大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定*
谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩
(第三军医大学新桥医院, 重庆 630037)
摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。血细胞立即从肺组织周围游出。继而是肺微血管内皮细胞。成纤维细胞及其他细胞72h才游出。培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。后者可通过传代除去。获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。
关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养
肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。
虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。
1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。颈动脉放血后,将整个大鼠泡于75%酒精中2-3s,以后用组织剪逐层剪开胸腔。切下心肺放入盛有含青霉素200U/m、链霉素200L g/ml和Hanks液的三角烧瓶内备用。
1.3 大鼠肺微血管内皮细胞培养
大鼠肺微血管内皮细胞原代培养:将盛有心肺组织的无菌三角烧瓶置于超净台,抗生素Hanks液冲洗心肺组织的血迹。眼科剪剪去肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不应大于1.5mm)。并将肺组织用锋利的手术刀切成1.5×1×1mm3大小的组织块。贴入无菌的25cm2培养瓶(1%明胶预置过夜,4℃,用前2h移入CO2培养箱,培养液冲洗)中进行培养。每瓶贴10块,置培养箱固化2h后,加入含20%新生牛血清、肝素90U/m l、L-谷氨酰胺4mm ol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/ml的RPM I-1640培养基3m l,放入培养箱中培养。60h后将肺组织块取出。继续培养7-10d,细胞汇合成单层细胞。肺组织贴瓶后3d换液,以后每两天换液一次,每次均换1/2。
大鼠肺微血管内皮细胞传代培养: 将长成单层的原代细胞用0.08%胰蛋白酶进行消化,每瓶加入1ml,置常温5m in左右。镜下观察,当细胞间连接疏松时立即倒出消化液,加入培养基3ml,用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀,吸出0.1m l计数,得出细胞总数后,将含细胞的培养液稀释成(2.5-3.0)×105个细胞/ml的接种浓度。每25cm2培养瓶接种3ml细胞悬液,与肺微血管内皮细胞相混的血细胞就通过传代除去了。
1.4 肺微血管内皮细胞的鉴定
制片: 如同细胞传代将细胞消化成细胞悬液。再以800rpm离心5min除去含血清的培养液。向沉降的细胞中加少许Hanks液,用吸管轻轻吹打漂洗后,取少许细胞悬液薄涂于玻片上。用吸水纸吸干后甲醇固定5-10min取出备用。
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中国应用生理学杂志1997;13(2)
X1996-9-20收稿 1997-2-6修回
八因子相关抗原间接免疫荧光染色: 用PBS 液冲洗3×3m in。样品片加1:50兔抗人八因子相关抗血清50L l37℃下密封孵育30min,然后PBS液冲洗3×3min,吸水纸吸干,缓冲甘油封片。加1:25荧光标记的羊抗兔1g G50L l,并孵育、PBS液冲洗、水吸干及封片后荧光显微镜观察。对照片第一抗体用PBS液代替,其它步骤同样品片。
异植物血凝素结合试验: 用PBS液冲洗,水汲干后加入25L g/ml荧光标记的异植物血凝素, 50L l在室温密封孵育30min,PBS液冲洗3×3m in,水吸干和封片后荧光显微镜检查。样品片为肺微血管内皮细胞,对照片为肺动脉内皮细胞。两者染色过程一样。
2 结果
2.1 生长情况 肺组织块贴于培养瓶壁后,血细胞立即从肺组织块边缘向四周游出。24h肺微血管内皮细胞游出。60h将肺组织贴块取出后培养瓶中只有肺微血管内皮细胞和血细胞。7-10d后这两种细胞一起形成细胞单层。此时进行传代,血细胞被除去,培养瓶中只有肺微血管内皮细胞。
2.2 细胞形态 细胞呈鹅卵石镶嵌状排列,状如梭形或多角形,大小均匀。胞核清晰,呈卵圆形。胞浆丰富。
2.3 鉴定情况 八因子相关抗原间接免疫荧光染色样品片阳性,呈明亮的黄绿色荧光,对照片阴性。异植物血凝素结合试验示肺微血管内皮细胞呈明亮的黄绿色荧光,而肺动脉内皮细胞阴性。
3 讨论
M agee[2]曾报道的肺微血管内皮细胞的培养方法采用了含肝素等的选择培养基,使内皮细胞纯度较高。但分离肺微血管内皮细胞使用昂贵的胶原酶,同时组织剪碎,过滤等程序较为复杂。而Chen[4]提出一种简单的贴块分离培养肺微血管内皮细胞方法,但由于未使用抗生素,细菌污染的可能性大,培养成功率较低;另外培养中未加用对细胞生长起选择作用的试剂,使内皮细胞混有较多其他细胞。本文吸取两者优点:进行简单的贴块法分离肺微血管内皮细胞,从而避免使用胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶;采用肝素进行选择性培养,使细胞纯度较高;使用抗菌素,减少细菌的污染,提高成功率。此方法具有简单经济、重复性好、分离培养出的内皮细胞纯度较高的特点。鉴定采用最常用的八因子相关抗原间接免疫荧光染色和对肺微血管内皮细胞最具特异性的异植物血凝素结合试验[2],两者均阳性。证实分离培养的确为肺微血管内皮细胞。
4 参考文献
1.宋 为,蔡英年,邓希贤,等.慢性缺氧时肺腺泡内动脉肌
化与内皮结构变化的关系. 中国应用生理学杂志 1993;9(4):292-296
2.M agee J C,et al.Isolatio n,cultur e and char act erization
o f r at lung micr ov ascular endo thelial cell. A m J p h y siol 1994;267:L433-L441
3.谢 崧,钱桂生,杨晓静.大鼠肺动脉内皮细胞的简易培
养和鉴定 第三军医大学学报 1997;已修回
4.Chen S F,et al.A new simple metho d fo r isolation of
micr ov ascular endothelial cells av oiding both chemical and mechanical injuries. M icr ovascular Resear ch 1995;50:119-128
CULTURE AND CHARACTERIZATION OF RAT LUNG
MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS
Xie Song,Yang Xiaojing,Qian Guisheng,Wang Guansong
(Xin qiao Hos pital,T hird M ilitary M edical University,C hongqing 630037)
ABSTRAC T
Cultures of r at lung m icrovascular endothelial cells(RLM ECs)w ere obtained from perepheral lung tissue.The lung tissue w as cut into sm all pieces and cultured with RPMI-1640containing20%bo vine calf serum,90L g/m l heparin,4mmo l/L L-g lutam ine,100L/m l penicillin and100L g/ml streptomy cin.Erythro-cy tes and leuko cytes left the tissue first,follow ed by RLM ECs.Fibroblasts and other cells g rew after72 hour s of culture.After60hour s of cultur e,the lung tissue w as discarded.RLMECs in flask show ed regu-lar co bblestone m orpholog y and po sitive for binding of the lectin Bandeiraea simplicifo liaⅠand indirect immunofluor esence staining with factorⅧantiserum.
KEY WORDS rat; pulmo nar y circulat ion; micro cir culatio n; endo thelial cell; cell cultur e 190Ch in J Ap pl Ph ysiol1997;13(2)
气管镜肺活检（TBLB）和局部肺泡灌洗，肺活检报告示慢性肉芽肿性病变伴凝固性坏死，灌洗液和痰均找到抗酸杆菌，最终诊断为两肺肺结核。经过HRZE四联抗结核治疗，辅以激素控制结核中毒症状，患者病情迅速好转出院。 成人继发性肺结核影像常常呈现为多形态表现（即同时出现渗出、增殖、纤维和干酪性病变，还可伴有钙化），容易形成空洞。而本例患者起病较急，影像表现为两肺弥漫性肺间质病变、左肺大片实变、两肺斑片状阴影等多种病变，显然与典型继发性肺结核的表现有许多不同。与一般的成人继发性肺结核相比，有免疫损害及老年肺结核患者表现常常不典型。有资料认为成人继发性肺结核的不常见的X线表现有：①下肺结核；②粟粒性肺结核伴两肺间质性病变；③类似肺癌的纤维干酪块；④胸片正常。 回顾本例的诊治过程，我们的体会是：目前肺结核的临床表现多种多样，为了尽可能的减少肺结核的漏诊和误诊，提高对类似下呼吸道感染表现的肺结核的认识，了解和熟悉肺结核少见的X线表现，注意结核的高危因素和高危人群及胸部影像学的追踪观察，重视痰找抗酸杆菌、纤维支气管镜、组织活检病理等检查是十分必要的。 成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定 徐卫华沈华浩 浙江大学医学院附属二院呼吸科，浙江大学呼吸疾病研究所（310009） 体外培养肺成纤维细胞是研究肺部疾病如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等的重要手段和工具。目前对于成年大鼠肺成纤维细胞的原代培养，国内尚未见报道。我们利用组织块培养法对成年SD大鼠肺成纤维细胞进行了原代培养，并用免疫细胞化学的方法进行了鉴定。 一、材料和方法 1．试剂和器材 0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺公司），DMEM细胞培养液（杭州吉诺公司），胎牛血清（杭州四季清公司），兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。 2．细胞培养 250g清洁级雄性SD大鼠一只，断头处死后浸入75%酒精5分钟。大鼠移入超净台，开胸取肺，去除肺组织表面胸膜。剪切距离肺周边1mm内的肺组织，并将其放入玻璃培养皿。用手术剪将周边肺组织反复剪切成1mm×1mm大小的组织块，用PBS反复吹打冲洗直至PBS液变为澄清。用眼科镊小心钳取肺组织块，放入 3.5cm细胞培养皿，组织块之间距离约为1cm。将细胞培养皿放入℃2的细胞培养箱内培养4小时后取出培养皿，沿培养皿壁向培养皿内小心加入含10%胎牛375%CO ?281?
小鼠肺微血管内皮细胞 小鼠肺微血管内皮细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肺微血管内皮细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肺微血管内皮细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
红芪有效部位对肺间质纤维化模型大鼠肺组织胶原面积、 目的观察红芪对肺间质纤维化模型大鼠肺组织胶原面积、透明质酸（HA）及层黏连蛋白（LN）表达的影响，探讨其作用机制，并筛选红芪最佳有效部位。方法将144只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、强的松组，以及红芪多糖、黄酮、皂苷的高、中、低剂量组。采用气管滴注博莱霉素法建立肺纤维化模型，从造模后第2日起，各药物组分别给予相应剂量药物，每日1次，共28 d。Masson染色观察肺组织胶原纤维的变化，放射免疫法检测各组大鼠肺组织匀浆中HA、LN含量。结果与模型组比较，红芪黄酮各剂量组、红芪多糖低剂量组肺泡炎明显减轻。红芪黄酮低剂量组、红芪多糖中剂量组、红芪皂苷低剂量组肺组织胶原面积明显减小。与模型组比较，红芪多糖高剂量组、红芪黄酮各剂量组、红芪皂苷高剂量组HA含量明显下降。红芪多糖高剂量组，红芪黄酮中、低剂量组，红芪皂苷中、低剂量组LN含量明显下降。结论红芪多糖、黄酮、皂苷在适宜剂量下均能减轻肺泡炎症，抑制胶原纤维增生、沉积，降低肺组织中HA、LN含量，其中红芪黄酮效果较佳。 Abstract：Objective To observe the effects of Radix Hedysari on collagen area，hyaluronic acid （HA）and laminin （LN）of lung tissues in rat with pulmonary interstitial fibrosis；To investigate the mechanism and screen the best active ingredients in Radix Hedysari. Methods Totally 144 SPF Wistar rats were randomly divided into control group，model group，metacortandracin group，and Radix Hedysari polysaccharide，flavone and saponin groups were set as high-，medium-，and low-dose groups. Pulmonary interstitial fibrosis models were set up by dropping bleomycin into air tube of rats. All groups were taken corresponding medicine with appropriate dose daily on day 2 after models were established for 28 days. Collagen fibrils in lung tissue were observed by Masson dying and contents of HA and LN in lung tissue of rats in each group were detected by radioimmunoassay. Results Compared with the model group，pulmonary alveoli in Radix Hedysari flavone high-，medium-，and low-dose groups and Radix Hedysari polysaccharide low-dose group were relieved obviously；collagenous fiber area in Radix Hedysari flavone low-dose group，Radix Hedysari polysaccharide medium-dose group，and Radix Hedysari saponin low-dose group decreased obviously. Compared with the model group，the content of HA in Radix Hedysari polysaccharide high-dose group，Radix Hedysari flavone high-，medium-，and low-dose groups，and Radix Hedysari saponin high-dose group decreased obviously；the content of LN in Radix Hedysari polysaccharide high-dose group，Radix Hedysari flavonemedium- and low-dose groups，and Radix Hedysari saponin medium- and low-dose groups decreased obviously. Conclusion Polysaccharide，flavone and saponin of Radix Hedysari have the abilities to alleviate inflammation of pulmonary alveoli，inhibit proliferation and deposition of collagen fibrils，and reduce the contents of HA and LA in lung tissue. Among these active ingredients，flavone has the best effect. Key words：pulmonary fibrosis；active ingredients in Radix Hedysari；
血管内皮细胞体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。 c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。 d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。 e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。 f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。 2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混
观察Zc3h12d在急性肺损伤大鼠肺中的表达情况 小肠缺血再灌注损伤( small intestinal ischemia-reperfusion injury，IIＲI) 是一种临床常见的病理现象，常危及生命。肠系膜上动脉( superior mesentericartery，SMA) 阻塞或失血性休克等许多损伤因素都能导致小肠缺血再灌注损伤的发生。小肠缺血再灌注可导致严重的局部创伤并引起多器官功能障碍，常可累及到肺组织，而且有研究显示继发的急性肺损伤( acute lung injury，ALI) 或/和急性呼吸窘迫综合征( acute respiratory distress syndrome，AＲDS) 是造成小肠缺血再灌注损伤病人死亡的主要原因。因此，为找到新的防治措施，降低小肠缺血再灌注损伤患者的死亡率，进行小肠缺血再灌注肺损伤分子机制的研究是非常关键和必要的。具有CCCH 锌指结构域的蛋白12D( zinc fingerCCCH type containing 12d，Zc3h12d) ，也称为TFL 或P34，是近期发现的包含单个锌指结构域蛋白家族中的一员，拥有相对分子质量( Mr) 58 000 和36 000 两种剪接体，在炎症因子或脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 刺激单核细胞时其表达量会发生变化，从而对细胞的生理和病理过程产生影响。然而Zc3h12d 在动物肺损伤中的表达尚未见报道。本实验通过建立大鼠II Ｒ肺损伤模型，初步观察Zc3h12d 在急性肺损伤大鼠肺中的表达情况并探讨其可能的作用及意义，为进一步了解IIＲ肺损伤发生、发展的分子机制奠定基础。 1 材料和方法1．1 材料纯化LPS、兔抗大鼠β-actin 抗体、辣根过氧化酶标记的兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 购自Sigma 公司; 山羊抗大鼠Zc3h12d 抗体购自Santa Cruz 公司; 大鼠TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒购自北京鼎国生物技术公司; 两步法免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司; TＲIzol 试剂盒、逆转录试剂盒及实时定量PCＲ( realtime quantitative PCＲ，qＲT-PCＲ) 试剂盒购自大连TaKaＲa 公司; SDS 细胞裂解液、ECL 显色液购自西安晶彩生物技术公司; BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。电热恒温干燥箱为北京科伟永兴仪器有限公司产品，荧光显微镜为徕卡公司产品，紫外分光光度计为Beckman 公司产品，实时定量PCＲ仪、Western blot 蛋白电泳仪为Bio-Ｒad公司产品。1．2 方法1．2．1 实验动物分组与模型制备健康雄性SPF 级SD 大鼠40 只，体质量200 ～230 g，由第四军医大学动物实验中心提供。大鼠随机分为对照组( contro1) 、缺血再灌注30 min 组( IＲ30 min) 、缺血再灌注60 min 组( IＲ60 min) 和缺血再灌注120 min 组( IＲ120 min) ，每组10 只，均适应性饲养7 d 后用于实验。实验前禁食12 h，自由饮水。10 g/L 戊巴比妥纳40 mg / kg腹腔注射麻醉，经大鼠口气管插管并连接呼吸机。麻醉后常规备皮消毒，行正中开腹手术，切口3 ～4 cm 入腹，探查大鼠腹腔内情况; 探查后将全部消化道及网膜向右掀起，找到腹主动脉分支肠系膜上动脉( superior mesenteric artery，SMA) 并钝性分离; 对照组大鼠缝合切口，3 个缺血再灌注组以无创伤动脉夹夹闭SMA 起始部，缺血60 min 后恢复再灌注，分别再灌注30 min、60 min 和120 min; 过量戊巴比妥纳腹腔注射，麻醉处死。1．2．2 肺组织湿质量/ 干质量( W / D) 比值测定取大鼠右肺上叶称取质量为湿重，而后放入70℃恒温干燥箱中烘烤12 h 称质量为干质量，以湿质量/干质量得出肺湿干质量( W/D) 比值。1．2．3 ELISA 检测血清及肺组织上清液中IL-1β 及TNF-α 水平心脏取血制备血清，取左肺叶一部分制备组织匀浆液，采用ELISA 检测血清及肺组织上清IL-1β 及TNF-α 的水平。心脏取血约3 mL，37℃水浴加热30 min 后，4℃ 2 000 g 离心20 min，收集上清即血清，取肺组织约300 mg，用0．01 mmol / LPBS( pH7．4) 1．5 mL 充分匀浆后，4℃ 12 000 g 离心20 min，收集上清，两者均采用双抗体夹心ELISA 进行检测。1．2．4 肺组织病理学检查取右肺中下叶置于100 mL / L 的中性甲醛中固定24 h、梯度酒精脱水、石蜡包埋，保存于4℃ 。使用时切片( 厚度 3 μm) 、HE 染色、中性树胶封片，光镜下观察肺组织病理形态学改变。
大鼠肺微血管内皮细胞 编号名称规格北京派瑞金GK1001大鼠肺微血管内皮细胞5×105cells/瓶 为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的大鼠肺微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的大鼠肺微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 大鼠肺微血管内皮细胞简介： 1、名称：大鼠肺微血管内皮细胞 2、组织来源：大鼠肺血管组织 3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶 4、细胞简介： 大鼠肺微血管内皮细胞分离自正常大鼠肺血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。细胞呈梭形或多角形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。肺微血管内皮细胞构成半选择性屏障，该屏障对于肺气体交换，调节液体和可溶物在血液与肺间质之间的流动具有重要意义。 本公司生产的大鼠肺微血管内皮细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度 75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 5、培养基信息： 1）培养基类型：1640培养基(GIBCO，添加NaHCO31.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L) 2）添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等 大鼠肺微血管内皮细胞使用方法： 收到细胞后，请按照以下方法进行操作。 1.取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。 2.待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。 3.细胞传代 1)吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
实验动物（大鼠）原代脑微血管内皮细胞 产品编号：RAT-iCELL-n001 产品规格：>5×105细胞数 产品价格：3750 包装规格：T-25培养瓶 细胞详述： 脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。 脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；脑微血管的内皮细胞间衔接得十分紧密，不象其他组织的血管内皮细胞那样有较大的缝隙脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低；脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型。与外周内皮细胞相同，大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。 细胞特性: 1)组织来源于实验动物的脑动脉组织。 2)细胞鉴定：血管假性血友病因子（vWF）免疫荧光染色为阳性。 3)经鉴定细胞纯度高于90%。 4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。 5)细胞生长方式：铺路石状细胞，不规则细胞，贴壁培养。 产品的运输和保存：
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。 1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进 行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。 2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生 长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 推荐培养基： 我们推荐使用iCell原代内皮细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-002）作为体外培养原代脑动脉血管内皮细胞的培养基。 产品使用： 1)本产品仅能用于科研 2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核 3)本产品未通过用于活体诊断的审核
一、肺脾气虚动物模型的复制方法： 模型的建立方法：模型组采用<实用中医证侯动物模型学》之"烟熏法肺气虚证动物模型"复制法，并复合木瓜蛋白酶雾化吸人法复制SD大鼠"肺气虚证"模型。番泻叶冷服泻下法复制"脾气虚证"模型。 具体方法如下：将以上3组大鼠分别置于特制的lm3烟室中。用刨花、锯末、烟叶各30-50g，另加硫磺5-10g，点燃烟熏，每日2次，每次30分钟，注意适当通风，以防大鼠窒息。造模期6o天。并于造模开始后第3o、32、34、36天给以上各组大鼠木瓜蛋白酶雾化吸人，具体方法如下：在大鼠清醒状态下，每次将5只大鼠放入一40×40×40cm的与超声波雾化器相连的透明雾化箱中，通过雾化管向箱中喷入用0．9％Nacl液稀释为3g的木瓜蛋白酶，每次雾化量2ml。造模第20天开始，以浓度为lg／ml冰冷的番泻叶浸液，按lml／100g体重的剂量给大鼠灌胃，每日1次，持续3o天。正常对照组，分室常规喂养，不做任何处理。参考文献：李亚光，曹柏龙，贾东岩.慢性阻塞性肺疾病"肺脾气虚证"复合证型动物模型的研究.内蒙古中医药,2005年第5期：18-19. 二、肺气虚动物模型的复制方法： 1. 造模方法：气管内注入脂多糖(LPS)并烟熏方法复制肺气肿/COPD肺气虚证大鼠模型。(此法最常用) 具体方法：于模型复制的第1和14天用10％水合氯醛腹腔麻醉后，行气管内注入LPS200ug ／200ul，庆大霉素局部抗炎，缝合皮肤并消毒。术后第2～13、15～28天，置于1 m×1 m ×1 m的烟室中，香烟(焦油量为12 mg，烟气烟碱量为1．1 mg)烟熏，每日30 min；自由进食、饮水。对照组：将每只大鼠于第1、14天气管内注入0．9％氯化钠注射液200 u1；于第2～13、15-28天，置于无烟熏同样环境中饲养，余法同模型组。 参考文献： 王哲，王春田，任艳玲.肺气虚模型大鼠血ET、IL一1β及TNF-α含量的变化.中国老年学杂志,2008,12月第28卷:2414-2416. 刘向国，方志斌，蔡圣荣，肺气肿肺气虚证模型大鼠肺组织中基质金属蛋白酶表达的变化. 中国中医药科技,2006,13( 5):289-291. 刘茜，刘向国,武松. 肺气肿肺气虚证模型大鼠胸腺指数、脾脏指数变化的实验研究. 甘肃中医学院学报, 2006,23(1):20-22. 李泽庚,彭波,杰根.肺气虚证模型大鼠的建立. 北京中医,2005,24(1):53-55. 2．方法：用烟熏并复合木瓜蛋白酶雾化吸入法复制COPD"肺气虚证"大鼠模型。 具体方法：动物造模采用《实用中医证候动物模型学》之"烟熏法肺气虚证动物模型"复制法，并复合木瓜蛋白酶雾化吸人法，复制SD大鼠"肺气虚证"COPD模型。每5只大鼠置于自制透明塑料箱中，用刨花、锯末、烟叶各30～50g，另加硫磺5～10g，点燃烟熏，每日2次，每次30min，注意适当通风，以防大鼠窒息。并于造模开始后第30、32、34、36天将超声波雾化器与透明塑料箱相连，通过雾化管向箱中大鼠喷人浓度为0．3％的木瓜蛋白酶，每5只大鼠2mL。造模期60天。正常对照组置于正常无烟环境中饲养。 参考文献：张葵,刘良丽, 欧江琴.COPD肺气虚证模型大鼠血清TNF-αIL-8的表达和意义，
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 一、实验材料准备 1. 动物 出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。 2. 试剂 PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。 3. 器械 眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。 二、具体操作 1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。 3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。 4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。 5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。注意上述操作过程中动作要轻柔，让液体慢慢覆盖组织小块，严禁动作过快致使液体产生的冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。48 h后换液，更换2-3 ml即可。 6. 贴块贴壁72 h后，镜下可见大量的成纤维细胞爬出，将组织块去除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就
小鼠心肌微血管内皮细胞 小鼠心肌微血管内皮细胞产品说明: 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠心肌微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠心肌微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠心肌微血管内皮细胞产品简介: 1、产品名称：小鼠心肌微血管内皮细胞 2、组织来源：小鼠心肌血管组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠心肌微血管内皮细胞简介： 小鼠心肌微血管内皮细胞分离自正常小鼠心肌血管组织，血管内皮细胞密切参与包括再生、发育、伤口愈合等一系列生理及炎症反应。 本公司生产的小鼠心肌微血管内皮细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠心肌微血管内皮细胞培养基信息：
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定* 谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩 (第三军医大学新桥医院, 重庆 630037) 摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。血细胞立即从肺组织周围游出。继而是肺微血管内皮细胞。成纤维细胞及其他细胞72h才游出。培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。后者可通过传代除去。获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。 关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养 肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。 虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。 1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。颈动脉放血后,将整个大鼠泡于75%酒精中2-3s,以后用组织剪逐层剪开胸腔。切下心肺放入盛有含青霉素200U/m、链霉素200L g/ml和Hanks液的三角烧瓶内备用。 1.3 大鼠肺微血管内皮细胞培养 大鼠肺微血管内皮细胞原代培养:将盛有心肺组织的无菌三角烧瓶置于超净台,抗生素Hanks液冲洗心肺组织的血迹。眼科剪剪去肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不应大于1.5mm)。并将肺组织用锋利的手术刀切成1.5×1×1mm3大小的组织块。贴入无菌的25cm2培养瓶(1%明胶预置过夜,4℃,用前2h移入CO2培养箱,培养液冲洗)中进行培养。每瓶贴10块,置培养箱固化2h后,加入含20%新生牛血清、肝素90U/m l、L-谷氨酰胺4mm ol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/ml的RPM I-1640培养基3m l,放入培养箱中培养。60h后将肺组织块取出。继续培养7-10d,细胞汇合成单层细胞。肺组织贴瓶后3d换液,以后每两天换液一次,每次均换1/2。 大鼠肺微血管内皮细胞传代培养: 将长成单层的原代细胞用0.08%胰蛋白酶进行消化,每瓶加入1ml,置常温5m in左右。镜下观察,当细胞间连接疏松时立即倒出消化液,加入培养基3ml,用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀,吸出0.1m l计数,得出细胞总数后,将含细胞的培养液稀释成(2.5-3.0)×105个细胞/ml的接种浓度。每25cm2培养瓶接种3ml细胞悬液,与肺微血管内皮细胞相混的血细胞就通过传代除去了。 1.4 肺微血管内皮细胞的鉴定 制片: 如同细胞传代将细胞消化成细胞悬液。再以800rpm离心5min除去含血清的培养液。向沉降的细胞中加少许Hanks液,用吸管轻轻吹打漂洗后,取少许细胞悬液薄涂于玻片上。用吸水纸吸干后甲醇固定5-10min取出备用。 189 中国应用生理学杂志1997;13(2) X1996-9-20收稿 1997-2-6修回
小鼠视网膜微血管内皮细胞 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠视网膜微血管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠视网膜微血管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠视网膜微血管内皮细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠视网膜微血管内皮细胞（Mouse Retinal Microvascular EndothelialCells） 2、组织来源：小鼠视网膜组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠视网膜微血管内皮细胞简介： 小鼠视网膜微血管内皮细胞（Rat Retinal Microvascular Endothelial Cells）来源于成年小鼠视网膜组织，其是组成血管腔面单层扁平上皮样细胞，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在视网膜血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。 本公司生产的小鼠视网膜微血管内皮细胞采用胶原酶消化和密度梯度离心制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有
中药芪红合剂对肺间质纤维化模型大鼠肺组织中TGF-β1表达的影响 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的：探讨中药芪红合剂在肺间质纤维化过程中的作用及其机理。方法：采用气管内注射博来霉素A5建立肺间质纤维化的大鼠模型。将40只Wistar大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、泼尼松治疗组、芪红合剂治疗组，每组10只。给各组大鼠灌胃相应的生理盐水或药物，术后15 d处死各组大鼠，取两肺组织，一部分行石蜡包埋切片，HE染色，观察病理改变，另一部分采用ELISA法定量测定TGF-β1。结果：与假手术组比较，模型组大鼠肺组织有明显的纤维化改变，TGF-β1的含量显著升高（P0.01）；与模型组比较，泼尼松治疗组和芪红合剂治疗组大鼠肺组织中TGF-β1含量显著下降（P0.01）。结论：中药芪红合剂可能通过降低肺组织中TGF-β1的含量而减轻肺间质损伤及纤维化改变。 【关键词】芪红合剂TGF-β1 间质纤维化 Abstract Objective：To study the effect of Qihong decoction on rats with pulmonary fibrosis and its mechanism. Methods：Model
rats were induced by injecting bleomycin A5 into trachea. 40 Wistar rats were randomized into sham operation control group（given saline），model group（given saline），prednisone treatment group，Qihong decoction treatment group（n=10）. The lung tissues were collected after 15 days treatment. The level of TGF-β1 was measured by ELISA，and the level of fibrosis was observed by HE stain. Results：Compared with sham operation control group，the change of pulmonary fibrosis and the level of TGF-β1 in model group rats were obviously increase（P＜0.01）. Compared with model group，the levels of TGF-β1 in two treatment groups were obviously decreased（P＜0.01）. Conclusion：Qihong decoction can alleviate lung tissue damage and pulmonary fibrosis through down-regulating TGF-β1 expression. Key words Qihong decoction; Transforming Growth Factor-β1; pulmonary fibrosis 特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是由弥漫性间质性肺疾病引起、以弥漫性肺泡单位慢性炎症和间质纤维化为主要病理特征的一大疾病［1］。该病发病率约为5/10万人，近年来有上升趋势。统计资料显示其5年生存率低于50％，目前临床治疗常用的药物是糖皮质激素、免疫抑制剂和一些抗纤维化制剂，这些治疗尚不能使患者的生存率有所改善。 中药制剂芪红合剂是我们在临床上治疗各种肺脏疾病的基础方剂，
内皮细胞的培养 内皮细胞，用高倍镜观察肠系膜上的毛细血管，可见到内皮细胞，内皮细胞较间皮细胞小，排列紧密。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。血管内皮细胞（EC）位于血液与血管组织之间，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。 下面以脐带静脉为例介绍内皮细胞的培养： 一、试剂准备： （1）脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL/L、100 U/ml青霉素一100 U/m1链霉素。（2）组织消化液：0．1％I型胶原酶和0．05％胰酶-0．02％乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液。 （3）内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素-100 U／m1链霉素的M199培养基。 （4）器皿：0．2％明胶包被：用PBS配制。 二、原代提取 （1）脐带处理：在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。 （2）脐静脉处理：用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止。 （3）组织消化：将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。 （4）收集细胞：用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10 ml离心管， （5）离心培养：1 000 r／min离心10 min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10 min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中，置于37℃5％C02饱和湿度培养箱中培养，24 h 后更换培养液，以后每隔2 d换液1次。