阴性结果：红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。 【结果报告】 产生1+阳性凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。 【注意事项】 1．红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。 2．血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。 3．如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所臻溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。 4．本凝胶卡价格不菲，成本较高，请您节约使用。 【临床意义】 有人观察1632例孕妇血清中IgG抗A（B）≥1：64者249例；ABO-HDN发生率随IgG抗A（B）效价升高而上升；HDN与妊娠史的频率有关，随着年龄上升，孕妇个体IgG抗A（B）抗体效价也随之上升。夫妇间ABO血型不合者应及时检查产前血型抗体水平，用于预防不良妊娠的发生；IgG抗A（B）效价的高低与HDN的发病率成正比；孕妇血清IgG抗A（B）效价≥1：64需定期检测抗体效价水平及时用药降低抗体效价，以预防新生儿溶血病的发生。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/ae5606913.html, 禽流感免疫抗体效价检测 作者：何生 来源：《湖北畜牧兽医》2013年第07期 摘要：为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解乌鲁木齐市米东区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区不同鸡场进行了禽流感抗体检测。结果表明，40只免疫鸡，免疫抗体 效价合格数33只，总合格率为82.5%。说明近几年对高致病性禽流感采取的强制免疫措施达到了比较显著的效果。 关键词：禽流感；免疫；抗体效价；血凝试验；血凝抑制试验 中图分类号：S855 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）07-0029-02 禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。禽流感病毒感染后，呈现出较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。禽流感病毒不仅能引起禽类严重的疾病，而且对人类和哺乳类动物也能造成感染。在世界各种家禽和野生禽类中，按照血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）表面抗原来区分，已发现了数千种属于许多不同抗原亚型的病毒。各种品种和不同日龄的禽类均可感染高致病性禽流感。该研究为掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效价，了解本地区鸡群禽流感免疫抗体水平，对该地区鸡场进行了禽流感抗体检测，并对不其检测结果进行了对比分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物 40只鸡由米东区铁厂沟镇大草滩村养禽场提供。 1.1.2 试剂禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验阳性血清，1%鸡红细胞悬液。 1.1.3 仪器 96孔V型微量反应板、台式离心机，单道、多道微量可调移液器，吸嘴，微量振荡器，加样槽。 1.2 方法 1.2.1 血凝（HA）试验在微量反应板的1～12孔均加入0.025 mL的PBS，换滴头，吸取0.025 mL病毒悬液加入第1孔混匀，从第1孔吸取0.025 mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入第3孔，依次倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025 mL弃之，换滴头，每孔再加入0.025 mL PBS。每孔均加入0.025 mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液，充分混匀后加入。在微量振荡器上振荡2 min，在25 ℃恒温箱内静置40 min后观察结果。
医疗机构输血科（血库）建设管理规范 （征求意见稿） 一、总则 第一条为了加强医疗机构临床输血管理，规范输血科（血库）建设，保证临床用血安全，根据《中华人民共和国献血法》、卫生部《医疗机构临床用血管理办法（试行）》及《临床输血技术规范》等有关规定，结合我省实际，制订本规范。 第二条输血科（血库）是医院开展输血相关诊疗活动和提供其它输血服务的科室。本规范是医院输血科（血库）建设管理的基本标准，是对医院输血科（血库）检查评价的基本依据。 第三条本规范包括医院输血科（血库）科室设置、功能与任务、建筑与设施、人员配置、仪器设备、原辅材料、安全卫生、业务管理、计算机管理和质量管理等。 第四条医疗机构应当加强临床输血管理，设立由院领导、业务主管部门、相关科室负责人及专家组成的临床输血管理委员会，贯彻落实临床用血相关法律法规，规范、指导和监督临床用血工作；协调处理临床用血工作中的重大问题；开展临床科学、合理、安全用血的教育和培训。 二、科室设置 第五条医疗机构开展临床输血业务，应设置输血科、血库或指
定相关科室负责。 第六条三级综合医院、年用血量大于5000单位的三级专科医院和二级综合医院应设置独立建制的输血科；未设置输血科的二级及以上医院应设立独立血库；二级以下医院应由检验科负责开展临床输血业务，并参照血库标准进行建设管理。 三、功能与任务 第七条输血科在医院临床输血管理委员会的领导下，负责医院临床用血管理，指导临床输血技术应用，参与临床输血会诊，配合临床实施输血治疗，开展输血科研与教学。 血库在医院临床输血管理委员会的领导下，负责医院临床用血管理，推广临床输血技术应用，参与临床输血会诊。 第八条根据临床用血需要，制定用血计划，定期向供血机构申报用血计划，做好血液储存、发放工作。 第九条按照卫生部《临床输血技术规范》的要求，为临床输血提供血型鉴定、交叉配血、血清抗体筛选和输血相关实验室诊断。 第十条对输血工作实施全面质量管理，加强血液质量控制。 第十一条负责临床用血制度执行情况的监督检查，开展临床输血疗效的评估，建立临床输血预警系统。 第十二条及时向供血机构反馈血液质量和服务质量等问题。 第十三条做好无偿献血、互助献血、临床用血政策的宣传，并配合做好相关事宜。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体
ELISA双抗体夹心法检测抗原 实验时间：实验地点：实验人： 1实验目的 1.阐述ELISA（酶联免疫吸附测定）的原理，列举ELISA类型 2.完成ELISA的基本操作 3.学会分析实验结果 4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程 2实验原理 ELISA：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。 ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知道抗体吸附于固相载体上，加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。然后洗涤，再加入酶标抗体和底物进行测定。但该方法只适用于检测多价大分子抗原，不适合检测小分子半抗原。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析，可以间接放大免疫反应结果。所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 3实验材料 1.酶标反应板（包被有抗CEA抗体） 2.CEA标准品（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml） 3.样品1和样品2 4.酶标抗体（酶结合物） 5.底物液A和底物液B（显色剂A和B） 6.终止液 7.洗涤液