这是来自于Salk的一个比较全的荧光染料列表，这些荧光染料可广泛用于流式细胞术以及荧光显微镜技术，汇集了各种荧光染料的特性，方便大家查找。可根据实际所用的检测平台、染料的最大激发光波长和最大发射光波长来选择合适的荧光染料用于实验。请注意这上面所显示的颜色可能会由于所用浏览器不同而有所不同，他们只是一个与实际颜色的近似值。
Ex: Peak excitation wavelength (nm)
Em: Peak emission wavelength (nm)
QY: Quantum yield
BR: Brightness; Extinction coefficient * Quantum yield / 1000 PS: Photostability; time to 50% brightness (sec)
光色波长λ(nm)代表波长
红（Red）780～630700
橙（Orange）630～600620
黄（Yellow）600～570580
绿（Green）570～500550
青（Cyan）500～470500
蓝（Blue）470～420470
紫（Violet）420～380420
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
关于荧光染料（资料集合） ●人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ●理想的荧光染料一般具有以下几个特点： 1.具有高的光子产量，信号强度高； 2.对激发光有较强的吸收，降低背景信号； 3.激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰； 4.易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物的特异性； 5.稳定性好，不易受光、温度、PH、标本抗凝剂和固定剂的影响。 ●染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色，然后进行观察。随着生物技术、计算机技术以及荧光光谱测定技术的不断发展，许多染料尤其是荧光染料在细胞检测、肿瘤基因蛋白分析、毒物分析、临床医疗诊断等方面得到了广泛的应用。 荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一大于吸收光波长的光波的物质。利用荧光染料进行抗体标记分析在现代生物免疫学领域中应用广泛，并逐步显示出明显的优越性。 下面简要介绍应用于标记抗体的荧光染料及其种类： 1.荧光素类染料，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等及其类似物。这是一类具有较多苯环的化合物。应用最广泛的是FITC(如图为FITC标记的组织荧光图)，在488nm 处由氩离子激光激发，发射525nm的蓝绿色荧光。FITC能够与各种抗体蛋白结合，并在碱性溶液中稳定呈现蓝绿色荧光。 2.罗丹明类染料，包括红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm处被激发可发射出570nm的黄色荧光。 3.Cy系列菁染料，菁染料通常有两个杂环体系组成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物。 4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes开发的系列荧光染料。其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域，应用广泛。以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏
荧光定量P C R办法探针 法V S染料法 Ting Bao was revised on January 6, 20021
荧光定量PCR方法：探针法VS染料法？ 荧光定量PCR又称qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量PCR荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。 大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct值）。从理论上说，起始模板量和Ct值密切相关，因此我们通过判读Ct值从而对样本进行定量。 在进行荧光定量PCR时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是方法的选择，对最终结果的准确性至关重要。荧光定量PCR从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。 探针法染料法 一、染料法 在国内，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量PCR实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，会极大的影响真实结果的准确性。为此，一些厂商提供ROX作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。
精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别： 一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述： 1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量 2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。 二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点 1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高 2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好 【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择 如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当
今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新，生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪，各有各精彩。 1. 传统的96孔板式定量PCR仪传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应，因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR来说，任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR 仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行，试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源，5色滤光镜，可同时激发96个样品，超低温CCD具备同时多点多色检测的能力，能够有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和
生物化学与分子生物学进展（基础） 概论、目的基因 分子克隆的载体 核酸序列分析 聚合酶链反应（自学） 分子克隆技术常用的工具酶（自学） 肿瘤转移的分子机制 新生血管研究与转化医学 细胞周期与细胞增殖 基因打靶的设计与实现 细胞分化的分子机制 医学系统生物学和蛋白质组学 细胞信号转导 一、1.操纵子那张图 以乳糖操纵子为例，其组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I 存在诱导物（乳糖）时，mRNA得到转录；不存在诱导物时，mRNA无法转录。 （1）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。（2）CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 2.概念 （1）基因诊断：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。（2）基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。包括直接导入外源正常基因、采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因、将特定的基因导入非病变细胞等。（3）pBR322：大小为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚，是最早应用于基因工程的大肠杆菌质粒载体之一，有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个。 （4）pUC质粒系列：是在pBR322基础上改建成的。大小约2.69kb，去除了pBR322的抗四环素区段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker。含有易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用α互补原理进行蓝白筛选。 3.分子医学的主要研究内容 分子医学是指从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防、诊断和治疗疾病。研究内容主要包括疾病的分子机理、基因诊断、基因治疗和基因预防这四个方面。 （1）疾病的分子机理：探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。以尿黑酸症为例，
荧光定量 PCR 方法：探针法 VS 染料法？ 荧光定量 PCR 又称 qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA 的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。 大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定，其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（Ct 值）。从理论上说，起始模板量和 Ct 值密切相关，因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定量。 在进行荧光定量 PCR 时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其是方法的选择，对最终结果的准确性至关重要。荧光定量 PCR 从方法上来说可以分为染料法和探针法两种。 ?探针法? 染料法 一、染料法 在国内，染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ，染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧光定量 PCR 实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，
会极大的影响真实结果的准确性。为此，一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。 二、TaqMan 探针法 TaqMan 探针法 PCR 扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（FAM 或 Hex 等）和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；当 PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也就是探针法定量的原理。 探针法与染料法的最大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列，也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。除此之外，人们还可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，达到节省实验成本的目的。在样本量比较大的情况下，成本甚至可以低于染料法。 因此我们可以看到，在选择荧光定量实验时，探针法在特异性和准确性方面远远优于廉价的染料法，但在实际使用时，TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却步。目前，上海捷瑞生物工程有限公司在强大的探针合成能力的前提下，推出了探针法荧光定量 PCR 服务，以染料法的价格，享受探针法的服务，在相同的经费情况下，提高实验的准确性和特异性。
1.3荧光分子探针识别机理 1.3.1光诱导电子转移[4,12](Photoinduced Electron Transfer,PET) 典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团部分R(reseptor)，通过一间隔基S(space)和荧光团F(fluorophore)相连而构建。其中荧光团部分是光能吸收和荧光发射的场所，识别基团部分则用于结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET荧光探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱，一旦识别基团与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射出强烈荧光（图1-1）。PET荧光探针作用机制可由前线轨道理论来说明（图1-2）。由于与客体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”、“开”状态，因此这类探针又被称做荧光分子开关。 图1-1 PET荧光探针的一般原理图LUMO 图1-2 PET荧光探针的前线轨道原理图 已报道的PET荧光分子探针中，多数都是以脂肪氨基或氮杂冠醚作为识别基团。de Silva 研究小组利用多种荧光团设计了大量该类PET探针用于氢质子、碱金属阳离子识别。化合物1是一个简单的PET荧光分子探针，在甲醇中和K+络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.14。钱旭红等设计的PET荧光探针（化合物2），对氢质子有很好的识别作用，已被Molecular Probe公司推广为细胞内酸性内酯质探针。de Silva研究小组利用类似于EDTA
细胞核常用荧光染料有： 吖丫啶橙(Acridine Orange , AO )、溴化乙锭(Ethidium Bromide , EB )和碘化丙啶(Propidium Iodide , PI ) , DAPI 、Hoechst 染料、EthD III 、7-AAD 、RedDotl 、 2等等。 透膜的染料如下： AO :具有膜通透性，能透过细胞膜，将核 DNA 和RNA 分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB : —种高度灵敏的荧光染色剂，在标准 302nm 处激发出橙红色信号。 DNA 的染色灵敏度要高于EB 和PI ，荧光强度比Hoechst 低，但光稳定性高于Hoechst Hoechst 染料：蓝色一类在显微观察中标记 DNA 的荧光染料，最常见的两种是 Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm 处被激发，在 461nm 处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI 相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更 小。 RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于 Draq?5和Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。 RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下: PI 作为红色荧光复染剂首选，PI 经常与Calcein-AM 或者FDA 等荧光探针合用，区分死/活细 EthD III 、7-AAD 、RedDot 2 :不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测; 细胞核荧光染料(PI DAPI Hoechst33342 ) 细胞核荧光染料PI 碘化丙啶(简称PI )是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但 PI 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜 而将细胞核 染红，PI 在绿色光(540nm 波长)的激发下，会在600nm (红色光)处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA 结合的PI 发出的荧光，与未结合的PI 相比，强 度会增强 20-30 倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in waterlOmL 碘化丙啶英文名： Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39外观：红棕SF 末应用：DNA 染色染色原理： 碘化 丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在 嵌入双链DNA 后释放红色荧光。尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。 PI 经常被用来与 Calcein-AM 或者FDA 等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 光谱性质：PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm 。染色 过程：1.用PBS 或适当的缓冲液制备10?50小 的PI 溶液。a) 2.将1/10培养基体积的PI 溶液加入到细胞培养基中。b) 3 .在37 C 培养细胞10-20分 钟。4.用PBS 或合适的缓冲液洗涤细胞两次。 5.用535nm 激发波长，615nm 发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。 a)由于PI 可能具有致癌性， 请小心操作。b)也可以用1/10浓度的PI 缓冲液代替培养基。 保存条件：4C 避光保存 对人体有刺激性，请注意适当防护 DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 中大部分A , T 碱基相互结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI :蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与 DNA 结合后可以产生比 DAPI 自身强20多倍的荧光，而与单链DNA 结合无荧光的增强。 DAPI 对双链 PI :不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
荧光探针(fluorescent probe)在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。但以传统的有机荧光染料为主的荧光探针在应用中也存在一些难以克服的缺陷。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，在一定程度上克服了传统有机荧光试剂的缺陷，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点，在此我想作一简单介绍，希望能起到抛砖引玉的作用，如果大家觉得我有什么地方说错的话，欢迎批评指正！让我也从中受益！ 1、荧光纳米粒子的分类 荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。目前荧光纳米粒子主要有无机发光量子点、荧光高分子纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子三大类。 1.1.量子点 量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体，是由数百到数千个原子组成的无机纳米粒子，是一种由II-VI 族或者III-V 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是CdX(X = S、Se、Te)。量子点粒径很小，它们的电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。量子点的体积大小严格控制着它的光谱特征。量子点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰也相应蓝移。可见，相对于其他传统的荧光染料而言，量子点由于其量子尺寸效应，粒径不同或组成材料不同即可发射不同颜色的荧光。由于量子点潜在的应用前景，研究者在量子点的制备方面展开了一系列的研究。 目前，量子点的制备方法根据其所用材料的不同，有以下两种方法：一、在有机体系中采用胶体化学方法以金属有机化合物为前体制备量子点，二、在水溶液中直接合成。在有机体系采用胶体化学方法制备量子点的研究中，Bawendi等将金属有机化合物注射入热的有机溶剂中，在高温下制备出具有单分散性的CdSe量子点。后来，人们使用无机物来钝化颗粒表面，发展了核壳结构的量子点。peng等人以CdO或Cd(Ac)2为原料，在一定条件下与S、Se、Te的储备液混合，一步合成了性能良好的CdS、CdSe、CdTe量子点。Nie等以此法合成了CdSeTe量子点，其荧光发射最大的波长为850 nm，量子产率高达60%。该法不但克服了先前合成方法中需要采用(CH3)2Cd作为原料的缺点，而且所合成的量子点荧光量子产率高、尺寸分布窄、波长覆盖范围广。此外，Reiss等人在Peng的基础上以CdO为前体在HDA-TOPO混合体系中合成CdSe，然后以硬脂酸锌为锌源，在CdSe的表面包覆一层ZnSe，首次合成了CdSe/ZnSe核壳结构的量子点，荧光量子产率高达85%。另外，也有研究者采用在水溶液中进行量子点的合成，Weller等人以六偏磷酸钠及巯基乙酸、巯基乙胺等巯基化合物为稳定剂，以Cd(ClO4)2?6H2O为镉源合成了水溶性的CdS、CdSe、CdTe量子点。该法操作简单、可制备的量子点种类多、所用材料价格低、毒性小，且量子点表面修饰有可直接与生物分子偶连的羧基或氨基等官能团。然而，采用在水溶液中合成量子点的方法存在着量子产率不高、尺寸分布较宽等缺点。所以，目前人们仍较多的采用在有机体系中进行量子
Alexa Fluor ３50——亮蓝和紫外光激发 Ａlexa Flｕor 350的蓝色荧光比ＡＭＣＡ亮50%,而且最大发射波长稍短(为442 ｎm ，AMCA 为448ｎm），因此更容易与现有的绿色荧光基团区分。 Alexa Ｆluoｒ4０5——近乎完美的匹配蓝色二极管激光器 Aleｘa Ｆluor ４0５的激发/发射最大波长为402/421nｍ，与荧光显微镜和流式细胞仪405nｍ谱线的蓝色二极管激光器近乎完美的匹配。Alｅｘa Ｆｌuor 405 琥珀酰酯是C ａscａde Bｌuｅ的氨基反应性衍生物,后者是乙酰叠氮化物。Ａlexa Fluｏr 405 琥珀酰酯纯度更高且有一个４-哌啶羧酸的间隔,使得荧光基团与其偶联的生物分子之间的反应性最小化。 Ａlｅｘa Ｆlｕor 430——高斯托克斯频移的430nｍ吸收 少数４00nm－4５０nm吸收的染料在水溶液中可测荧光偏离500nm。Aｌeｘa Fluｏr 430弥补了这一缺陷,４３0nm激发时发射在54０ｎｍ附近。 Alexa Fｌuor 4８8——最好的绿色荧光基团 Ａlexa Fluｏr 488 偶联蛋白优于其他荧光素，实验证明比包括Cy2 的其他绿色荧光基团都好。不仅亮度更高，而且光稳定性更好。在pH４-10的范围内保持稳定是其另一优越之处。 Aleｘa Fluor 532——最适于５32nm激发光源的染料 激发发射波长位于绿色荧光Ａｌｅｘａ Fluor 48８和橙色荧光的Alexa Flｕｏｒ５46之间,适用于双频Nd：ＹＡG激光器在内的532 ｎm激发光源。 ＡlexａＦluｏr ５46——Ｃy3和四甲基罗丹明的替代物 Ａleｘａ Fluｏｒ５46 标记的偶联物良好应用于橙色范围光谱,比四甲基罗丹明（T ＲITＣ、TＡMRＡ）及Ｃy3荧光更强，容易被汞弧灯激发，发射波长546 ｎm。 Alexa Fｌuｏｒ 555——优于Cy3的替代物 Alexa Fluｏr 555 与Cｙ３偶联物的光谱相匹配,因此适用于Cy3 的滤光器。Ａlexa Fｌuor 555 的总荧光更强，且光稳定性更好，为研究者提供了更长的图像捕获时间。 Aｌexa Fｌuoｒ 568——最适于568 nｍ激发光源 Alexa Ｆｌｕｏr 56８的橙红色荧光最适用于激光共聚焦显微镜的Ａr–Ｋr 混合气体激光器,其发射的谱线为56８nm。与具有相似最大激发/发射波长的Ｌiｓsaｍine Ｒｈodamｉｎｅ B 和Rｈodａmine Red－X 相比, Alｅxa Flｕｏr 568的偶联物亮度更高。 AlexａＦluｏr ５９4——优于Texas Red的替代品 Alexa Ｆluor 5９4偶联物发出红色光,可与绿色荧光探针一同用于多色标记实验。比Teｘaｓ Red 偶联物有更高的亮度。 Alexa Fluｏr ６10——Aｌexａ Fluor最好的红色染料 Alexa Ｆｌｕor 61０亮度高、光稳定, 可用检测ＴｅｘａｓＲed 和Aｌexa Flu ｏr 59４的光学元件检测。前身是FRＥT－based Ａｌｅｘa Flｕor–ｐhyｃobｉliｐｒoteiｎ的受体染料。新的Alexa Fｌuor ６10 激发/发射波长为６12／6２８ｎm,容易与绿色荧光基团相区分，适用于多色标记。且Aleｘａ Fluoｒ 6１0仍为人眼可见,优于Ａleｘa Fluｏｒ633和其他更长波长的荧光团。
染料名称Excitation(nm)Emission(nm)分子量备注信息 Reactive and conjugated probes Hydroxycoumarin325386331Succinimidyl ester Aminocoumarin350445330Succinimidyl ester Methoxycoumarin360410317Succinimidyl ester Cascade Blue(375);401423596Hydrazide Pacific Blue403455406Maleimide Pacific Orange403551 Lucifer yellow425528 NBD466539294NBD-X R-Phycoerythrin 480;565578240 k (PE) PE-Cy5 conjugates480;565;650670aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red PE-Cy7 conjugates480;565;743767 Red 613480;565613PE-Texas Red PerCP490675Peridinin chlorphyll protein TruRed490,675695PerCP-Cy5.5 conjugate FluorX494520587GE Healthcare Fluorescein495519389FITC; pH sensitive BODIPY-FL503512 TRITC547572444TRITC X-Rhodamine570576548XRITC Lissamine 570590 Rhodamine B Texas Red589615625Sulfonyl chloride Allophycocyanin 650660104 k (APC) APC-Cy7 conjugates650;755767PharRed Alexa Fluor系列荧光染料 Alexa Fluor 350343442410 Alexa Fluor 4054014211028 Alexa Fluor 430434540702 Alexa Fluor 488499519643QY 0.92 Alexa Fluor 500503525700 Alexa Fluor 514517542714 Alexa Fluor 532530555724QY 0.61 Alexa Fluor 5465615721079QY 0.79 Alexa Fluor 5555535681250QY 0.1 Alexa Fluor 568579603792QY 0.69
常用荧光染料的激发和发射波长 Fluorescent Dye （荧光染料）Excitation （激发波长， nm ） Emission （发射波长， nm ） Cy2 489 506 GFP(Red Shifted) 488 507 YO-PRO -1 491 509 YOYO -1 491 509 Calcein 494 517 FITC 494 518 FluorX 494 519 Alexa 488 490 520 Rhodamine 110 496 520 ABI,5-FAM 494 522 Oregon Green ?500 503 522 Oregon Green ? 488 496 524 RlboGreen ? 500 525 Rhodamine Green 502 527 Rhodamine123 507 529 Magnesium Green 506 531 Calcium Green 506 533 TO-PRO ?-1 514 533 TOTO-1 514 533 ABI,JOE 520 548 BODIPY? 530/550 530 550 Dil 549 565 BODIPY?R 542 568 BODIPY?558/568 558 568 BODIPY?564/570 564 570 Cy3 ? 550 570 Alexa ? 546 555 570 TRITC 547 572 Magnesium Orange ? 550 575 Phycoerythrin,R & B 565 575 Rhodamine Phalloidin 550 575 Calcium Orange ? 549 576 Pyronin Y 555 580 Rhodamine B 罗丹明555 580 ABI,TAMRA 560 582
（1）荧光素类 Fluorescein 标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。 Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。 与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FITC 异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。 FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。在水中易变坏，不能长久保存。 FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。 Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。 TET 四氯荧光素，Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。 TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的Abs与Em值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=521/536nm 。 TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP 或d/ddATP（PE公司） HEX 六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。