共聚焦显微镜
从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管
(photomultipliertube，pmt)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有
划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了
30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和
三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：
涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
二.基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（pmt）或冷电耦器件（cd）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
三.应用范围：
细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。
1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化
2.生物化学：酶、核酸、fish（荧光原位杂交）、受体分析
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学
4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态
5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布
6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构
7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、hiv等
8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断
四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用a.在细胞及分子生物学中的应用1.细胞、组织的三维观察和定量测量2.活细胞生理信号的动态监测3.粘附细胞的分选4.细胞激光显微外科和光陷阱功能5.光漂白后的荧光恢复6.在细胞凋亡研究中的应用b.在神经科学中的应用
1.定量荧光测定
2.细胞内离子的测定
3.神经细胞的形态观察
c.在耳鼻喉科学中的应用
1.在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用
2.激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用
3.激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用
4.激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用
d.在肿瘤研究中的应用
1.定量免疫荧光测定
2.细胞内离子分析
3.图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析
4.三维重建e.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用1.细胞内钙离子的测定2.免疫荧光定位及免疫细胞化学研究3.细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜f.在血液病研究中的应用1.在血细胞形态及功能研究方面的应用
2.在细胞凋亡研究中的应用
g.在眼科研究中的应用
1.利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构
2.集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现
3.利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态
4.三维重建
h.激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用
可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立
体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。共聚焦显微镜
基本原理
从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroicmirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultipliertube，pmt）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。这样
的构想，是在1953年，美国学者马文·明斯基提出，经过了30年的发展，才利用激光为光源，发展出符合马文·明斯基理想的共轭焦显微镜。相关应用
全内反射萤光显微镜tirfmicroscope
海德堡视网膜地形图(hrt)，以此原理对视网膜，特别是视盘，进行分层的扫描，以重建视盘的三维结构。主要用于青光眼的诊断和随访
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（lscm）的原理
从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:
1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差
1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清
晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用
目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
2．1观察活细胞、活组织ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
2．2生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平2．3动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。
2．4数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。
2．5定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。
3激光扫描共聚焦显微镜的使用（camp在体测量为例）
3．1样品制备
3．1．1切片实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用
的贴附剂有：多聚赖氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶
cell-tak,vectabond等。
3．1．2培养细胞培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养则更佳
3．1．3激光共聚焦观察样品处理注意事项
首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4类。
3．2荧光探针的选择
荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国molecularprobes公司就可提供1800多种荧光探针[3，每年该公司还不断推出新的荧光探针。通常每项检测内容或被测物质都有几种或几十种有关的或特异的荧
光探针。选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。荧光探针的选择主要从以下几个方面考虑：
(1)现有仪器所采用的激光器。如我校购进的激光扫描共聚焦显微镜(acasultma312，美国meridian公司产品)采用氩离子激光器，激发波长为351～364nm，488nm，514nm，可激发多种荧光探针；
(2)荧光探针的光稳定性和光漂白性。在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较好的光稳定性越高越好，也可通过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。
但在进行膜流动性或细胞间通讯检测时则需要荧光探针既有一定的光稳定性又要有一定的光漂白性；(3)荧光的定性或定量。仅做荧光定性或仅是观察荧光动态变化时，选择单波长激发探针，无需制作工作曲线。做定量测量时最好选用双波长激发比率探针，利于制定工作曲线；(4)荧光探针的特异性和毒性。尽量选用毒性小、特异性高的探针；(5)荧光探针适用的ph。大多数情况下细胞的ph在生理条件下，但当ph不在此范围时，考虑适用该环境ph的荧光探针是
有必要的。同时应注意染液自身的ph值会影响带电荷的荧光探针与胞内组份之间的结合，因此在染液的配备时需加以考虑。
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。此外，许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使用其乙酰羟甲基酯(acetoxymethyl,am)形式，也就是荧光探针与am结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的am被非特异性酯酶水解，去掉am后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。
3．2．1细胞内游离钙
美国分子公司提供的钙荧光探针有20多种，激光扫描共聚焦显微镜常用的有fluo-3、rhod-1、indo-1、fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内［ca2+］i，为钙定量探针
3．2．2dna和rna
核酸的荧光探针有50多种［2］，用于激光扫描共聚焦显微镜的主要有acridineorange(吖啶橙，ao)、propidiumiodide(碘化丙啶，pi)。
3．2．3膜电位
dibac4(3)为最常用的膜电位荧光探针［5］，dibac4(3)为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。rhodamine123
主要用于线粒体膜电位测量［6］。rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与dibac4(3)的表示形式相反。
3．2．4ph值
常用于偏中性ph即细胞胞浆ph检测的荧光探针有snarf类
(snarf-1snarf-calcein)、snafl类(snafl-1、snafl-calcein)、bcecf
等，这些探针均为疏水性探针，需使用其am形式。fitc-dextran则适用于ph范围4～6之间［7］，如溶酶体ph的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的dextran(葡聚糖)。
3．2．5细胞内活性氧基
活性氧(activeoxygenspecies)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有
dichlorodihydrof-luoresceindiacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、h2dcfda)［2］，其原理是不发荧光的h2dcfda进入细胞后能被存在的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为dichlorofluorescein(dcf)而产生荧光，其反应灵敏到10-12mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。
3．2．6细胞间通讯
激光扫描共聚焦显微镜可采用荧光光漂白恢复frap技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。采用frap技术检测细胞间通讯常用荧光探针是6-carboxyfluoresceindiacetate(6-羧基荧光乙酰乙酸、cfda)。需用其酯化形式cfda-am。该技术可用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用。由于某些毒性物质尤是促癌物可影响缝隙连接介导的物质运输，因此该方法也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。
3．2．7细胞膜流动性
采用荧光光漂白恢复(frap)技术还可对细胞膜流动性进行研究［9］。利用nbd-c6-hpc荧光探针标记细胞膜磷脂，然后用高强度的
激光束照射活细胞膜表面的某一区域(1～2μm)，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。可检测到细胞膜上其它地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息，如用于观察细胞受体介导内吞过程中膜磷脂流动性的变化情况。nbd-c6-hpc在温度稍高时可能会进入细胞内，因此荧光染色和测量时应在低于常温的环境下进行。
3．2．8细胞结构、受体、蛋白质、酶等
激光扫描共聚焦显微镜可获得较一般普通光学显微镜分辨率高的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图象，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。适用于线粒体的荧光探针较多，如mitotracker、daspmi、daspei、jc-1、rhodamine123等。高尔基复合体常用的荧光探针有nbdceramide、bodipyceramide。内质网主要用dil、dioc6(3)。溶酶体的荧光探针有damp、neutralred。有报道选用nbc-pc标记细胞膜、
mitotracker标记线粒体、hoechst33342标记细胞核dna，同时显示细胞的三部分结构。
3．3激光扫描共聚焦显微镜的使用
3．3．1根据标本选择的荧光探针对激发波长选择激光器类型。
3．3．2根据荧光探针的发射波长选择相应的滤片，k凌镜无滤片扫描则不需要这一步。最好根据现有仪器配制选择荧光探针。
3．3．3根据实验目的选择合适当软件。一般仪器的软件分静息状态度图像分析软件、动态测量软件和特殊软件。
3．3．4按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。
4激光扫描共聚焦显微镜的功能
激光扫描共聚焦显微镜的功能主要分图像处理功能和细胞生物学功能两个方面
4．1图层处理功能
4．1．1组织光学切片：激光扫描共聚焦成像利用照明点与探测点共轭特性，可有效抑制同一焦点平面上非测量点的杂散荧光及来自
样品中非焦平面的荧光，从
而获得普通光镜无法达到的分辨率。同时具有深度识别率和纵向分辨率。它以一个微动步进马达控制载物台的升
降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”(opticalsectioning)，得到各个层面的信息。这种功能也被称为“细胞ct”或“显微ct”。
4．1．2三图像重建：激光扫描共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理及三维重建软件，沿x、y和z轴或其它任意角度来观察标本的外形及剖面，并得到三维的立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。§
4．1．3细胞物理会生物化学测定：激光扫描共聚焦显微镜可进行低光探测、活细胞定量分析和重复极佳的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地
进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 （一）细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。（二）静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白
激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究 [ 05-12-18 15:01:00 ] 作者：Yu Nanshen 编辑：studa9ngns 【摘要】目的本文对应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光强度的测定条件做了详细的分析。方法选择和设置激光扫描共聚焦显微镜的各参数，对用间接免疫荧光法检测改性后的材料表面对人牙龈成纤维细胞分泌细胞外基质纤粘连蛋白FN和I型胶原的影响进行荧光强度的定量。结果细胞在材料表面接种后FN的荧光染色强度在四组材料之间差异无显著性，说明材料表面化学成分的改变对FN的形成没有明显影响。但四组材料对I型胶原分泌的影响有差异。结论选择和设置适合的激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件，可以真实有效的反映实验的结果。 关键词激光扫描共聚焦显微镜荧光强度 The research on determine condition of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy 【Abstract】 Objective To explore the conditions under which fluorescence intensity is determined in confocal laser scanning microscopy.Methods The parameters of confocal laser scanning microscopy were set and the effects of these modifications on the response of the fibro-conglutination albumen and type I collage n of human gingival fibrobˉlasts on indirect immunityfluorescence were observed，and the fluorescence intensity of the effects was measured.Reˉsults After the cells grafted on the material surface，the fluorescence dye intensity of the fibro-conglutination albuˉmen had no notable differ ence in materials of the four groups，the alter of the chemistry component of the material surˉface had no notable influence on the formation of the fibro-conglutination albumen.But the effects of the type I collaˉgen were different in materials of the four groups.Conclusion Setting appropriate conditions for the determination of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy is important in the analysis of the true results of experiˉment.Key words confocal laser scanning microscopy fluorescence intensity
第2单元第3章细胞 第1节细胞的基本结构和协能 第一课时显微镜的构造和使用 教学目标： 知识目标 1、说出普通显微镜主要构件的名称和用途； 2、练习使用显微镜，学会规范的操作方法； 3、尝试使用低倍镜观察生物玻片标本； 能力目标 培养学生的观察能力、动手能力和分析表达力、 情感、态度和价值观 将基础知识的学习与实验操作有机结合，激发学生发现问题，主动学习的兴趣。教学重点 显微镜的使用方法；学生独立操作能力的培养 教学难点 规范使用显微镜，并掌握观察的方法； 课前准备 教师：准备显微镜，载玻片、纱布、擦镜纸。 学生：对照课本p32的图，认识显微镜的各部分名称。 教学过程 教学策略教师活动学生活动设计思路 创设情景
导入新课 1、前面我们已经了解生物多样性，它们所表现的生命特征大同小异，如生长、繁殖等，原来，除病毒外绝大多数生物都是由细胞构成的，细胞是生命活动的基本单位，要想看到细胞，必须要认识显微镜 1、听教师讲解，回顾旧知识。通过对旧知识的回顾，达到温故而知新的目的。 理清脉络 构建框架 (知识积累) 1、组织学生学习室验室规则； 2、用实物来逐一介绍显微镜的各个结构及其用途； 3、教师演示：显微镜的使用步骤； 1、认真听讲，了解室验室的相关规则； 2、边听教师介绍边结合p32图3?—2，来认识显微镜的结构； 3、认真听讲和观察教师的操作方法； 1、为以后有一个好的室验纪律打基础； 2、完成知识目标，为以后的实验打好基础； 3、完成知识目标，为后面的操作奠定基础； 学以致用 (知识运用) 1、要求学生开始进行操作； 2、教师巡视，指导点拨； 1、根据刚才所学到的知识，变理论为实践，动手做实验； 2、有问题的举手请教教师；通过亲自操作加深对显微镜各部分的认识，掌握显微镜的操作方法，完成三维目标； 课堂小结 (知识回顾) 1、引导学生完成p34讨论的1、2、3题；
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图
二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一）细胞的三维重建
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡
光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。
激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25μm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共焦显微镜分辨率：μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷： 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别
荧光显微镜技术参数 1．工作条件及用途 适于在气温为摄氏-40℃～＋50℃的环境条件下运输和贮存，在电源220V （ 10%）/50Hz、气温摄氏-5℃～40℃和相对湿度85%的环境条件下运行。 可作切片的明场（BF）、荧光（FL）、偏光（PO）观察。 2．主要技术指标 2.1 研究级正置显微镜 2.1.1 研究级正置显微镜，可作明场、偏光和荧光的观察 2.1.2 光学系统：无限远校正光学系统，齐焦距离必须为国际标准45mm 2.1.3 调焦：载物台垂直运动方式距离不小于25mm，带聚焦粗调限位器，粗调旋钮扭矩可调，最小微调刻度单位≤1微米 2.1.4 观察镜筒：宽场三目观察筒，倾角为30° *2.1.5 照明装置：内置透射光柯勒照明器，12V100W卤素灯，光强预调开关，内置式滤色镜（日光平衡滤色片、ND25、ND6），左右手均可操作。 *2.1.6 物镜：万能平场半复消色差物镜 4X（N.A≥ 0.13，W.D≥17） 10X（N.A≥0.3，W.D≥10） 20X（N.A≥0.5，W.D≥2.1 spring） 40X（N.A≥0.75，W.D≥0.51 spring） 100X（N.A≥1.30，W.D≥0.2 spring,oil） 2.1.7 载物台：右手油式载物台，带有旋转装置和扭矩调节装置，高抗磨损性陶瓷覆盖层载物台。 2.1.8 目镜：10X宽视野目镜，带屈光度校准 2.1.9 物镜转换器：六孔物镜转换器 2.1.10 聚光镜：摇摆式聚光镜，N.A.≥0.9 2.1.11 具备ECO环保节能感应开关，操作人员离开30分钟后自动关闭透射光源。 2.2 荧光照明系统 2.2.1 荧光照明器：八孔荧光照明器，配置ND25、ND6、ND1.5中灰滤色片，
激光共聚焦显微镜原理 激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 图1. 共聚焦显微镜简化原理图 图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。
图2. 探测针孔的作用示意图 图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。共聚焦显微技术是由美国科学家马文?闵斯基(Marvin Minsky)发明的；他于1957年就为该技术申请了专利。但是直到八十年代后期，由于激光研究的长足进步，才使得激光共聚焦扫描显微技术（CLSM）成为了一种成熟的技术。 图3. 激光共聚焦显微镜原理框图 当今的激光共聚焦显微镜已经发展为一种结合了激光技术，显微光学，自动控制和图像处理等多种尖端科研成果的高技术工具。是现代微观研究领域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信赖与创造”的一贯企业理念，正在为业界提供世界领先水平的共聚焦显微镜系统产品。
激光扫描共聚焦显微镜采用激光作为光源, 有效地除去了非聚焦平面的信息, 提高了微观形貌的清晰度和分辨率。其与计算机软件结合可以实现深度方向的光学切片观察, 再将这些扫描得到的信息通过软件算法以及叠加和重组, 可以获得材料的微观三维形貌, 因此激光共聚焦显微镜具有快速、无损、制样简单等优点。那么激光共聚焦显微镜的原理又是怎样的呢？ 它采用激光点光源照射样品, 从发射器发出的光经过光路后在聚焦平面上形成一个大小分明的光点,它沿着原照射光路到达分光镜并且该点发出的光被物镜收集,分光镜将收集来的光直接反馈给探测器。光点通过前方探测器设有的探测针孔等一系列的透镜, 最终同时聚焦于探测针孔, 这样来自聚焦平面的光可以会聚在探测孔之内, 而来自聚焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像, 从而提高了焦平面的分辨率。激光共聚焦显微镜逐点扫描样品, 探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像, 转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。此外激光共聚焦显微镜还可以对样品进行逐层光学切片扫描, 得到高度方向每一层的图像信息, 传回计算机软件叠加处理后可以得到三维形貌图。它成像清晰、精确、最大的优点在于能对材料进行深层形貌的观察。可以对样品进行断层扫描观察和成像, 进行无损观察和三维形貌分析。 激光共聚焦显微镜可用来观察样品表面亚微米级别的三维轮廓形貌, 也可以测量多种微几何尺寸, 像晶粒度、体积、膜深、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等。激光共
聚焦相比于其他测量手段有其独特的优势, 它提高了图片的清晰度, 有很好的景深, 提高了分辨率, 可以进行无接触的三维轮廓测试。在金属材料研发方面还经常用到光学显微镜和扫描电子显微镜。光学显微镜是一种二维的形态学工具, 有效分辨率较低, 分辨率的景深较小, 也不能观察纵向方向的三维形态。而扫描电镜在样品的制备方面比较复杂, 有时还会引起样品的破坏, 对于扫描的面积和材料的表面高度都有所限制, 同时它也不能测量面积、体积、深度等信息。在钢铁材料的生产和开发过程中, 众多的环节需要关注表面形貌, 采用激光共聚焦显微镜技术进行相应检测, 不仅可以获得媲美SEM的显微图像, 同时还能够进行快速、无损测量, 加之其较低的引入和维护成本,更符合目前行业成本控制的需求。本文将举例说明激光共聚焦显微镜在金属研究领域的典型应用。 激光共聚焦显微镜由于其优于光学显微镜的清晰度和分辨率, 使其在金相组织观察方面有独特的优势。试验样品为海洋平台用钢, 将样品进行磨制、抛光处理, 并用腐蚀溶液腐蚀, 要求观察并测量基体上粒状贝氏体的形态和尺寸。相比于普通光学显微镜, 激光共聚焦显微镜清晰度好, 分辨率高。激光作为光源, 它的单色性非常好, 光束的波长相同, 从根本上消除了色差。共聚焦显微镜中在物镜的焦平面上放置了一个带有针孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 从而消除了球差。同时激光共聚焦显微镜采取的点扫描技术和计算机采集和处理信号也进一步提高了图像的清晰度。
新七年级科学第2次授课教案 授课 主题 显微镜的结构 教学目标1、了解显微镜的基本结构； 2、了解显微镜的发展历程； 3、明确用显微镜来观察洋葱表皮细胞的方法； 4、了解制备标本的过程； 5、认识用显微镜观察人体口腔上皮细胞； 6、了解显微镜下的微生物； 教学 重点 制作动植物标本；观察动植物细胞；认识微生物。教学 难点 制作动植物标本；观察动植物细胞；认识微生物。 教学过程一、【历次错题讲解】 倍数大的放大镜，看到的图像（），看到的范围（）；倍数小的放大镜，看到的图像（），看到的范围（）。 二、【趣味课程导入】 1、人被蚊子叮咬后皮肤发痒或红肿，简单的处理方法是：擦稀氨水或碳酸氢钠溶液。 2、因为某气体A在大气层中过量累积，使地球红外辐射不能透过大气，从而造成大气温度升高，产生了“温室效应”。气体A为：二氧化碳 三、【基础知识梳理】 （一）观察植物细胞： 1、洋葱表皮是由细胞构成的； 最早发现细胞的是罗伯特胡克。 实验步骤： 1）取标本：要内表皮细胞，切十字形； 2)在一个干净的玻璃载片中间滴一滴清水； 3)用镊子把取下的洋葱表皮放到栽玻片的水滴中央，注意标本要平展开，不能折叠； 4)用盖玻片（或另一个玻璃载片）倾斜着盖到标本上面，放盖玻片时，先放一端，再慢慢放下另一端，注意不要有气泡； 5)从标本的边缘滴一滴稀释的碘酒，并把玻片微微倾斜，再用吸水纸吸掉多余的水； 滴——取——展——盖——染——吸。 2、显微镜的结构： （1）目镜：5×、10×或15×；目镜长，倍数小。 （2）镜筒：上端是安装目镜的地方 （3）物镜转换器：连有物镜（低倍物镜10×，高倍物镜40×，；物镜长，倍数大。 （4）压片夹（也叫金属夹） （5）载物台：用于放置观察用的玻片标本，载物台中央有一圆孔，叫通光孔。 （6）遮光器：遮光器上有大小不一的光圈。 （7）反光镜：有平面镜和凹面镜，其用途是收集光线．平面镜使光线分布较均匀．凹面镜有聚光作用，反射的光线较强，一般在光线较弱时使用． （8）粗准焦螺旋（粗调节轮）：用于调节低倍镜。 （9）细准焦螺旋（细调节轮）：主要用于调节高倍镜。 （10）镜臂：镜柱上方的弯曲的弓形部分叫做镜臂，是握镜的地方。 （11）镜柱：
认识显微镜 一、显微镜的结构 镜柱：支持镜柱以上的部分 镜臂：握镜的部位 细准焦螺旋：升降镜筒，升降幅度较小 粗准焦螺旋：升降镜筒，升降幅度较大 转动方向：逆时针旋转上升镜筒；顺时针旋转下降镜筒。 镜座：稳定镜身 反光镜：可以转动，使光线经过通光孔反射上来。其两面是不同的： 平面镜：反射的光线较弱，当光线过强需要用弱光时使用； 凹面镜：反射的光线较强，当光线过弱需要用强光时使用； 压片夹：固定载玻片 遮光器：有大小不等的光圈，调节通光量。 大光圈：光线强，视野亮；当光线过弱需要强光时使用。 小光圈：光线弱，视野暗；当光线过强需要弱光时使用。 通光孔：使光线通过 载物台：放置玻片标本的地方，中央有通光孔，两旁各有一个压片夹固定载玻片。物镜：放大作用 转换器：安放和转换物镜镜头。 镜筒：上装目镜，下装转换器。 目镜：放大作用 显微镜的放大倍数=目镜放大倍数X物镜放大倍数
二、显微镜的使用 一、取镜安放 右手握镜臂，左手托镜座，放在实验台略偏左的地方距边缘7厘米左右，安装好目镜和物镜。镜臂对着身体，镜筒向前，轻拿轻放。 二、对光 对光注意三转。 1）转转换器，使低倍物镜对准通光孔。 2）转遮光器，使光圈对准通光孔。 3）左眼看目镜，转反光镜，看到明亮的视野。 调节光线明暗是调遮光器和反光镜。 三、观察 1）放片 将玻片标本放在载物台上，使待检查部分位于通光孔中心，压片夹压住载玻片两端。 2）调焦 ①眼睛盯住物镜，顺时针转动粗准焦螺旋，使镜筒慢慢下降，注意不要让物镜碰到载玻片 ②用左眼朝目镜里观察，同时反方向转动粗准焦螺旋，缓慢上升镜筒，直到视野中出现物象。 ③再用细准焦螺旋调节。 四、清洁收镜 友情提示 （1）显微镜的外表脏了，要用纱布擦，目镜和物镜脏了要用擦镜纸擦拭。 （2）观察时左眼看着目镜，右眼要睁开。 （3）调节光线强弱的结构是遮光器和反光镜。
准备工作：至少提前半小时 1，先开空调 2，打开激光器：上面的小的是530激光器【0.53μm半导体端泵绿光】；下面大的是488激光器【488nm蓝光半导体激光器】。先打开二者的总的开关，然后再打开响应的钥匙。若不知道需要什么激光，全都打开。PS：关的时候，先关闭钥匙，在关闭总的开关。 3，依次打开 olympus LG-PS2冷光源【电压12V,功率100W,低燥音,发热低,小巧美观.使用进口特种灯泡使用寿命可达4-5年.质量稳定,可靠性高,带有多种滤色片，可输出黄色光、白色光、红色光、蓝色光等多种在不同场合需要的纯正光色。亮度高、能耗低。】 U-RFL-T【外接汞灯电源】 FV5-PSU【扫描控制装置, 负责控制各部分电源分配和整个扫描系统的整合】4，然后再依次打开共聚焦电脑（白色）和普适电脑（黑色） 左边的白色电脑密码为fluoview 打开user，密码为user 右边黑色为普适电脑，密码为2618710 打开DPcontrol 操作过程： 1档：空档，用于共聚焦 2档：蓝激绿激发波长Ex=460-490nm；发射波长Em>510nm 3档：绿激红Ex=510-550nm；Em>570nm 4档: 紫激蓝Ex=330-385nm; Em>420 5档：紫激蓝Ex=426-450nm；Em=467-499nm 6档：DIC=空档+立体化 显微镜的操作：
软件的操作： 1，microscope control 2，laser intensity 3，三个长方形的通道 4，Objective 步骤： 1，打开汞灯 2，将 打开 3，将objective调节到相应的与物镜一致的型号，如物镜为60X W，则objective 应调节为60X W；其中，只有60X W中有W，代表water，是水镜，在观察前滴一滴水。 4，PMT：光电信号增强 Gain：信号放大 Offset：扣除背景 5， 调节其中的三个参数。
第一节显微镜的结构和使用教学 设计 第一节显微镜的结构和使用 教学设计一、教学目标知识目标1．通过学习显微镜各部的名称、作用和方法，认识显微镜的结构。2．学习显微镜的使用方法，掌握使用显微镜的基本步骤。能力目标学会正确规范使用显微镜的步骤、方法，发展实验能力。情感目标通过对本节内容的学习，在科学态度、科学方法的熏陶中，树立初步的科学意识。二、教学重难点教学重点1．显微镜的使用方法。2．学习独立操作能力的培养。教学难点规范使用显微镜，并观察到物像（要求学生用左眼注视目镜内图像的同时，右眼睁开）。教学方法谈话法、实验法。三、教学过程［导入新］教师活动：用谈话式教学方式让学生认识细胞，及其与生物的关系。具体活动如下：科学研究证明，地球上的生物虽然种类繁多，但是从基本结构上说则大体上是一样的——除病毒以外，生物体都是由细胞构成的。生物体的一切活动，比如：生物的长大、繁殖等都是靠细胞来实现的。细胞是构成生物体结构和功能的基本单位。要想探索生物的奥秘，就必须要了解细胞。我们这一单元的内容就是专门来研究一下生物的各种生命活动与细胞的关系的。可是，细胞的体积很小，我们怎样才能观察到它呢？聪明的人类为
了解决这个问题，而发明创造了显微镜这种专门用来观察细胞结构和功能的仪器。我们这节就来认识一下显微镜及其使用方法。［讲授新］显微镜是生物科学研究中常用的观察工具。最早的显微镜是由一位荷兰眼镜商在1600年前后制造的，它的结构简单，放大倍数不高，只有10～30倍，可以观察一些小昆虫，如跳蚤等，因而有人称它为“跳蚤镜”。这种显微镜是用光线照明的，属于光学显微镜。后来随着科学技术的不断发展，人们把显微镜的制造技术进行了不断的改进。到20世纪30年代诞生了电子显微镜。它是利用高速运动的电子来代替光线进行观察，放大倍数可以达到几十万倍。电子显微镜大大开阔了人们的视野，使人们看到了细胞更细微的结构。它的应用领域已经不止局限于生物学，在医学、物理学、化学等其他领域的应用也很广泛，已经成为了人们了解微观世界不可缺少的工具。下面，我们先来认识一下现在最常用、最普通的一种显微镜。在学习以前，我们先来看一下如何进行取镜和安放。取镜和安放可概括为几步：右手握，左手托，略偏左，安目镜。右手握镜臂，左手托镜座，放在实验台略偏左的地方距边缘7厘米左右，安装好目镜和物镜。下面，大家就按照这一步骤先来练习一下。安放好以后请大家对照教材上的图，认识一下各结构名称。学生活动：对照彩图认识各结构名称。教师作适当指导。教师活动：认识了各结构以后，更重要的是会使用它来进行观察物
共聚焦显微镜 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管 (photomultipliertube，pmt)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有
划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了 30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分
显微镜的结构和使用（教案） 授课人：江枫渔火 一．教学目标 1.知识目标：掌握显微镜的结构以及各部件的名称和功能。 2.能力目标：能独立、规范地使用显微镜并观察到清晰的物象。 3.情感目标：通过学习养成规范实验的良好习惯和科学意识。二．教学重难点 1.重点：认识显微镜的结构，掌握显微镜的使用步骤。 2.难点：规范使用显微镜，并能观察到清晰的物象。 三．学情分析 本次授课对象是刚接触生物实验的七年级学生,本节课内容学习显微镜的结构和使用。 由于本节课内容涉及较深的动手能力，故在教学中，通过启发式教学，设置大量的问题情境，来激发学生的学习兴趣和进一步培养他们的实验能力和科学意识。 四．教学过程设计 1.导入新课 本节课直接导出显微镜，因为本节课是学生从宏观生物到微观生物认识的转折点，在以后的学习中离不开显微镜的使用。 2.新课讲授 （1）显微镜的结构 通过挂图和实物相结合的方法对显微镜的结构进行细致的讲
授。具体从机械部分、照明部分和光学部分三方面讲述各部分结构和功能。 (2)显微镜的使用 通过具体实验来讲授显微镜的实验步骤，在讲述各步骤时以启发学生思考为主，强调个步骤中需要注意的事项。 a．取镜和放置：取出时，右手紧握镜臂，左手托住镜座，将显微镜放在左肩前方的位置。（学生思考原因） b．对光：用拇指和中指移动旋转器（切忌手持物镜移动），使用低倍镜对准镜台的通光孔（听到碰扣声时以对准）。打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源，以左眼观察（右眼打开），同时调节反光
镜方向，直到视野中光线均匀明亮为止。（学生思考为什么是先用低倍镜观察） c．放置装片：取装片于载物台上（切记是有盖玻片的一面朝上），用推片器弹簧夹住，然后旋转退片器螺旋，将索要观察的部分调到通光孔中央。 d．低倍镜观察：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5毫米处，应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察。一定要从右侧看着载物台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使载物台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物象为止。 如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心(注意移动装片的方向与视野物象移动的方向是相反的)。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，载物台下降已超过工作距离(>5.40mm)而未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地上升载物台。 e．高倍镜观察：一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物象调节到最清晰的程度，才能进行高倍镜的观察。 转动转换器，调换上高倍镜头，转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察(防止高倍镜头碰撞装片)，如高倍镜头碰到装片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。 调节焦距，转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察，此时一般能见
荧光显微镜 一.荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的
光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 二．工作原理 光源 多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15m i n。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。 新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一
共聚焦显微镜原理及其应用 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。 共聚焦显微镜的应用。细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。 1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化 2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析 3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学 4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态 5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布 6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构 7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等 8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断 激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用： A.在细胞及分子生物学中的应用 1. 细胞、组织的三维观察和定量测量 2. 活细胞生理信号的动态监测 3. 粘附细胞的分选 4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能 5. 光漂白后的荧光恢复 6. 在细胞凋亡研究中的应用 B.在神经科学中的应用 1. 定量荧光测定 2. 细胞内离子的测定