小鼠胚胎培养方法的研究
摘要
目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。
方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵
山西医科大掌
裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。
结果：
一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。两组比较有显著性差异。２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。与对照组比较有差显著性异。３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。与对照组无显著性差异。
二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。
三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组
中的调亡速度明显低于对照组，有显著性差异，而血清组中鼠胚的调亡速度低于对照组，但无显著性差异。
四、小鼠胚胎在血清加卵泡液组中发育到８－ｆｌＩｊ胞划，桑椹胚，囊胚及孵化胚胎的比率分别是７２．７％，６２．３％，５１２％和２８．５％，在血清加条件培养液组中则分别有７４．１％，６８．５％，６２０％和３５．２％发育至８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化胚胎。各组与血清组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。
结论：早孕蜕膜细胞能释放某些刺激胚胎发育的物质，可以促进胚胎体外发育，并提高胚胎发育质量。卵泡液对早期胚胎发育有促进作用，早期胚胎培养中，在培养液中添加人卵泡液对提高早期胚胎培养质量有显著的效果。
关键词：胚胎发育条件培养液卵泡液血清
山西医科大掌硕士掌位论文
Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆ
ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ
●
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｎｓｅａｒｃｈｔｈｅｂｅｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｏｆｅｍｂｒｙｏｓｉｎｖｉｔｒｏ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｔｈｅｏｒｙｔｈａｔｃａｎ
ｏｆｉｍｐｒｏｖｅｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｉｌｅｏｕｔｃｏｍｅｓ
ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ—ｅｍｂｒｙｏｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＶＦ?ＥＴ）
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｓａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｈｕｍａｎｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄ（ＨＦＦ），ｓｅｒｌａｍａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅａｄｄｅｄｔｏＥａｒｌｅ
ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１６７８ｎｌｏｕｓｅｏｖｕｍｓｗｅｒｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｎ２－ｃｅｌｌｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｓｅｍｅｄｉｕｍ．Ａｎｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅａｂｏｖｅｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅｃｌｏｓｅｌｙｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｔｉｌｅｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅ，
ａｎｄｃｌｅａｖａｇｅｒａｔｅａｎｄｓｐｅｅｄ，ｇｏｏｄｅｍｂｒｙｏｒａｔｅ，ｍｏｒｕｌａｒａｔｅ
ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｒａｔｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ
山西医科大掌硕士掌位论文Ｒｅｓｕｌｔｓ：
一‘、１、Ａｍｏｎｇｔｈｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｎｅｄｉｕｍ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ７２９％，６６０％，６Ｉ．６％ａｎｄ３２．Ｉ％ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏ８－ｃｅｌｌｓｔａｇｅ，ｍｏｒｕｌａｓｔａｇｅ，ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅａｎｄｈａｔｃｈｉｎｇ，ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（４３．６％，３０．９％，１９．１％．５．５％．Ｐ＜Ｏ．０１），２、ＨＦＦｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｆｒｏｍｔｈｅ２－ｃｅｌｌｓｔａｇｅｔｏｔｈｅ８－ｃｅｌｌｓｔａｇｅ（７１３％），ｍｏｒｕｌａｓｔａｇｅ（５８．８％），ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅ（５０．０％）ａｎｄｈａｔｃｈｉｎｇ（２５．７％、ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０１）．３、ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｂｏｕｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅａｃｈｓｔａｇｅｏｆｅｍｂｒｙｏｓｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ（５３．４％，４０．５％，２９．３％，７．８％）ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＞０，０５）
二、Ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍａｂｏｕｔｔｉｍｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ａｂｏｕｔｃｌｅａｖａｇｅｒａｔｅａｎｄｇｏｏｄｅｍｂｒｙｏｒａｔｅ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎＨＦＦａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｒｂｅｔｗｅｅｎｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ，ｂｕｔｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍａｎｄｃｏｎｔ０１．ＥｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＨＦＦｇｒｏｕｐａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｇｒｏｕｐｃｌｅａｖｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｆａｓｔｅｒｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｓｈｏｗｅｄｎｏｏｒｌｅｓｓ
山西医科大掌硕－＆－学位论文ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ
三、ＨＦＦｇｒｏｕｐａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｇｒｏｕｐｃｏｍｐｍｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒ０１．ｓｉｇｎｉｌｉｃａｎｔｄｉｌｌ’ｅｌｅｎｔｗｅＩ‘ｅＩｂｔｍｄｉｌ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅｍｂｒｙｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｏｎｔｈｅｃｏｎｔｒａｒｙ，ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏ
ｅｍｂｒｙｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｅｒｕｍａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ
四、ＷｈｅｎＨＦＦａｎｄｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｗａｓａｄｄｅｄｔｏｓｅｒｔｌｌｎｇｒｏｕｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅｈａｖｅｂｏｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｅａｃｈｓｔａｇｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｓｅｌｑ．１ｍｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．Ｏ１）
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｄｅｃｉｄｕａｌｃｅｌｌｃａｎ
ｒｅｌｅａｓｅｓｏｍｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｔｈａｔｃａｎｓｕｐｐｏｒｔｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｏｆｅｍｂｒｙｏｓｗｉｔｈｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｙｉｅｌｄａｒｅａｓｏｎａｂｌｅｎｕｍｂｅｒ
ｈｕｍａｎｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｇｏｏｄｑｕａｌｉｔｙｕｐｔｏｔｈｅｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｔａｇｅ．Ａｎｄ
ｆｌｕｉｄｉｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｎｌｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｉｎｖｉｔｒｏ
ｄｅｃｉｄｕａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｍｂｒｙｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｍｅｄｍｍｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｆｌｕｉｄｓｅｌｑ．１Ｕｌ
６
山西医科大掌
日ＩＪ吾
不孕症一直以来都是困扰医生和患者的一个难题，医学界对不孕症己进行了多年的探索和研究。掘ＷＨＯ估计，眦界范围内共有８％．１０％的夫妇存在不孕问题。自从１９７８年世界上第一例试管婴儿诞生后，至今全球已有数万例试管婴儿诞生，但世界上试管婴儿中心活产率仅有１０％左右，其原因除子宫内膜准备不充分外，另一重要原因是胚胎质量差。因此受精卵的体外培养就成为生殖医学中一个重要而基础的问题，适宜的培养体系也是动物胚胎生物技术、胚胎分割、胚胎克隆、胚胎嵌合等的基础条件和有效工具。而且，胚胎发育至桑椹胚或囊胚阶段，胚胎移植妊娠成功率会大大增加。这就要求，早期胚胎的体外培养多达７ｄ之久。然而，常规体外培养的胚胎发育率低，胚胎质量差，为解决这一难题，研究者们不断探索改进胚胎体外培养的技术方法。
最早用来研究受精卯体外培养的介质是生理盐水，受精卵很快死亡。为了更明确地知道受精卵存活发育所需物质及
其代谢及微环境等，研究者们从６０年代起进行了近４０年的研究，主要从两个方面迸行：（１）改良培养液的成分。（２）利用各种辅助细胞建立联合培养体系。体外培养需要在合成培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液，如胚胎没澉、ｆｆｎ．消博／｛’能支持；１４ｉ；ｌｆｆ－矧ｌＪ地的化Ｋ增ｍ。，人类胍胎礼ｆ０统培养液中培养，仅有１５％一２０％的胚胎能发育到囊胚期，大多数胚胎在传统培养液中培养到ｄ５即终止发育。而在条件培养基中，体外受精率有所提高１１Ｉ，而且具有增强胚胎活力，改善形态结构以及提高着床率和中、晚期妊娠率的作用１２１。在合成培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液除了提高胚胎卵裂率及囊胚形成率外，还有以下作用：１、可用于胚胎筛选，即随着培养时间的延长，质量好的胚胎继续发育，质量差的胚胎停止发育，为筛选优质胚胎提供了条件：２、有利于显微操作后胚胎的修复；３、为冷冻复苏后的胚胎提供恢复时间；４、改善胚胎质量。本文在培养液中分爿ＪＪＪＤ入蜕膜细胞条件培养液、卵泡液及血清，以探讨不同培养液对早期鼠胚体外发育的机理。
在过去几十年里，小鼠基础生殖研究为人类生殖医学提
山西医科大掌硕士学位论文供了丰富的理论基础和实践指导，导致了人类相关研究的一系列进展和成就。本文的目的旨在以小鼠为试验动物模型，分析小同培养液的质量和效果。从啪．、Ｊ找胚胎培养的山支ｔｊ二培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。但是，直到今天我们对受精卵发育所需物质和生长的微环境的了解还远远不够。人们对不同培养体系促进受精卵发育的机理仍知之甚少，这些都有待更加深入的研究。
材料与方法
一、实验动物
选用山西医科大学实验动物中心提供的性成熟的昆明白小鼠，其中，雄性４０只，体重３０—４０９，雌性１００只，体重２５－３０９，鼠龄６?８周。
二、主要试剂
１、Ｅａｒｌｅ试剂、胶原酶、透明质酸酶：购自美国Ｓｉｇｍａ公司。
２、人绝经期促性腺激素（ｈＭＧ）和人绒毛膜促性腺激
山西医科大学硕士掌位论文素（ｈＣＧ）：购自丽珠制药有限公司。
３、胰蛋白酶：购自上海第二生化制品公司。
４、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ＳＦ－－１２：购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。
三、主要仪器
二氧化碳孵箱（Ｓ１１ｅＪ—ＬａｂＴＣ２３２３，美国）、解剖显微镜（Ｍｏｔｉｃ，日本）、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜（ＩＸ７０，日本）、离心机、水浴锅
四、实验方法
１、人卵泡液的采集与处理
在取卵日，选择３５岁以下，月经规律，无免疫及不明原因不孕病史的患者，选直径１８ｍｍ，内含健康成熟卵子的卵泡取卵泡液，放在１０ｍｌ尖底离心管内离心，３０００ｒ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ。取出上清液，置５６口水浴锅灭活３０ｍｉｎ，０．２ｐｍ滤器过滤除菌。
２、人ｍ清的采集１ｊ处理
ＩＶＦ者注射人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）后第２天，早晨空腹抽血１０ｍｌ，置室温２０ｍｉｎ后离心，３０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ。吸出上清液，再离心３０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，取出上清液，于５６
口水浴锅灭活３０ｍｉｎ，直径０．２ｕｍ滤器过滤除菌。
３、人类蜕膜细胞条件培养液的制各
对早孕人工流产健康妇女，于术巾用无菌瓶收集蜕膜标本．置于盛有１００ｕ／ｍｌ青霉素，１００９／ｍｌ链霉素的－４口的Ｄ—ＨａｎｋＳ液中．即刻送至实验室消化培养。复合消化酶由Ｏ．２５％胰蛋白酶、０．２％透明质酸酶和Ｏ．２％胶原酶按２：ｌ：２的比例（ｖ／ｖ）混合而成。消化时间３０．４０ｒａｉｎ，消化后细胞接种于ＦＤ液中进行培养，过夜换液清除污染的红细胞和未贴壁成分。当细胞长至８０％融合时，收集培养上清液，３０００ｒ／ｍｉｎ离心，０．２１ａｍ滤膜过滤，作为条件培养液备用
４、超排卵治疗及卵子的获得和处理：每只雌鼠腹腔内注射人绝经期促性腺激素（Ｉ－ＩＭＧ）１０ＩＵ，４８小时后腹腔内注射绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）１０ＩＵ，于第二次注射后１４．１９ｈ脱颈椎处死。无菌操作下迅速取出双侧输卵管，显微镜下观察，撕开膨大部采集卵子，将收集到的卵子置于培养液中，在３７０含５％ＣＯ，的培养箱中２—４ｈ。培养液提前１６ｈ完成配制，放入３７［３，５％ＣＯ，培养箱中平衡。
５、精子来源及处理：取雄性成年小鼠脱颈椎处死后打
开腹腔，取出附睾，轻压附睾尾部，精子自然流出。使获得的精子在培养液中于３７口，５％Ｃ０，培养箱内培养２ｈ以上。
６、授精：Ｈ义卵后４—６１１’加入柑子进行授粘培养。６－８ｈ后取出有２个原核和极体的受精卵移入不同培养液中继续培养。
７、结果观察：每曰取出培养皿用倒置显微镜观察胚胎发育情况并记录拍照。
８、胚胎质量的评估：授精后４０ｈ检查卵裂情况与胚胎质量。卵裂率是根据受精后卵裂时期ｉ，１ｚ估，胚胎质量根据无核碎片占整个胚胎的比例以及卵裂球大小是否均匀，将胚胎质量分为ｖ级，口级为均匀卵裂球，无碎片：口级卯裂球大小均匀，裂片＜２０％：口级卵裂球大小不均匀，碎片＜２０％：口级卵裂球大小均匀或不均匀，碎片２０％．５０％；口级卵裂球大小均匀或不均匀，碎片＞５０％。卵裂球大小均匀，形态规整且碎片＜１０％的胚胎为优质胚胎，如图１１。
９、结果评价指标：统计卵子受精率、受精卯的卵裂率、优质胚胎比率、桑椹胚及囊胚形成率，以及早期胚胎在不同培养液中调亡的比较。
硕士掌位论文五、数据统计与检验
采用ＳＰＳＳ统计软件处理：数据采用百分数表示，用Ｘ：分期Ｊ榆验处删符２１【数据，Ｘ２分荆榆验足川，Ｊ：多个试验纠【和?个对照组的比较的方法，其中ａ＝Ｏ．０５，ａ‘＝ａ／ａ（ｋ．１），ｋ为率数。ｔａ？＝７．８８。
结果
一、小鼠早期胚胎在不同培养液中受精及卵裂率的比较
授精后８ｈ检查受精情况。正常受精的标准：见到两个独立的或有碎片的极体，同时有两个清晰的原核，如图４。授精后卵细胞在不同培养液中的受精率无显著性差别。受精后的鼠卵在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中的卯裂率是１００％，而在对照组和血清组中分别是９２，４％、９６．７％，各组分别与对照组进行Ｘ２分割统计分析得：卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组与对照组比较有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），血清组和对照组比较无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。优质胚胎的形成率在卵泡液组和条件培养液组中显著高于对照组，有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１），而血清组的优质胚胎形成率与对照组比
较无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５）。另一分组中，血清加卵泡液组的卵裂率和优质胚胎形成率分别为１００％和９４．６％，血清加条件培养液组则分别为１００％不ｎ９５．４％，两组分别，ｉｊ血消组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。见表１、２。
表ｌ：鼠卵在血清组、卵泡液组和条件培养液组
中受精及卵裂的比较
＋：Ｐ＜Ｏ．Ｏｌｐｓ对照组
表２：鼠卵在血清组、血清加卵泡液组和血清加条件培养液组
中受精及卵裂的比较
＋：Ｐ＜Ｏ０１ｗ对照组
二、不同培养液对小鼠早期胚胎发育的影响
每日用倒置显微镜观察可见：卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组的胚胎２４ｈ小时后大部分发育到８细胞期，４８ｈ发
育到桑椹期，７２ｈ可形成囊胚，９６ｈ可有囊胚孵出，在计算囊胚孵出率时，以培养１２０ｈ的鼠胚为准，囊胚孵化率在卵泡澉纰和蜕腆细胞条仆培养液纠川?发别口Ｊｊ厶剑２５．７％和３２ｌ％。而对照组的胚胎发育速度明显缓慢，培养２４ｈ仅有９６个２细胞胚胎发育至８细胞期胚胎，４８ｈ有３０．９％发育到桑椹胚，７２ｈ仅有】９．】％发育至囊胚期，９６ｈ后偶可见有囊胚孵出。在相同时间内，卯泡液组和蜕膜细胞条件培养液组分别与对照组比较，２细胞期发育至８细胞期数，差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。从２细胞期至桑椹胚和囊胚及至囊胚孵出，两者间差异均有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）。在血清组中，从２细胞期至８细胞期，桑椹胚，囊胚及孵化囊胚，发育速度均比对照组快，胚胎发育率也均高于对照组，但无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０１）。在另一分组中，鼠胚在血清加卵泡液组中分别有７２．７％，６２．３％，５１，２％和２８．５％发育到８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化囊胚，而在血清加条件培养液组中则分别有７４ｌ％、６８．５％，６２．Ｏ％和３５，２％发育至８．细胞期，桑椹胚，囊胚和孵化囊胚。各组与血清组比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。不同培养液对鼠胚发育的影响见表３、４。
表３：鼠胚在血清组、卵泡液组和条件培养液组中发育的比较组别２细胞朗
８嬲桑｝期王囊胚孵懈ｘｄ：｝！髫Ｒ２２０９６（４３０６８（３０９）４２（１９１）１２（５５）
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２３２１２４（５３４）９４（匏５）６８（２９．３）１８（７８）卵泡液组２７２１９４（７１．玎１６０（５８．８）．１３６（５００）‘
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三、小鼠早期胚胎在不同培养液中的凋亡
每日用倒置显微镜观察，鼠胚在４８ｈ和７２ｈ内，在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中无凋亡，在９６ｈ，１２０ｈ和１４４ｈ之后也仅有少量胚胎的凋亡。而对照组中，４８ｈ即有２０个胚胎的凋亡，．Ｉ－胚胎数的９１％，７２ｈ之后凋亡数更多。在相同时间内，鼠胚在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组的凋亡数和对照组中的比较均有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０１），而血清组与对照组比较无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），见表５。ｆ６
山西医科大掌硕士掌位论文蝴２３２）６（ｚ６）１６（６９）３０（１２９）４６（１９８）７８（３３回
刘Ｊ！ｌ｛组ｌ（２２０９１５（６８）２２（１００）４０（１８２）５４（２４．５）６２（２８２）Ｆ啪蛳７２）ｏ（ｏ）‘ｏ（ｏ）‘４０．５）’２６（９６）‘４８（１７．６）’剩蠢雾嚣１８）㈣‘㈣‘６（１８）‘２ｓ（８８）‘删５）‘＋：Ｐ＜０．０１ｗ对照组
讨论
一、鼠卵在不同培养液中受精及卵裂的ｂ匕较
胚胎质量对妊娠结局有很大的影响，因此，一种准确反应胚胎质量的方法对任何一个ＩＶＦ实验室都是必须的。目前各个ＩＶＦ实验室广泛采用形态学标准来判断胚胎的质量，可较好的预测胚胎的种植。胚胎形态学分级要考虑几个参数：分裂球的数目、对称性、细胞外碎片的大小和多少ｆ３’４ｌ。目前采用的胚胎分级方法ｆ５】能较好的反映胚胎质量。本研究根据早期胚胎无种属要求的特性，采用将人卵泡液、人蜕膜细胞条件培养液和人血清加入培养液中，成功进行了小鼠胚胎培养方法的研究。
由表１、２可以看到培养液中加入卵泡液和蜕膜细胞条件培养液均有利于鼠卵的分裂和优质胚胎的形成。实验结果提爪，卵泡液和蜕腆细胞町促进鼠胚发育为优质胚胎。此结果与国外报道基本～致。
蜕膜细胞含有多种促进胚胎发育的物质，不仅能加速胚胎的分裂，而且能使胚胎较好的发育。蜕膜细胞内存在大量糖原和脂肪提示蜕膜有营养功能。蜕膜细胞条件培养液中含有细胞分泌的一些生物活性物质，对胚胎发育有利。Ｄｅｓａｌ等【６Ｉ利用酶联免疫测定（ＥＬＩＳＡ）技术证实子宫蜕膜细胞能分泌胚胎发育所需的生长因子／细胞因子，如血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、白细胞介素６（ＩＬ．６），已证实这些因子皆可促进胚胎发育。条件培养液中含有细胞分泌的生物活性物质。
卵泡液由血浆渗出物和局部的分泌物如氨基多糖和类固醇激素等组成。早在１９６９年，人们就开始研究动物的卵泡液对精子的影响，许多研究结果表明，卵泡液能刺激精子的活力、诱导精子的运动、促进顶体反应并吸引精子向卵子移动，介导精子穿卵【７－９ｌ：卵泡液还能刺激卵子成熟【１０１、提高
山西医科大掌硕士掌位论文受精率…ｌ、阻止透明带硬化【１２】。卵泡液中存在某些促进哺乳动物胚胎发育的生长因子，如ＥＧＦ、胰岛素样生长因子（Ｉ（ｊＪ氓ｊ：０化７１－Ｋ…Ｊ：（ｒＩ（ｊＩｉ），ＪＬ作川化｛Ｈ人删艘卜决定竹胍胎能否发育到囊胚期以及优质胚胎形成的数量。
二、不同培养液对小鼠早期胚胎发育的作用
对昆明鼠是我国目前使用广泛的一种远交品系小鼠，其早期胚胎在体外培养中表现出严重的２细胞阻滞现象ｌ＂１。本实验研究显示：鼠胚在卵泡液组和蜕膜细胞条件培养液组中发育速度和囊胚及桑椹胚形成率与对照组比较有显著性差异，提示卵泡液和蜕膜细胞可促进鼠胚的发育。在培养基中补充一定量的生物性体液或组织提取液能促进胚胎发育的机理至今不明，推测可能与以下因素有关：（１）在培养环境中存在某些对胚胎有营养作用及促进胚胎发育的成分，如白血病抑制因子、营养细胞分泌生长因子、细胞因子及其他蛋白，表皮生长因子等：（２）去掉某些毒素、重金属及代谢性抑制因子：（３）可以产生低氧环境，促进胚胎发育：（４）培养环境不受上皮细胞或纤维母细胞的限制，无种属特异性。
１、蜕膜细胞促进胚胎体外发育的机理：自然状态下，
卵受精发生在输卵管壶腹部，受精ｄ３时形成一个由１２一１６个细胞构成的实心胚即桑椹胚，桑椹胚继续发育，到受精后ｄ４发育成囊胚，火约在受精后ｄ６—７，胚胎开始植入，至ｄ１４完成植入。人类胚胎在体外培养，仅有ｌ５—２０％的胚胎能发育到囊胚期，大多数胚胎在体外培养到ｄ５即终止发育。因此，许多学者提出将胚胎与体细胞一起共培养，共培养体系是指把胚胎放在辅助细胞上共同培养，以促进胚胎发育。共培养所用的细胞有人输卵管壶腹部细胞【Ｈ１、Ｖｅｒｏ细胞【１５】、胎牛子宫纤维母细胞【１６Ｊ、牛输卵管上皮细胞１１７１、人子宫内膜细胞¨８１等，这些辅助细胞在不同程度上促进了胚胎的发育。本次实验的结果由表１、２可以看出，条件培养液组和血清加条件培养液组的鼠胚发育至各期的细胞数均较对照组有显著差异，提示，培养液中加入蜕膜细胞条件培养液有助于鼠胚的发育。此结果与张丽风等【１９１的报道基本一致。蜕膜细胞以其营养胚泡、调节内分泌、调控滋养细胞的侵入、防止胚胎被母体排斥等功能，成为一种被广泛采用的饲养细胞。蜕膜细胞不仅分泌胚胎营养物质，也能随着胚胎发育的不同阶段提供适当的微环境，通过代谢途径，清除培养液中对胚胎发
小鼠早期胚胎发育和胚胎移植 https://www.doczj.com/doc/b412253252.html,/4544.htm、 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。 小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤。下面以小鼠为例，介 绍哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程。 实验技术 一、人工催情和超数排卵 1. 小鼠的性别鉴定： 成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。 2. 人工催情： 成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。每头雌鼠注射PMSG 5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现 （图16.3）。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。在合笼后每天上午8-9 时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。 二、受精卵及囊胚的获得 1. 受精卵的获得： 将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。在腹部中央横剪一小口（0.5cm 宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出（图16.4，16.5），置于盛有培养液的表面皿中。在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（图16.6）。如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计 所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学 学生姓名 学生学号 指导教师 XXXX年XX月XX日 小鼠早期胚胎发育的研究 一、引言 胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。 动物胚胎的发育过程 虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。 受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界， 卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是
对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。 不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。 原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。例如由内胚层发展而来，具有具有多潜能性的的间叶细胞，可以分化成纤维母细胞、软骨母细胞、硬骨母细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、横纹肌母细胞、造血母细胞等等。 器官形成:外胚层、中胚层与内胚层形成各种组织和器官的过程，称为器官形成，也称做器官发生。以青蛙的胚胎为例，在器官形成的早期，外胚层会在突起之后向内凹陷，形成神经脊与神经管;中胚层则会形成中胚叶节(somite)与脊椎，中胚叶节包围的空间称为体腔。 小鼠应用于生命科学研究中已有上百年的历史，成为研究人类遗传疾病的最佳动物模型。它是最小的哺乳动物之一，体形小，易于饲养管理;繁殖和发育速度都特别快;性情温顺，胆小怕惊;对外来刺激极为敏感;便于提供同胎和不同品系动物;成雌鼠在动情周期不同级段，阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期性变化，且市场价格较低，。虽然小鼠和人类在体型大小和形态上相差很大，但在生物进化上非常接近。所以以小鼠作为研究人类遗传疾病的材料最为合适。
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。
Protocol Fetal Thymus Organ Culture INTRODUCTION The generation of functionally competent T-cells from their progenitors involves a series of developmental events including proliferation, differentiation, and survival. T-cell development is a non-cell-autonomous event, and requires interactions with thymic stromal cells. Fetal thymus organ cultures provide an in vitro system in which isolated embryonic thymus lobes can be maintained in culture, allowing the study of T-cell development as well as thymic stromal cell function. This system remains the only in vitro system that supports a complete program of T-cell development, including positive and negative selection of the developing T-cell receptor repertoire. Modifications of the basic fetal thymus organ culture system, such as hanging drop cultures and reaggregate thymus organ cultures, provide useful systems to analyze thymus colonization and thymic stromal cell function, respectively. MATERIALS Reagents All media should be prewarmed to 37°C before use. 10% CO2 in air, contained in gas cylinder 2'-deoxyguanosine (dGuo) (Sigma-Aldrich, D0901) Prepare a 9 mM stock in 1X PBS. It takes ~1 h at 37oC for the dGuo to dissolve. Mix the solution well during this period.Dilute the dGuo stock to a final concentration of 1.35 mM in1X PBS (see Step 3). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) for thymus organ culture 70% ethanol Mice, pregnant female (gestational age E14-E16) 1X PBS (Ca++/Mg++-free) RF10-H medium 10X trypsin (Sigma-Aldrich,T4674)
江丙农业学报2010，22(12)：144～146 A c t a A g r i c uhu r ae J i an gxi 小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究 林峰，陈玉霞+，孙克宁，杨婷，田晓军 (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002) 摘要：为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响，分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明：子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0．01)，而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P< O．05)，两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P>0．05)，说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著，且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明：超排处理后，在公母鼠合笼后76～79．5h采胚，胚胎大多处于桑椹胚期，而在公母鼠合笼后88～91．5h采胚，胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期；采用TC M l99+15％胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。 关键词：小鼠；超数排卵；早期胚胎；体外培养；冲胚方法 中图分类号：Q132．8文献标识码：A文章编号：1001—8581(2010)12—0144—03 St udy on E f f ect of Super ovul a t i on and i n vi t r o C ul t ur e of Ear l y Em br yo i n M ous e LI N Fe n g，C H E N Y u—xi a‘，SU N K e—ni ng，Y A N G Ti ng．T I A N X i ao—j u“ (C ol l ege of A n i m a l H us ba ndr y a nd V et er i nar y M e di ci ne，H enan A矛c ul t ur al U ni ver si t y．Z he ngzhou450002，C hi na) A bs t r act：I n t hi s paper．t he e ffe c t of dif f erent m e t h ods of c o l l ec t i n g e m br yos on t he s uper ovul at i on of m i c e w a s s t udi ed，and t he e m br yos i n t he suoer ovul at ed m i Ce w er e coll ected by usi ng t he ut erus—m i nc i ng m e t ho d a nd ut er us—col l ect i ng m e t hod re s pec t i ve l y．ne r es ult s show e d t ha t t he aver age num ber of eggs and em bryos obt ai ned by t he ut er us—co l l ect i ng m e t ho d w er e,ext r em el y s ignif i ca ntl y hi gher(P<0．01)t han t hos e obt ai ned by t he ut e r us—m i nci ng m e t hod，an d t he aver age nu m ber of us abl e em bryos obt ai ned by t he u t e r r us—coll ect i ng m e t he d w强si gni f i cant l y hi gher(P<0．05)t han t ha t di d by t he ut erus—m i nc i ng m et hod．ne aver age num be r of an-fe r t i l i zed eggs obt ai ned by t hes e t w o m e t h ods w a s no t s ignif i cant ly di f f er e nt(P>O．05)．So t he s uper ovu l at i on e ffe c t of m i c e W a S s i g-nif i e ant lv i nnue nee d by t he m e t ho d of coll ect ing em bryos．T he obs er vat i on r es ult s of ear l y e m br yos de vel opm ent i ndi cat ed t hat m ost of t he em bryos coll ected76—79．5hour s aft er com bi ni ng cages w e r e at m or ul a s t age．w hi l e m os t of t}l e em bryos coll ected88～91．5 hour s a ft e r com bi ni ng cages w e r e a t com pa ct e d m or u l a s t a ge and bla s t o e yst s t ag e．I t W a S f eas i ble t ha t t he em bryos of m i c e w er e cul t i—vat ed i n vi t ro by usi n g t he m i xed s o l ut i o n of T C M l99and15％F C S． K e y w or ds：M ouse；Sup er ov ul at i on；E ar l y em br yo；I n vi t ro cul t ur e；M e t hod of coll ect ing em bryos 雌性哺乳动物一生所产的卵子总数早在其胚胎发育形成卵巢的过程中已被确定，成熟卵子在成年后的发情周期中分别排出，但是单纯依靠动物的自然排卵，一方面所得到的卵母细胞数或胚胎数较少，另一方面又消耗大量的时间和浪费较多的动物．因此为了获取大最的胚胎，多采用超数排卵的方法，即利用外源性促性腺激素诱发多个卵泡同时发育并排出具有正常受精能力的卵子¨。1。该技术大幅度地开发利用了卵巢上的卵母细胞资源，为胚胎工程和转基因动物等相关领域的研究提供了大量的研究素材。小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强等特点，是畜牧兽医科学研究领域应用最为广泛的实验动物，研究小鼠超数排卵对动物胚胎工程等研究具有重要意义。 近年来，随着遗传工程小鼠的大量开发，人们对小鼠卵母细胞和胚胎的需求量日趋增多，因而完善的超数排卵技术是遗传工程小鼠研究获得成功的重要前提条件。到目前为止，能够获得大量胚胎来源的技术仍为超数排卵。超数排卵反应是一个极其复杂的生理过程。研究资料表明，小鼠超排效果受激素的种类、剂鼍以及动物的生理状态等多种因素影响，这些因素错综复杂，使超数排卵效果很不稳定H—o。为了进一步研究冲胚方法对超数排卵的影响及小鼠冲胚的有效方法，本试验在控制以上因素一致的条件下，采用两种不同的冲胚方法来进行对比，以期为今后的小鼠超数排卵研究提供一定的参考依据，为胚胎生物技术研究提供借鉴。 l材料与方法 1．1试验地点和时间本试验于2009年l O月16日至2010年5月27日在河南农业大学牧医工程学院胚胎生物技术研究室进行。 1．2试验动物 1．2．1试验动物的条件试验用昆明小白鼠购于河南省实验动物中心。雌性小鼠(未经产)为17周龄、体重30 收稿日期：2010一 基金项目：河南省重点科技攻关计划项目(82102130005)；河南省蕈大科技攻关计划项目(0422011200)。 作者简介：林峰(1972一)。男．山东栖霞人．副教授，博士，主要从事动物胚胎生物技术研究。通讯作者：陈玉霞。
小鼠胚胎培养方法的研究 摘要 目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。 方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵
山西医科大掌 裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。 结果： 一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。两组比较有显著性差异。２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。与对照组比较有差显著性异。３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。与对照组无显著性差异。 二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。 三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组
-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 广东学药学院 报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrsty i unJ 2．14， 030（3） C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定 鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟 剑（ 1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防 治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点 究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培 养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。采法用动手 法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经
神经球周围在存较多刺微。细表胞达一中种间丝蛋白，即巢 蛋白（nes ti）n 。论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC， 并在体外可件条进下行传扩增培代养。关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献 志标码 A：d i： 10．o396 9 j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016 -Is laoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieW N Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orf
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF
小鼠1-细胞胚胎体外培养条件的研究* 【摘要】目的检验培养基(Whitten、CZB、SOM和KSOM)、培养器皿(进口、国产新旧平皿)与配制培养基的水质对小鼠胚胎体外发育的影响。方法采用微滴培养法培养昆明种小白鼠1-细胞胚胎，以胚胎发育到囊胚的比例为判断培养效果的标准。结果Whitten、CZB、SOM和KSOM培养基中2-细胞发育率分别为100%、100%、100%和98.6%，而囊胚发育率却分别为0%、78.3%、4.8%和9.5%；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB培养基，培养囊胚发育率分别为40.8%、54.1%和52.4%；国产和进口新平皿的囊胚发育率分别为68.0%和72.2%；国产和进口旧平皿的培养囊胚发育率为27.2%和4 6.1%。结论昆明小白鼠早期胚胎存在体外发育阻断现象；CZB培养基培养昆明小白鼠早期胚胎效果最好；用三蒸水、五蒸水和去离子水配制的CZB 培养基培养结果无显著差别；进口和国产新平皿的培养效果相近，但再次使用时培养效果显著下降。 【关键词】1-细胞胚胎培养系统小鼠 STUDIES ON THE CONDITIONS FOR THE CULTURE OF ONE-CELL MOUSE EMBRYOS Liu Zhonghua, Tan Jinghe△, He Guixin (Department of Biotechnology, North-East Agricultural University, Harbin) 【Abstract】Objective To study the effects of culture media, types of culture dish and types of water used for preparation of media on the in vitr o development of one-cell embryos in the mice of Kunming breed. Metho d One-cell mous e embryos collected from the oviduct o f the superovulated mice were cultured in microdrops of medium and the percentage of embryos developed to blastocyst stage was used as evaluation criteria. Results (1)Wh en one-cell mouse embryos were cultured in the Whitten's, CZB, SOM and KSOM media, the cleavage percentages were 100%,100%,100% and 98.6%, respectively, and the blastocyst percentages were 0%, 78.3%, 4.8% and 9. 5%, respectively. (2)The blastocyst percentages obtained from the CZB medi a prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deionized water wer e 40.8%, 54.1% and 52.4%, respectively. (3)The blastocyst percentages prod uced from the Chinese-made and the imported culture dishes were 68.0% an d 72.2%, respectively, but those obtained when the dishes were used for the second time were decreased significantly (bein g only 27.2% and 46.1%, res pectively). Conclusions There existed a development block during the in vitro development of the mouse embryos of the Kunming breed. Among the me dia tested CZB was the best in supporting the development of one-cell mou se embryos to blastocyst stage. No significant difference was found among t he CZB media prepared from the triple-distilled, fivefold-distilled and deioni zed water in blastocyst percentages. Bot h the Chinese-made and the importe