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2.1 概述
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。λ
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：λ
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。λ
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。λ
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。λ
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。λ
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：λ
①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。λ
②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。λ
③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。λ
④生物材料的破碎和预处理。λ
⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。λ
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。λ
⑦产物的浓缩，干燥和保存。λ
λ
分析测定的方法主要有两类：λ
即生物学和物理、化学的测定方法。λ
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；λ
物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。λ
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。λ
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：
①在水和各种有机溶剂中的溶解性。λ
②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。λ
③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。λ
④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。λ
⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。λ
⑥对其他生物分子的特殊亲和力。λ
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。λ
各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：λ
①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；λ
②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。λ
目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。λ
2.2 生物大分子制备的前处理λ
2.2.1 生物材料的选择λ
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。λ
选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。λ
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。λ
植物要先去壳、除脂。λ
微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。λ
生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。λ
2.2.2 细胞的破碎λ
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。λ
(1)机械法：λ
1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。λ
2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。λ
(2)物理法：λ
1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。λ
2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。λ
3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。λ
4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。λ
(3)化学与生物化学方法：λ
1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。λ
2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。λ
3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。λ
4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。λ
λ
2.2.3 生物大分子的提取λ
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。λ
影响提取的因素主要有：λ
目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；λ
由固相扩散到液相的难易；λ
溶剂的pH值和提取时间等。λ
通常：λ
极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；λ
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；λ
温度升高，溶解度加大；λ
远离等电点的pH值，溶解度增加。λ
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。λ
⑴水溶液提取：λ
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：λ
1) 盐浓度（即离子强度）：λ
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。λ
绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。λ
为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。λ
λ
2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。λ
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。λ
4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。λ
5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。λ
⑵有机溶剂提取λ
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。λ
常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。λ
有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。λ
例如，胰岛素（见讲义p36）。
2.3 生物大分子的分离纯化λ
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。λ
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：λ
沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。λ
2.3.1 沉淀法λ
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。λ
其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。λ
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：λ
⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。λ
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。λ
⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。λ
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。λ
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。λ
2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）λ
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。λ
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：λ
①成本低，不需要特别昂贵的设备。λ
②操作简单、安全。λ
③对许多生物活性物质具有稳定作用。λ
⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理λ
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中
性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图4”所示。λ
⑵中性盐的选择λ
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：λ
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：λ
表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）λ
0℃20℃80℃100 ℃λ
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2λ
NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101λ
λ
λ
λ
λ
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵λ
盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯
度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的λ
作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的
（NH4）2SO4保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。λ
⑶盐析的操作方法λ
最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。λ
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。λ
各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。λ
⑷盐析曲线的制作λ
如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义p39)：λ
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱
和度％
⑸盐析的影响因素λ
1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。λ
2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。λ
3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。λ
λ
2.3.1.2 有机溶剂沉淀法λ
⑴基本原理λ
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：λ
①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。λ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。λ
λ
有机溶剂沉淀法的优点是：λ
①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。λ
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。λ
其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。λ
⑵有机溶剂的选择和浓度的计算λ
用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。λ
为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。λ
⑶有机溶剂沉淀的影响因素λ
1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。λ
一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。λ
2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。λ
通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。λ
λ
3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。λ
4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。λ
沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。λ
2.3.1.3 选择性变性沉淀法λ
这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。λ
⑴热变性λ
利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。λ
⑵表面活性剂和有机溶剂变性λ
使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。λ⑶选择性酸碱变性λ
利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。λ
2.3.1.4 等电点沉淀法λ
利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。λ
由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。λ
此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。λ
2.3.1.5 有机聚合物沉淀法λ
有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是λ
“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的PEG。
本方法的优点是：λ
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。λ
②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多λ
的生物大分子。
③沉淀后有机聚合物容易去除。λ
2.3.2 透析λ
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。λ
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常为1万左右。λ
用1％BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％AgNO3 检查NaCl、KCl等。λ
2.3.3 超滤λ
超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。λ
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。λ
超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。λ
微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。λ
超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。λ
反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。λ
超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。λ
在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。λ
超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。λ
超滤技术的关键是膜。λ
常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。λ
超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。λ
超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。λ
由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。λ
2.3.4 冰冻干燥λ
冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥。
收稿日期：2011－12－20 作者简介：陈曦，男，1982年生，助理研究员。通讯作者：林能锋，男，1972年生，博士，副研究员 （E －mail ：lnfeng@https://www.doczj.com/doc/b816476632.html, ）。 海洋生物活性物质研究简述 陈 曦，陈秀霞，陈 强，林能峰 （福建省农业科学院生物技术研究所350003） 摘 要：海洋生物已成为天然药物的重要来源之一，从各类海洋生物中可提取分离到具有各种药用活性的化合物，具有开发成新药的潜力。该文对海洋生物活性物质主要种类、研究方法和具体 应用进行了简要阐述，同时对海洋生物活性物质的研究方向及前景进行了展望。关键词：海洋生物；活性物质；抗菌；抗肿瘤 Brief description to active material of marine organism CHEN Xi ，CHEN Xiu-xia ，CHEN Qiang ，LIN Neng-feng （Biotechnology Institute ，Fujian Academy of Agricultural Sciences 350003） Abstract ：Marine organism has become one of important source of natural medicines．Medicinal active compounds extracted and separated from which have the potential of being new medicines．In this paper ，the main kinds ，research method and concrete application of marine organism were briefly expounded ，and the research direction and foreground of marine organ-ism in near future were prospected． Key words ：Marine organism ；active material ；antibacterial ；antitumor 海洋约占地球表面积的71%，生活着20多万种生物。在高盐、高压及缺氧的环境下，很多海洋生物在长期进化过程中能够代谢产生一些结构独特的化学物质，其中具有重要作用的生物活性物质虽然众多，但真正进入临床应用的却非常稀少。随着生物技术的发展，运用现代生化分离与分析手段，通过细胞培养、DNA 重组等技术，可能从海洋中获取大量低毒、高效的活性物质。目前，海洋生物活性物质的主要活性研究侧重在抗癌与抗菌等方面，而具有生物活性的主要海洋生物资源是海洋无脊椎动物，如草履虫、海兔、海鞘、海绵、海藻（包括微藻）及海洋微生物等。 1国内外海洋生物活性物质研究现状 美国是最早研究海洋生物抗菌肽物质的国家之一。随着“回归自然”浪潮的出现，人们越来越关心环境生态与污染、化学致癌物等的关系。天然产物的化学分离与化学分析的长足进步，使现在能以 从前根本不可实现的速度进行分子的提取与鉴定。日本海洋生物技术研究院及海洋科学和技术中心每年用于海洋生物活性物质开发的经费为1亿多美元。在海洋生物活性物质方面的研究发展很快，对海洋微生物、微藻类、海绵、芋螺、海参等多种海洋动植物和微生物等所产生的活性物质进行研 究，其中以海绵和海藻类研究最多［1］ 。 欧盟制订了海洋科学和技术计划，重点资助项 目中有“从海洋生物资源中寻找新药” ，近年来，发现了450多个具有不同生物活性的新海洋天然产 物，其中31个化合物具有明显的抗肿瘤活性。每 年用于海洋药物开发的经费也有1亿多美元［2］ 。 我国利用海洋生物资源入药治疗、健体强身的 历史非常悠久。但现代海洋药物研究则始于20世纪70年代。1997年我国启动海洋高技术计划，海洋药物的开发被列为重点，从而以沿海城市为中心，形成科研、生产、开发技工贸一体化的生产网络 ［3］ 。 2 海洋生物活性物质的种类与生理作用 2.1 抗菌肽 抗菌肽是动物机体具有天然免疫力的重要原因，其抗菌机制推测是其—helix 结构可在细菌的
海洋药物研究现状及进展 摘要：21世纪是海洋的世纪,海洋资源丰富，海洋不仅是人类食物的重要来源,也是重要的天然药源宝库。本文综述了海洋动物、海洋植物中生物活性成分以及海洋中药的研究现状。结合国内外海洋药物研究的趋势，展望了海洋药物的发展前景。 关键词：海洋药物；研究现状；发展趋势； 21世纪是海洋的世纪,是人们开发利用海洋资源的世纪。海洋是一个巨大的药物宝库。在海洋生物体内合成的化合物，很多对人及其他动物的代谢过程有活性作用，不少活性物质既可制成抗肿瘤、抗病毒、抗心脑血管疾病、抗衰老及消炎镇痛的高效药物，也可开发成强身健体并有一定辅助疗效的功能食品。另外，由于海洋生物的独特生活环境，因而常含有陆地生物没有的成分，其化学结构独特，功能特异。这样，若制成海洋药物，就成为防治威胁人类健康的疑难杂症的希望所在。如海洋中褐藻胶寡糖及其衍生物具有抗心脑血管疾病、抗老年痴呆等；卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤活性等；甲壳胺寡糖及其衍生物具有抗动脉粥样硬化、提高机体免疫活性等；琼胶寡糖则具有抗氧化和抗糖尿病活性等。 1海洋药物研究现状 1.1海洋中药研究 海洋中药传统药材有昆布、海带、紫菜、海人草、乌贼骨(海螵蛸)、海马、海龙、海月、南珠、玳瑁、鲍壳、文蛤、海参、牡蛎、海胆等多种。涉及的海洋生物包括绿藻、褐藻、红藻等藻类，以及腔肠动物、环节动物、软体动物、节肢动物、棘皮动物、脊索动物等。药用部位包括藻类的全体,动物的壳、肉、脂、卵等。目前，我国以海洋生物制成的单方药物有22种,以海洋生物配伍其他药物制成的复方中成药有152种。这些药物如双海止咳膏、复方褐藻酸胶囊、海力特、复方全牡蛎胶囊、海珍玉液、珍珠精母口服液、海蛇祛风湿灵胶囊、海蛇海龙口服液等,将中医药理论与现代医药学及高新技术融为一体,在临床上发挥了重要 作用。海洋中药的制剂除汤剂、散剂、丸剂、膏剂、丹剂、酒剂等传统剂型外，,还有海珠晶注射剂、海珠喘息定片、鱼油微丸、鲨鱼软骨胶囊、海星胶代血浆等少量新剂型制剂。[1]海洋中药新剂型的研究力度和深度,尚需进一步加大。 1.2海洋植物药物研究 海藻内含有大量有益于人类健康的药用活性成分,其多糖、不饱和脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、牛磺酸、多萜、甾类和酶等成分具有抗凝血、降血压、降血脂、抗肿瘤等独特功能,可用于预防和治疗高脂血症、动脉硬化、肿瘤等多种疾病,改善人体微循环,并可用于生产中、老年人抗衰老、抗疲劳及增强免疫力的保健品。 1.2.1海洋藻类对血液作用和降血脂作用 现在，心脑血管疾病是人类健康的第一大杀手。据报道，紫菜多糖有降血脂、抗凝血、降低血糖粘滞度、抑制血栓形成的作用。如此单一成分就有了诸多的功效。为此，许多学者在该方面下了很大的功夫去探寻更多新颖、有效的成分。目前，更多的是在做动物实验，而且也取得了一定的成效。如PSS对家兔有抗凝血活酶样作用和抗凝血酶作用，抗凝效价相当于肝素33.9％，其作用机制类似肝素[2]，还有研究表明，螺旋藻可明显抑制大鼠血小板聚集和实验性血栓的形成。研究也发现褐藻淀粉硫酸酯（LS）有似肝素样抗凝血作用和降血脂作用，并发现低硫酸化的LS有很强的降血脂作用，无明显的抗凝血活性。其对血浆脂质
从茶叶中提取茶多酚及咖啡碱实验设计 一、茶多酚相关 从百度百科○1中，我了解到： 学名:Camellia sinensis 简称:GTP 别名:茶鞣质、茶单宁 物理性状： 1 外观：白色晶体。2 易溶于水及有机溶液，味苦涩。 稳定性：在 PH4-8 稳定。遇强碱、强酸、光照、高热及过渡金属易变质。最高耐热温度在1个半小时内，可达250℃左右，在三价铁离子下易分解。 安全性评价：无毒 定义：是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称。 成分：是一种稠环芳香烃，可分为黄烷醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，约占多酚类总量的60%-80%；儿茶素类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在20—35%。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70％左右。 理化性质 1、物理性质 茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末，易溶于温水(40℃一80℃)和含水乙醇中；稳定性极强，在PH值4—8、250℃左右的环境中，1.5个小时内均能保持稳定，在三价铁离子下易分解。1989年被中国食品添加剂协会列入GB2760-89食品添加剂使用标准，1997年列为中成药原料。 2、化学性质 茶多酚是从茶叶中提取的全天然抗氧化食品，具有抗氧化能力强，无毒副作用，无异味等特点。 茶多酚是指茶叶中一大类组成复杂、分子量及其结构差异很大的多酚类及其衍生物混合物，主要由儿茶素、黄酮醇、花色素、酚酸及其缩酚酸等组成的有机化合物，以儿茶素为主的黄烷醇类化合物占茶多酚总量的60％一80％，其中含量最高的几种组分为L—EGCG(50％-60％)、L—EGC(15％-20％)、L—ECG(10％-15％)和L—EC(5％-10％)。 药理作用○2 1．具有很强的消除有害自由基的作用。 2．抗衰老作用。 3．抗辐射作用。 4．对癌细胞的抑制作用。
茶多酚 学名:Camellia sinensis 简称:GTP 别名:茶鞣质、茶单宁 英文名：tea Polyphenol，简称TP 定义:是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称。 成分:可分为黄烷醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，约占多酚类总量的60%-80%；儿茶素类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在15％－－20％。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70％左右。茶多酚的理化性质 物理性状： 1 外观：棕黄、淡黄或淡黄绿色粉末。 2 性状：易溶于水及乙醇，味苦涩。 稳定性：在PH4-8 稳定。遇强碱、强酸、光照、高热及过渡金属易变质。最高耐热温度在1个半小时内，可达250℃左右，在三价铁离子下易分解。 安全性评价：无毒 茶多酚具有很强的抗氧化作用，其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT、BHA 的4-6倍，是VE的6-7倍，VC的5-10倍，且用量少：0.01-0.03％即可起作用，而无合成物的潜在毒副作用；儿茶素对食品中的色素和维生素类有保护作用，使食品在较长时间内保持原有色泽与营养水平，能有效防止食品、食用油类的腐败，并能消除异味 【药理作用】 1．具有很强的消除有害自由基的作用。 2．抗衰老作用。 3．抗辐射作用。 4．对癌细胞的抑制作用。 5．抗菌、杀菌作用。 6．对艾滋病病毒的抑制作用。 【主要用途】 实际上茶叶的许多作用都是因为茶叶中的茶多酚在起作用。茶多酚可用于食品保鲜防腐，无毒副作用，食用安全。茶叶能够保存较长的时间而不变质，这是其他的树叶、菜叶、花草所达不到的。茶多酚参入其他有机物（主要是食品）中，能够延长贮存期，防止食品退色，提高纤维素稳定性，有效保护食品各种营养成份。其主要用途如下:
螺旋藻多糖研究综述
螺旋藻多糖研究综述 摘要：螺旋藻多糖是从螺旋藻体、螺旋藻培养液中提取分离出来的一类具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能的重要天然生物活性物质，也是国内外海洋药物研究开发的热点。本文对螺旋藻多糖的药理作用进行了相关综述。 关键词：螺旋藻多糖；生物活性；抗癌 Abstract:Spirulina polysaccharide from Spirulina body, spirulina culture liquid extraction and separation out of a class of functions to promote cell growth, enhance immunity, anti-tumor, anti-oxidation, enhance the role of the endonuclease enzyme activity and DNA repair synthesisan important natural biologically active substances, domestic and international marine drug research and development of hot spots. In this paper, the pharmacological effects of Spirulina polysaccharide relevant reviews. Key words: Spirulina Platensis Polysaccharide；biological activity；Anti-tumor 1.前言 螺旋藻是一种生长于30亿年前的多细胞丝状蓝藻,地球上最早进行光合作用的植物之一,还保持许多古代原始藻类的一些特点。其结构简单,没有原核,个体成丝状,因缠绕成螺旋状而得名。螺旋藻属蓝藻颤藻科中的一个“属”,约38种,广泛分布于热带、亚热带和暖温带的海洋、湖泊、温泉,特别是盐碱湖泊,生长繁殖更为旺盛。螺旋藻属中的极大螺旋藻和钝顶螺旋藻最重要,目前已得到国内外深入的研究和广泛的应用开发。 螺旋藻中含有丰富的生理活性成分,如r-胡萝卜素、叶绿素、r-亚麻酸、维生素、微量元素、藻蓝蛋白,尤其是螺旋藻多糖都具有重要的医疗保健价值。因此, 螺旋藻及其多糖开始得到广泛应用,并开发出各种产品和技术。 目前认为螺旋藻及其提取物具有多种生物学作用: (1)提高机体免疫能力, 有抗癌防癌作用; (2)抗疲劳, 抗衰老作用; (3)抗辐射作用; (4)助长体内乳酸杆菌生长; (5)改善过量金属对人体的有害影响; (6)降血脂和胆固醇 (7)促进皮肤和外伤的愈合及抗菌作用。
实验二十茶叶中有效成分的提取 一、实验目的 1.通过茶叶和咖啡中有效成分的提取了解固、液相分离方法； 2．掌握吸滤、萃取、分液、升华等实验操作。 二、实验原理 咖啡因( caffeinum )化学式为C8H10N402 - H20(1，3，7-三甲基-2，6-氧嘌呤)，是具有绢丝光泽的一种白色针状晶体。其结构式为 100℃时晶体失去结晶水后开始升华，120℃时升华显著，至178℃时升华很快。无结晶水物的熔点为235℃，能溶于水(2%)、乙醇(2%)、苯(1%)、氯仿(12.5%)等。 由于其在氯仿中溶解度较大，可通过萃取茶叶的水浸渍液提取咖啡因。根据其易升华的性质，可用升华法进一步提纯咖啡因。 茶多酚是由30种以上的酚类物质组成的混合物。其中儿茶素（又名儿茶酚）含量最高，在茶多酚总量中占60%—80%。其结构式为 茶多酚在乙酸乙酯中溶解度较大，并且能与重金属作用产生沉淀，故可用沉淀、萃取等方法来提取茶多酚。也可用此方法从细、粗咖啡中提纯咖啡因作为对照实验。 三、实验用品
仪器和材料烧杯(50、100、200mL)、50rnL量筒、150mL分液漏斗、布氏漏斗、吸滤瓶、酒精灯、点滴板，真空泵（或水流吸气泵）、托盘天平、剪刀、铁架台、滤 纸。 药品饱和石灰水、5%氢氧化钠溶液、氨水、2mol．L-1硫酸、盐酸、氯仿、乙酸乙酯，茶叶（当年新茶，隔年陈茶）、咖啡（粗，细）、氢氧化钙固体、氯酸钾固体，酸性碘一碘化钾试剂。 四、实验内容及操作 1．方法I-热水浸渍法 (1)称取5.0g茶叶，剪碎，浸渍于盛有200mL蒸馏水的烧杯中； (2)加热煮沸约半小时； (3)过滤； (4)用30mL氯仿分三次(15、8、7mL)萃取滤液，合并氯仿相，先用5%氢氧化钠溶液，再用适量水洗涤； (5)挥发掉有机溶剂[4]，得粗咖啡因； (6)用30mL乙酸乙酯分三次(15、8、7mL)萃取氯仿萃取过的水相； (7)用适量水洗涤萃取液； (8)挥发有机溶剂，即得茶多酚。 2．方法Ⅱ——碱液浸渍法 (1)称取茶叶5.Og，用剪刀剪碎； (2)将茶叶放人盛有200mL饱和石灰水的烧杯中； (3)再向烧杯中投入2,Og氢氧化钙固体； (4)煮沸30min后过滤； (5)将过滤所得清液用30mL氯仿分三次萃取(15、8、7mL)； (6)合并有机相，先用5%氢氧化钠溶液洗涤，再用适量水洗涤； (7)将洗涤后的氯仿相挥发溶剂[41可得粗咖啡因； (8)将过滤所得固相用硫酸溶液(2mol.L-1)100mL转溶，搅拌10min以上； (9)过滤，固相弃去；
实验六：咖 啡 因 的 提 取 【实验目的】 1、学习生物碱提取及其衍生物的制备方法； 2、学会升华操作； 【实验原理】 咖啡碱具有刺激心脏，兴奋大脑神经和利尿等作用。主要用作中枢神经兴奋药。它也是复方阿斯匹林（A. P. C ）等药物的组分之一。现代制药工业多用合成方法来制得咖啡碱。 茶叶中含有多种生物碱，其中咖啡碱（或称咖啡因,caffeine ）含量约1%-5%，丹宁酸（或称鞣酸）约占11%-12%，色素、纤维素、蛋白质等约占0.6%。咖啡因是弱碱性化合物，易溶于氯仿、水、热苯等。 咖啡碱为嘌呤的衍生物，化学名称是1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，其结构式与茶碱，可可碱类似。 嘌呤（Purine ） 咖啡因(Caffeine) 茶碱(Guanine) 可可碱(Adenine) 含结晶水的咖啡碱为白色针状结晶粉末，味苦。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等。微溶于石油醚，在100℃时失去结晶水，开始升华。120℃时升华显著，178℃以上升华加快。无水咖啡因的熔点为238℃ 从茶叶中提取咖啡因，是用适当的溶剂（氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续抽提，浓缩得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有一些其它的生物碱和杂质，可利用升华进一步提纯。咖啡因是弱碱性化合物，能与酸成盐。其水杨酸盐衍生物的熔点为138℃，可借此进一步验证其结构。 【操作过程和实验装置图】 N N NH N 12 3 67 9 CH 3 3 CH 3 N N O O N N N O O CH 3 NH N CH 3N N N CH 3 HN N O O 3
1、生物碱及其衍生物的提取与制备方法。 2、升华操作 流程 图2.8.2 常压升华装置 【实验关键和注意事项】 （1）滤纸套筒大小要合适，以既能紧贴器壁，又能方便取放为宜，其高度不得 超过虹吸管；要注意茶叶末不能掉出滤纸套筒，以免堵塞虹吸管；纸套上面折成凹形，以保证回流液均匀浸润被萃取物，也可以用塞棉花的方法代替滤纸套筒。用少量棉花轻轻阻住虹吸管口。 （2）瓶中乙醇不可蒸得太干，否则残液很粘，转移时损失较大。 （3）生石灰起吸水和中和作用，以除去部分酸性杂质。 （4）在萃取回流充分的情况下，升华操作是实验成败的关键。升华过程中，始 终都需用小火间接加热。如温度太高，会使产物发黄。注意温度计应放在合适的位置，使正确反映出升华的温度。 【主要试剂及产品物理常数】
3 生物碱的碱性与哪些有关 (1)氮原子的杂化类型:随杂化度升高而增强；②诱导效应：氮原子所连接的基团如为供电基团则碱性增强，如为吸电基团则碱性减弱；③诱导一场效应：使生物碱的碱性降低；④共轭效应：若生物碱分子中氮原子孤对电子成P-兀共轭体系时，通常情况下，其碱性较弱；⑤空间效应：若生物碱的空间环境不利于氮原子接受质子，其碱性减弱；反之，则碱性增强；⑥分子内氢键形成：若生物碱分子结构中氮原子附近存在羟基、羰基等取代基团，碱性增强。 4．生物碱类化合物的鉴别方法①沉淀反应：大多数生物碱能和某些酸类、重金属盐类以及一些较大分子量的复盐反应，生成单盐、复盐或络盐沉淀。如与碘化铋钾试剂的反应； ②显色反应：用于生物碱的冠色试剂很多，它们往往因生物碱的结构不同而显示不同的颜色，Mandelin试剂(1％钒酸铵的浓硫酸溶液)；③成盐反应：绝大多数生物碱可与酸形成盐类，但不同类型的生物碱与酸成盐的形式不同，主要有：季铵生物碱的成盐反应、含氮杂缩醛生物碱的成盐反应、具有烯胺结构生物碱的成盐反应、涉及氮原子跨环效应生物碱的成盐反应。 5．生物碱类化合物的提取一般从天然药物巾提取总生物碱通常采用溶剂法、离子交换法、沉淀法等提取分离方法。①对于脂溶性生物碱可采取酸水提取法、醇类溶剂提取法、亲脂性有机溶剂提取法；②对于水溶性生物碱可采取沉淀法、溶剂萃取法。 6．生物碱类化合物的分离对于生物碱的分离通常分为系统分离与特定分离。一般的方法是先对总碱进行初步分离，将性质相近的生物碱分成几个类别或部位。然后再按各成分的碱度、极性或功能团的差异分离生物碱单体。①总生物碱的初步分离：根据总生物碱中各成分理化性质的差异，可将其初步分离为强碱性的季铵碱、中等强度碱性的叔胺碱及其酚性碱、弱碱性生物碱及其酚性碱等几个部分；②生物碱单体的分离：利用生物碱碱性的差异、利用生物碱极性的差异或生物碱盐的溶解度差异、利用生物碱特殊官能团、利用色谱法进行分离。 7．生物碱类化合物的结构鉴定①色谱法：色谱法在生物碱鉴别中的应用主要体现在天然药物及天然药物制剂中有无生物碱存在的检识、指导生物碱的分离、检查生物碱的纯度及对已知生物碱的鉴定等多个方面，主要有：薄层色谱法、纸色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法；②谱学法：目前，在生物碱结构鉴定工作中，最常用的分析方法有紫外光谱(U V)、红外光谱(IR)、质谱(M S)和核磁共振 (N M R)。 【习题】 一、名词解释 1．生物碱 2．两性生物碱 3．生物碱沉淀反应 4．诱导效应 5．共轭效府 6．空间效应 7．诱导一场效应 8．氢键效应 二、填空题 1．小檗碱呈黄色，而四氢小檗碱则无色，其原因在于。 2．弱碱性生物碱在植物体内是以状态存在。 3．在生物碱的色谱检识中常用的显色剂是，它与生物碱斑点作用常显色。 4．Mayer’s试剂的主要成分为；Dragendorff’s试剂的主要成分为。 5．总生物碱的提取方法大致有以下三类：、、。 6．麻黄碱和伪麻黄碱的分离可利用它们的——盐在水中的溶解度不同，在水中溶
生物碱提取和分离方法的研究新进展 令狐文艳 摘要: 生物碱是一类具有生理活性的物质，是许多药用植物的重要有效成分之一。如何从天然产物中提取与分离生物碱是生物碱制备的关键环节。它吸引了人们的广泛关注，其提取与分离方法也不断地改进和发展。本文综述了近年来，不同的提取和分离方法在生物碱制备中的应用和进展。随着众对生物碱药用价值的认识提高，生物碱的撮与分离方法将更加高效、迅速、完善。 关键词:生物碱；提取；分离；研究；进展 1.前言 生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物，具有广泛的生理功能，是许多药用植物的有效成分 ,目前运用于临床的生物碱药品已达80 种之多 ,相当多的生物碱具有抗肿瘤活性、低毒性和成本低之特性 ,因而引起了人们的广泛关注[1 ]。与此同时 ,人们对生物碱的提取和分离方法研究也在不断地深入和加强。随着各类生物碱的市场需求量的增加 ,经济效益的提高 ,提取分离生物碱的方法也在不断改进和提高。 2.生物碱提取方法的研究进展 绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取。生物碱及其盐类的溶解度与生物碱分子中氮原子的存在形式、极
性基团的有无及数目、溶剂种类都有密切关系。极性强的生物碱亲水性较强, 易溶于极性溶剂；弱极性生物碱亲脂性较强,易溶于弱极性溶剂。游离的生物碱大多亲脂性较强, 而生物碱盐一般亲水性较强。按极性强弱可将生物碱提取溶剂分为极性溶剂、半极性溶剂和非极性溶剂[2]。 2. 1 按所用溶剂不同可分为以下几种方法 2. 1. 1 水提取法(以水作溶剂) 直接以水作为溶剂 ,采用最佳的提取工艺来提取生物碱。此法操作简便 ,成本较低 ,但提取次数多 ,水用量大。如蒙药忠论— 5 汤提取[3 ]就是一个很好的例子。 2. 1. 2 酸性水溶液提取法 对于那些碱性较弱不能直接溶解于水的生物碱提取 ,就可采用偏酸性的水溶液 ,使生物碱与酸作用生成盐而得到提取。 2. 1. 3 碱性水溶液提取法 对于那些化学结构非常独特、化学性质与一般生物碱不同且在酸性或中性条件下不稳定的生物碱来说 ,可以采用此法。而原有的乙醇作为溶剂渗漉提取法 ,不仅存在成本高 ,而且存在防火等级高、提取时间长、能耗大等诸多问题 ,远不如使用稀NaOH溶液好。 2. 1. 4 有机溶剂提取法 (1) 乙醇提取法在生物碱的提取中应用较为普遍 ,对于游离生物碱及其盐类一般采用乙醇提取法。
《天然药物化学》实验教学大纲 (供四年制药学本科药物制剂、药品检验专业使用) Ⅰ前言 《天然药物化学实验》是天然药物化学课程的重要组成部分。其主要目的是：通过实验，检验在课堂上所学的理论知识。使学生对理性知识的理解更加深入，掌握得更加牢固。通过实验，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练。在实验中，重点是要加强对学生基本操作技能的训练。天然药物化学实验要求学生掌握以下技能：（一）提取分离方面：要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等）、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、反流分布法）、重结晶法等。掌握纸色谱、薄层色谱的原理和基本操作。（二）鉴定方面（化学方法）：①掌握一般定性反应在鉴定中的用，②掌握重要衍生物（乙酰化物等）的制备方法及其在结构鉴定中的应用。本大纲适用于四年制本科药物制剂、药品检验专业使用。 现将大纲使用中有关问题说明如下: 一为了使教师和学生更好地掌握教材,大纲每一章节均由教学目的、教学要求和教学内容三部分组成。教学目的注明教学目标，教学要求分掌握、熟悉和了解,教学内容与教学要求对应,并统一标示(核心内容即知识点以下划实线,重点内容以下划虚线,一般内容不标示)便于学生重点学习。 二教师在保证大纲核心内容的前提下,可根据不同教学手段,讲授重点内容和介绍一般内容。三总教学参考学时为36学时。 四使用教材：《天然药物化学实验指导》，人民卫生出版社，裴月湖主编，第一版，2006年。 II 正文 实验一芦丁的提取、分离与鉴定 一教学目的 学习碱提酸沉法提取黄酮类化合物的原理及方法；掌握化学鉴别、苷的水解；了解其衍生物制备和薄层层析、纸色谱等方法手段在苷类结构鉴定上的作用；了解光谱法在黄酮类化合物结构鉴定中的作用。 二教学要求： （一）掌握碱提酸沉法提取黄酮类化合物的方法原理。 （二）掌握化学方法鉴别苷元、苷及糖；苷的水解。 （三）了解衍生物制备和薄层层析等方法手段在苷类结构鉴定上的作用。 （四）了解光谱法在黄酮类化合物结构鉴定中的作用。 三教学内容 （一）称取槐花米粗粉20g，置于500ml烧杯中，加入沸水250ml及硼砂1g，在搅拌下加石灰乳调至pH8~9保持微沸30分钟，不断补充蒸发掉的水分，以保持pH8~9，趁热用尼龙布拧挤过滤，滤渣再加100ml沸水，再提取一次。合并滤液，在60℃~70℃用浓盐酸调pH4~5，放置过夜，抽滤，沉淀用水洗至中性，置空气中晾干得粗品芦丁。 （二）槐花米中芦丁成分的预试：取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： 1. 盐酸-镁粉反应。
1）抽提 称取10g茶叶，放入索氏提取器的滤纸套筒中（底部垫少许棉花）, 并加入95%乙醇至离虹吸管顶端1cm处。再在圆底烧瓶中加入30ml95%乙醇，加一块沸石。再由下至上装好提取装置，连续提取2～3小时（大约虹吸5次，第6次提取液不用虹吸入烧瓶）。 2）回收乙醇 稍冷后，将茶叶弃之，提取液全部倒入圆底烧瓶中，改为蒸馏装置，回收提取液中的大部分乙醇。将底烧瓶中液体浓缩至约20～30ml，稍冷后，趁热将烧瓶中的残液倾入蒸发皿中，在蒸汽浴上浓缩至5～6ml后，拌入3-4g生石灰粉，使成糊状，在蒸气浴上蒸干，其间应不断搅拌，并尽可能压碎块状物，使之完全成干粉。（注：可用烧杯加水后在电炉上产生热蒸汽，将蒸发皿置于烧杯口。小心烫伤！） 3)升华提纯 最后将蒸发皿放在大铁圈上，用电炉进行空气加热（＜100℃），大铁圈与电炉保持12～15cm。期间仍不断搅拌。使水分全部除去（注意：小心操作铁圈，切勿烫伤！浓缩和干燥过程中温度不能太高，应严防焦化、炭化）。冷却后，擦去沾在边上的粉末，以免在升华时污染产物。粉末表面盖上一张刺有许多小孔的滤纸。取一支口径合适的玻璃漏斗，罩在盖有滤纸的蒸发皿上，在空气浴中小心加热升华。控制砂浴温度在120℃～140℃左右，此时滤纸上出现许多白色毛状晶体，暂停加热，让其自然冷却至100℃左右。小心取下漏斗，揭开滤纸，用刮刀将纸上和器皿周围的咖啡因刮下。然后重新装好升华装置，调高温度到150～170℃，重复第一次升华过程，合并两次收集的咖啡因，称重。 1.称取干茶叶8g装入滤纸筒中，轻轻压实，放入索氏提取器中，另外在圆底烧瓶中加入100mL 95%乙醇，放入一粒沸石，安装好索氏提取装置（脂肪提取器）。小火加热至沸腾，连续提取1小时，此时提取液的颜色变得很淡，待提取器中的液体刚虹吸下去时，立即停止加热。 ⒉装好蒸馏装置，将萃取液倒入蒸馏瓶中蒸除乙醇。当蒸馏瓶中液体剩约8mL时，立即停止蒸馏，将残留液倒入蒸发皿中，加入4g生石灰（起中和及脱水作用）。在蒸气浴上加热，赶尽乙醇，然后将蒸发皿移至石棉网上焙烧，除尽水分。 ⒊在蒸发皿上盖一张用大头针刺有许多小孔的圆形滤纸，取一个合适的玻璃漏斗罩在滤纸上，在石棉网上小心加热，逐渐升温，尽可能使升华速度慢一些，提高结晶纯度。咖啡因蒸气通过纸孔遇到漏斗内壁冷却，直到冷凝为固体，附着在漏斗内壁和滤纸上。当滤纸上出现大量白色晶体时，停止加热，揭开漏斗和滤纸，观看咖啡因的颜色形状，仔细用小刀将附在其上的咖啡因刮下。 ⒋若产品中仍含有杂质或色素，可用半微量减压升华管再次升华：将粗咖啡因放入一个试管底部，把装好的仪器放入油浴中，浸入深度以直型冷凝管的底部与油表面在同一水平面为宜。冷凝管内通入冷却水，开启水泵抽气减压，并加热油浴至(180～190)℃，咖啡因升华凝结于直型管上。小心取出冷凝管，将咖啡因刮在洁净的表面皿上。 纯净的咖啡因为熔点236℃的白色针状晶体
海洋科学/2006年/第30卷/第7期 76海洋微生物毒素研究进展 Advance in research of marine microbial toxins 王 新，郑天凌，胡 忠，苏建强 （厦门大学 生命科学学院 应用与环境微生物研究所，福建 厦门 361005） 中图分类号：Q938.8 文献标识码：A 文章编号：1000-3096（2006）07-0076-06 浩瀚的海洋世界具有高盐、高压、低温、寡营养等诸多特点。海洋中生存着丰富多样的海洋微生物，它们产生了多种多样的生物活性物质，如生物信息物质、药用活性物质、海洋生物毒素和生物功能材料等[1]。其中海洋生物毒素是当前研究中的一个热点，它具有化学结构多样、分子量小、生物活性高及作用机理独特等诸多特点。几乎所有的海洋生物种类都有产毒的个体，近年来的研究表明，作为一个庞大的类群，海洋微生物产毒种类繁多，如细菌、真菌、放线菌以及微藻等[2] 。与此同时人们还发现海洋微生物与其它的一些生物毒素之间存在着复杂的关系，研究较多的河豚毒素源于微生物的的观点已逐渐为人们所接受[3,4]。和其它的毒素一样，微生物毒素既有对人类有害的一面，也有造福人类的一面，而微生物毒素在进一步研究利用中的优势地位也使人们对其投注了更多的目光。作者拟就海洋微生物毒素的产毒种类、毒素特点、检测方法以及资源化利用等方面作一简要综述。 1 海洋微生物毒素的产毒种类 产毒素的海洋微生物有细菌、真菌、放线菌以及微藻等，它们产生的毒素按其化学结构来分主要有肽类、胍胺类、聚醚类和生物碱等。细菌是了解相对较多的一个类群，目前巳报道的能够产生毒素的细菌主要分布在以下10个属：假单胞菌属（Pseudomonas ）、弧菌属（Vibrio ）、发光杆菌属（Photobacterium ）、气单胞菌属（Aeromonas ）、邻单胞菌属（Plesiomonas ）、交替单胞菌属（Alteromonas ）、不动杆菌属（Acinetobacter ）、芽孢杆菌属（Bacillus ）、棒杆菌属（Corynebacterium ）和莫拉氏菌属（Moraxella ）。分 离获得的毒素主要有：河豚毒素（tetrodotoxin,TTX ）、石房蛤毒素（saxitoxin,STX ）和两种作用于交感神经 的毒素Neosurugatoxin 和 Prosurugatoxin [5~8] 。海洋真 菌也可产生真菌毒素。霉菌是主要的产毒类群，可产生一类属于单端孢霉烯族化合物的霉菌毒素（trichothecenes ）[9]。总的来说产毒真菌主要分布在以下4属：青霉属(Penicillium )、镰刀霉属（Fusarium ）、曲霉属（Aspergillus ）和麦角属（Claviceps ），分别产生青霉毒素、镰刀霉毒素（fusarium toxin ）、黄曲霉毒素（aflatoxin ）和麦角生物碱(ergot alkaloids)[10]。放线菌几乎都可产生生物活性物质，从某种意义上来说，产生的抗生素即是一种毒素。研究发现放线菌中的链霉菌属（Streptomyces ）有的可产生河豚毒素[11]及放线菌素D 。而肝色链霉菌（Streptomyces hepaticus ）产生的洋橄榄霉素则是一种诱癌的急性强性毒素。蓝细菌在海洋中主要分布在热带海洋。它有很多种类主要产生两类毒素，一种是属生物碱的神经毒素——变性毒素a(anatoxina)；另一种是肽类毒素——肝毒素，是一族至少包括53种有关的环状肽，由7种氨基酸组成的肽叫微囊藻素（microcystin ），由5种氨基酸组 收稿日期：2004-02-25；修回日期：2004-07-31 基金项目：国家重点基础研究发展规划项目(2001CB409710)；国家自然科学基金资助项目（40206015，30370276） 作者简介：王新(1979-)，男，河南南阳人，在读博士，主要从事海洋环境微生物研究；郑天凌，通讯作者，E-mail:wshwzh@https://www.doczj.com/doc/b816476632.html,
第三节 水产食品原料中的生物活性物质海洋生物有环境的特异性，决定了其特殊的结构和奇妙的生理功能，体内能够生成多种多样的化合物。这些化合具有的多种生理性功能或药效作用。如牛磺酸、EPA、DHA等。能或药效作用如牛磺酸EPA DHA等
水产活性物质?多肽类如降血压肽 ?氨基酸类如牛磺酸 ?多烯脂肪酸类如DHA、EPA ?活性多糖如海藻多糖，甲壳胺 ?蛋白脂类如降钙素、SOD ?糖蛋白如扇贝糖蛋白 ?萜类如海兔素 ?天然色素如胡萝卜素 ?皂甙类如海星皂甙、海参皂甙 ?生物碱类如甘氨酸甜菜碱 ?多酚类如褐藻多酚 ?微量元素类如有机硒、有机碘
一、活性肽 、活性肽 活性肽:由数个Aa结合成为低肽，低肽具有比Aa 更好的消化吸收功能，其营养和生理效果更为优 越。如促钙吸收肽、降血压肽、降血脂肽、免疫越如促钙吸收肽降血压肽降血脂肽免疫 调节肽等. 功能肽的制备涉及到酶的选择性、活力、酶解终 点酶解液中肽类的确认混合物的近代分离技点、酶解液中肽类的确认、混合物的近代分离技术，最终是其功能性评价，因此，活性肽的研究开发周期长、投入大。
降血压肽： 鱼贝类中被证实具有降血压功能的活性肽有：来自沙丁鱼的C8肽、C11肽。 来自沙鱼的肽肽 从南极磷虾脱脂蛋白中分离得到的C3肽。 金枪鱼中得到C8肽。 从大马哈鱼头部提取降血压的保健药品与食品。
天然存在活性肽 天然存在于鱼贝类组织中的肽类只有: 天然存在于鱼贝类组织中的肽类只有 肽的谷胱甘肽; ?三肽的谷胱甘肽; ?鹅肌肽; ?鲸肌肽等。 谷胱甘肽是一种特殊的Aa衍生物又是含有疏?谷胱甘肽是一种特殊的Aa衍生物，又是含有疏基的三肽
实验十九海洋沉积物中磷分级提取及生物可利用磷的估算 一、实验目的 1、掌握海洋沉积物中磷分级提取方法 2、学会估算海洋沉积物中生物可利用磷 二、实验原理 磷是海洋浮游植物生长的重要营养元素，也是引发水体富营养化的重要因素。近年来，近岸海域由富营养化引起的赤潮灾害爆发频率逐年增加，导致海洋生物系统的退化。海底沉积物是海水磷的“源”与“汇”，它既可接受来自水体的磷，也可以在适当的条件下向上覆水体释放磷，从而进一步加剧水体的富营养化水平。沉积物在生源要素磷的循环过程中起着十分重要的作用，从某种意义上，对沉积物中磷的形态研究是进行磷的海洋生物地球化学循环研究的前提，也是预防赤潮发生及进行海域污染治理和保护的保障。 海洋沉积物中磷含量不高，根据沉积物中磷的结合态和化学性质的差异，可将其分为无机磷和有机磷，如下图所示： 磷灰石磷（AIP）：Ca-P 无机磷（IP） 总磷（TP）非磷灰石磷（NAIP）：（Fe+Al）-P 有机磷（OP） 研究表明，分离和定量测定海洋沉积物中各种形态磷的最理想的方法是化学试剂提取法。化学试剂提取法是基于给定提取剂对某一结合形式磷选择性的操作性定义，该方法要求样品中磷的含量大于0.005％，精密度可达4％。 、NaOH和HCl对海洋沉积物中磷进行三步提取，以便估算本实验采用MgCl 2 沉积物中磷的生物可利用性。第一步用MgCl 提取磷，包括了悬浮物中浮游植物 2 细胞内的磷和吸附于悬浮颗粒物中水合氧化物表面的磷。第二步用NaOH提取磷，提取的主要是颗粒物中被Fe、Al水合氧化物吸附的磷和一部分铁铝磷酸盐，这部分磷被称为是Fe-P、Al-P。第三步用HCI提取磷，提取的主要是磷灰石磷，
实验六茶叶中咖啡因的提取（升华法） 一、实验目的 1.学习从茶叶中取提咖啡因的原理与方法； 2.掌握索氏提取器的原理及其应用； 3.掌握升华原理及其操作。 二、实验原理 咖啡因具有刺激心脏、兴奋大脑神经和利尿等作用，主要用作中枢神经兴奋药。它也是复方阿斯匹林（A.P.C）等药物的组分之一。现代制药工业多用合成方法来制得咖啡因。 咖啡因为嘌呤的衍生物，其化学名称为1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤，其结构式与茶碱，可可碱类似。 嘌呤（Purine）咖啡因(Caffeine) 茶碱(Guanine) 可可碱(Adenine) 纯品咖啡因为白色针状结晶体，无臭，味苦；易溶于水、乙醇、氯仿、丙酮；微溶于石油醚；难溶于苯和乙醚。它是弱碱性物质，水溶液对石蕊试纸呈中性反应。咖啡因在100℃时即失去结晶水，并开始升华，120℃时升华相当显著，至178℃时升华很快。无水咖啡因的熔点为234.5℃。 茶叶中含有多种生物碱，其主要成分为含量约1～5%的咖啡因，并含有少量茶碱和可可豆碱，以及11～12%的单宁酸(又名鞣酸)，还有约0.6%的色素、纤维素和蛋白质等。 为了提取茶叶中的咖啡因，往往利用适当的溶剂（如氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续萃取，然后蒸出溶剂，即得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有一些生物碱和杂质，利用升华法可进一步纯化。 本实验利用咖啡因易溶于乙醇、易升华等特点，以95%乙醇作溶剂，通过索氏提取器进行连续抽提，然后浓缩、焙烘得到粗品咖啡因，再通过升华提取得到纯品咖啡因。 三、仪器药品 1.试剂与仪器 茶叶：5g；95乙醇：90ml，生石灰：1.5g。 索氏提取器一套，表面皿，蒸发皿，不锈钢刮铲，玻璃漏斗，锥形瓶。 四、实验装置
(整理)天然药物化学-生物碱习题
第十章生物碱【习题】 （一）选择题 [1-220] A型题[1-58] 1.生物碱不具有的特点是 A.分子中含N原子 B. N原子多在环内 C. 具有碱性 D. 分子中多有苯环 E.显著而特殊的生物活性 2.具有莨菪烷母核的生物碱是 A. 甲基麻黄碱 B. 小檗碱 C. 阿托品 D. 氧化苦参碱 E. 乌头碱 3.属于异喹啉生物碱的是 A. 东莨菪碱 B. 苦参碱 C. 乌头碱 D. 小檗碱 E. 麻黄碱 4.在常温下呈液体的生物碱是 A. 槟榔碱 B. 麻黄碱 C. 苦参碱 D. 乌头碱 E. 莨菪碱
5. 具有挥发性的生物碱是 A. 吗啡碱 B. 小檗碱 C. 苦参碱 D. 麻黄碱 E. 乌头碱 6. 具有升华性的生物碱是 A. 烟碱 B. 咖啡因 C. 小檗胺 D. 益母草碱 E. 氧化苦参碱 7. 生物碱的味多为 A. 咸 B. 辣 C. 苦 D. 甜 E. 酸 8. 具有颜色的生物碱是 A. 小檗碱D. 莨菪碱C. 乌头碱 D. 苦参碱 E. 麻黄碱 9. 无旋光性的生物碱为 A. 伪麻黄碱 B. 小檗碱 C. 烟碱 D. 乌头碱 E. 长春新碱 10. 表示生物碱碱性的方法常用 A. pkb B. Kb C. pH D. pka E. Ka 11. 生物碱碱性最强的是
A. 伯胺生物碱 B. 叔胺生物碱 C. 仲胺生物碱 D. 季铵生物碱 E. 酰胺生物碱 12.水溶性生物碱主要指 A. 伯胺生物碱 B. 仲胺生物碱 C. 叔胺生物碱 D. 两性生物碱 E. 季铵生物碱 13. 溶解脂溶性生物碱的最好溶剂是 A. 乙醚 B. 甲醇 C.乙醇 D. 氯仿 E. 水 14.生物碱沉淀反应呈桔红色的是 A. 碘化汞钾试剂 B. 碘化铋钾试剂 C.饱和苦味酸试剂 D. 硅钨酸试剂 E. 碘-碘化钾试剂 15. 生物碱沉淀试剂反应的介质通常是 A. 酸性水溶液 B. 碱性水溶液 C. 中性水溶液 D. 盐水溶液 E. 醇水溶液 16.水溶性生物碱分离的常用方法是 A. 碘化汞钾沉淀法 B. 硅钨酸沉淀法 C. 雷氏盐沉淀法 D. 苦味酸沉淀法 E. 碘化铋钾沉淀法 17. 用离子交换树脂法分离纯化生物碱时，常选用的离子交换树脂是
生物碱常用的提取方法 生物碱的提取： 由于各种生物碱的结构不同，性质各异，提取分离方法也不尽相同，主要是根据生物碱的溶解度而定。生物碱大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂，除季铵碱和一些分子量较低或含极性基团较多的生物碱外，一般均不溶或难溶于水，而生物碱与酸结合成盐时则易溶于水和醇。基于这种特性，可用不同的溶剂将生物碱从中药中提出，常用的提取溶剂有下列3种： （1）非极性溶剂：样品先用10%氢氧化铵溶液湿润，使中草药中与酸结合成盐的生物碱呈游离状态，然后用氯仿或乙醚等提取，一些与酸结合比较稳定的生物碱盐类和鞣酸盐或碱性较强的生物碱盐等，氢氧化铵不能将其完全分解，可用碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙或氧化镁，甚至氢氧化钠碱化，这个方法的缺点是不能提出水溶性生物碱。 （2）极性溶剂：极性较大的生物碱可用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水（常用0.1%～1%盐酸、硫酸、乙酸、酒石酸等）以及缓冲液等进行提取，该方法较简便，但提出的杂质较多，需进一步净化。 （3）混合溶剂：用不同极性的溶剂按不同比例混合，可以较好地进行提取，如麦角用氯仿：甲醇：氢氧化铵（90:9:1），百部、粉防已用乙醚：氯仿：乙醇：10%氢氧化铵溶液（25:8:25:1）等。 水溶性生物碱还可采用与生物碱沉淀试剂如雷氏盐（硫氰化铬铵）、磷钨酸等生成不溶的复盐而从水溶液中析出。生物碱与雷氏盐生成的沉淀可溶于丙酮，再通过阳离子交换树脂，用氢氧化铵洗脱即得游离的生物碱，生物碱与磷钨酸生成的沉淀可与固体碳酸钾研磨使干燥，再用无水乙醇热提。 实际上，每种分析法的建立都要对上述三类溶剂作比较，以优选出最佳提取溶剂。 生物碱的提取方法，常用的有冷浸、渗漉、超声波、索氏提取、热回流提取，由于中药分析所涉及到的大部分内容是有机化合物微量分析，故需要的样品量很少，因此，实际上是少量样品与大量提取溶剂，加上样品又经粉碎过筛，常常冷浸提取液中被测组分浓度与提取液中粉碎的样品内所含被测组分相当，即能提取完全。为了使提取更完全，也常常对上述方法进行组合如冷浸-渗漉，冷浸-超声 波，冷浸-索氏提取，冷浸-热回流提取，因冷浸、冷浸-超声波提取操作简便，