分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具
有各自的优点和不足。其特点比较见表一。
1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA 酶切片段，通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。
2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)
20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。
RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补
于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物，扩增原来模板DNA，产生SCAR-DNA片段。相对于RAPD，SCAR由于使用更长的引物和更高的退火温度而具有更高的可靠性和可重复性，对反应条件不敏感，且可以将显性RAPD标记转变为共显性的SCAR标记，从而提高遗传作图效率。此外，还有任意引物PCR标记(Arbitary primer，AP-PCR)技术和DNA扩增指纹(DNA Amplified fingerprinting，DAF）技术，前者使用20或30bp的任意引物随机扩增基因组DNA，后者用5或8bp的任意引物随机扩增基因组DNA。这些技术彼此相似，都能提供DNA的多态性信息，用于遗传图谱构建或基因定位等。当然RAPD标记技术使用最广泛。
3 简单重复序列标记(Simple Sequence Repeat，SSR)
1982年，Hamade等人发现了简单重复序列标记(SSR)技术，或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence，MS)，或短串联重复标记( Short Tandem Repeat，STR)。真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列[5]。按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星DNA（基序100-300bp）、小卫星DNA（基序10-60bp）、微卫星DNA（基序1-6bp）。和中卫星DNA（由不同大小串联重复组成）等。微卫星是由DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的。微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将期间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以得到其长度的多态性，此即SSR标记的原理。SSR 标记具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点，但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆和测序分析，以便设计相应的引物，这是非常费时、费力和代价昂贵的工作，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的，因而给它的利用带来了一定困难。
简单重复序列间区标记(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)可以克服以上提到的SSR标记的缺点，或称锚定简单重复序列标记(Anchored Simple Sequence Repeat，ASSR)。在SSR序列的3’端或5’端加上一个2-4bp的随机核苷酸，形成微卫星DNA的锚定引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过电泳可分辨，呈现出扩增带的多态性。该方法不需知道DNA序列即可用锚定引物扩增。
4 扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)
1993年，荷兰科学家Zbaeau和Vos发现了一种检测DNA多态性的新方法，即扩增片段长度多态性标记(AFLP)。AFLP
是RFLP与PCR相结合的产物，其原理是先用两种限制性内切酶(低频剪切酶和高频剪切酶，前者识别为点为6bp，后者为4bp)双酶切基因组DNA产生不同大小的DNA片段，酶切产物玉双链人工接头连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1-3bp选择性核苷酸作引物对模板DNA 再进行选择性扩增，电泳分离获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别位点序列、引物3’端的选择碱基序列(1-10bp)。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优势，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。
5 表达序列标签标记（Expressed Sequence Tag，EST）
1991年，Adams等人用EST对表达序列进行了研究，他们从人脑cDNA文库中随机挑取600个克隆，测序合成EST，从而发现了一系列在脑部表达的新基因并由此建立了表达序列标签标记(EST)技术。其原理是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克隆，对其3’端或5’端进行序列，得到的序列与数据库中已知序列比对，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等生命过程的认识。ES T即是通过从cDNA文库中随机挑取的克隆进行测序后所得的部分cDNA的3’端或5’端序列，一般长为300-500bp。每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。EST 标记分为两类：一是以分子杂交为基础，用EST本身作为探针和经过酶切后的基因组DNA杂交而产生；二是以PCR为基础，按照EST的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行PCR扩增而产生。利用EST标记，对EST序列进行分析可得到大量的基因表达信息。与其他分子标记相比，EST 标记的优越性在于直接与一个表达基因相关，且大量的EST可累积建立一个新的数据库，为表达基因的鉴别等研究提供大量信息。由于EST来源于cDNA克隆，因此它部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式。通常EST还可在Gen Bank及PIR(Protein Information Resource，PIR)等数据库中进行比较分析,以获得其可能的功能、表达模式等信息。但EST标记所获得的基因组信息不完整，因为如调控序列、内含子等序列并不在EST序列中。且EST标记需要进行大批量的测序，实验费用较高。
6 单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)
1998年，在人类基因组计划的实施过程中产生了单核苷酸多态性标记(SNP)技术。SNP是指在基因组中同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失产生的DNA序列多态性。以这样的DNA序列多态性特征作标记即可区分两个个体遗传物质的差异，此即SNP标记的原理。SNP标记的优点在于多态性数量很丰富；广泛分布于植物基因组中；与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的。结合基因芯片技术后可快速、规模化的筛查不同个体的遗传多样性。但其在应用中还存在一些问题，如SNP作图时需要大量的有代表性的个体，因此需要进行大量的单个扩增反应，且得到大量的SNP信息后，难以确定用哪个SNP解决错误的遗传问题。
7 相关序列扩增多态性标记( Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP)和目标区域扩增多态性标记(Target Region Amplified Polymorphism，TRAP)
2001年，美国加州大学蔬菜作物系的Li与Quiros博士提出了一种基于PCR的新型分子标记技术，即相关序列扩增多态性标记(SRAP)技术。其原理是通过设计一对特异的引物对基因组的外显子、内含子和启动子区域进行PCR扩增，扩增产物通过电泳分析后可显现出因个体不同及物种的内含子、启动子和间隔序列不同而产生DNA多态性。SRAP上游引物长17bp，其中5’端的前10bp是一段没有任何特异性的填充序列和紧接着它的CCGG序列共同组成核心序列，在3’端有3个选择碱基。下游引物长18bp，其中核心序列包括11bp的填充序列和AATT特异性序列，在3’端同样有3个选择碱基。上游引物中的CCGG序列可与开放阅读框区域中的外显子特异性结合，下游引物中的AATT序列特异结合于富含AT区的内含子和启动子。这样的上下游引物可以同时对外显子、内含子和启动子区域进行特异性扩增。SRAP 作为一种新型的分子标记，其优点是多态性高；具有高频率的共显性；相对于类似RAPD、ISSR的显性标记，SRAP能提供更多的遗传信息；DNA需要量少，仅需20-30ng，并且对DNA纯度要求低；更简单，检测方法多样化；与AFLP相比，不用酶切、连接、预扩等步骤；同时SRAP扩增产物检测可以用变性聚丙烯酰胺凝胶，也可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶；花费少，改变SRAP引物3’端的3个选择性碱基可设计大量的引物序
列，同时上游引物与下游引物可以自由组合，因此，大大减少了合成引物的费用，同时也提高了引物的使用率。
2003年，美国农业部北方作物科学实验室的Hu和Vick又提出了基于PCR技术和EST的目标区域扩增多态性标记(TRAP)技术。TRAP标记即是以EST的序列设计引物，对基因组特殊区域进行PCR扩增而产生的分子标记技术。其原理是利用两个长度为16-20bp的固定引物和一个随机引物进行组合，固定引物主要是根据从EST数据库中选择的所需序列来设计，随机引物的设计与SRAP引物设计方法相似，可与内含子或外显子进行配对。以目标区域为模板，可扩增出围绕目标候选基因的序列，产生TRAP 多态性。TRAP与RAPD、ISSR、AFLP及SRAP等标记的不同主要在于TRAP的固定引物设计时需要知道所研究植物的EST序列信息，但相对于RAPD、AFLP等标记，TRAP标记具有操作简单、重复性好、多态性高、效率高等优点。
表一常用分子标记技术特性的比较
注：表中“-”指未找到数据或不需使用。
分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原
分子标记 3分（内容丰富） 编辑词条 分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。 摘要 Molecular Markers 【分子标记的概念】 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来
微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。 关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1] 。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且 通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2] 。（AT）n和（ATT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA）n和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。 Weber[6]将微卫星分为3类：完全重复（无间隔）、不完全重复（有非重复单位的碱基间隔）和复合重复（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）。这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其他未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异[7]。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有2.5×10-5~1×10-2突变，因此造成了它们的多态性。但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。Davierwala等对水稻及其近缘种利用（GATA）n和（AC）n微卫星两侧的序列合成的引物进行PCR扩增，再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。测序分析的结果表明，不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。 尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚，但许多研究已经证明，重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记，是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。微卫星序列的重复单位小，而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性，因此得到了广泛的应用。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方
法和电泳技术有一定难度 分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。 (1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。 几种主要的ＤＮＡ分子标记
分子标记概述 遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。 早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。 与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 分子标记种类 利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本与使用成本尽量低廉;⑧在实验室内与实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点与 不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理就是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA 酶切片段,通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。进行RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境与发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型与杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。其缺点就是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理就是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量与大小发生改变,表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性与基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性与重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子与杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆与测序,设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物,扩增原来模板DNA,产生SCAR-DNA片段。相对于RAPD,SCAR由于使用更长的引物与
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
食安0801 02 邓凯 近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（genetic markers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。 分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点： ①多态性高； ②遍布整个基因 ③检测手段简单、迅速； ④无基因多效性； ⑤能够明确辨别等位基因； ⑥实验重复性好； ⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。 第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写 20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。目前有2种方法可进行DNA的RFLP 分析：一是根据其原理用RFLP的探针进行特殊基因的DNA克隆、cDNA克隆、随机的基因组DNA克隆和合成的低聚核苷酸克隆；二是对那些分子量较小的DNA样本（如线粒体DNA、核糖体DNA等），可在酶切后对其产物直接电泳，将不同大小的限制性酶切DNA 片段分离，从而得到该DNA的RFLP图谱。RFLP标记呈孟德尔式遗传，大多数RFLP 的等位基因为共显性，在任何分离群体中能区分纯合基因型与杂合基因型。但该技术在 操作过程中涉及了DNA的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和Southern杂交等一系列分子生物学技术，步骤繁杂，工作量大，且分析中需要的DNA量大，因此在很大程度上限制了RFLP技术的应用。 第2代分子标记（以PCR技术为核心）包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）、TRAP（Target Region Amplification Polymorphism，目标区域扩增多态性）等分子标记。利用PCR技术的忠实性、效率和特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作，同时也降低了对样品数量和质量的要求，通常用几十纳克（ng）以内的DNA样品就可满足分析的需要。这对于分子标记辅助育种、QTL定
分子生物学常用实验技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分子杂交技术 第十章测序技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检