受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告
产品中文名称：人类10基因突变联合检测试剂盒
（可逆末端终止测序法）
产品管理类别：三类6840
申请人名称：厦门艾德生物医药科技股份有限公司
国家食品药品监督管理总局
医疗器械技术审评中心
目录
基本信息 (3)
一、申请人名称 (3)
二、申请人住所 (3)
三、生产地址 (3)
产品审评摘要 (4)
一、产品概述 (4)
二、临床前研究摘要 (7)
三、临床评价摘要 (15)
四、收益-风险评估 (24)
综合评价意见 (28)
基本信息一、申请人名称
厦门艾德生物医药科技股份有限公司二、申请人住所
厦门市海沧区鼎山路39号
三、生产地址
厦门市海沧区鼎山路39号
产品审评摘要
一、产品概述
（一）产品主要组成成分
表1 试剂盒主要组成成分
试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。（二）产品预期用途
本试剂盒用于定性检测非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显子缺失（19del）、L858R点突变用于吉非替尼片的伴随诊断检测，T790M点突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野生型用于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所示。
表2 伴随诊断用途的基因变异类型及相应的靶向药物
表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。
表3 未经伴随诊断用途验证的基因变异类型
其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据。临床医生应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。
（三）产品包装规格
24测试/盒
（四）产品检验原理
本试剂盒通过构建样本DNA测序文库，并使用特异探针对文库进行目标区域捕获富集，捕获后的文库通过高通量测序，可实现多个基因多个突变的一次性检测。
首先，以FFPE样本提取的DNA为材料，进行DNA片段化处理，并使用磁珠对DNA进行片段选择，然后对所得片段进行末端修复和加A处理，使用DNA连接酶将接头连接到DNA模板的两端，再使用带有标签序列（Index）的引物和聚合酶进行PCR 扩增得到扩增文库；扩增文库与带有生物素标记的寡核苷酸探针进行液相杂交，并用链霉素包被的磁珠对与探针结合的文库进行捕获富集，最后经过PCR扩增得到捕获文库。捕获文库采用基因测序仪（型号：NextSeq CN500，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司生产，注册证号：国械注准20153400460）进行高
通量测序。对于测序数据，采用生物信息学软件判读10种基因中是否存在来自肿瘤的变异。
二、临床前研究摘要
（一）主要原材料
1.主要原材料的选择
该试剂盒主要原材料包括：捕获探针、末端修复酶、连接酶、DNA聚合酶、对照品等，这些原材料均为外购方式获得，捕获探针为申请人自行设计后由专业的合成公司合成。申请人选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。
2. 企业参考品和质控品设置情况
企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和重复性(精密度)参考品。其中：
阳性参考品共18份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型，均为DNA样本。其中8份来自临床样本，5份来自混合的细胞系参考品（由自行购买的不同突变或融合类型的15个细胞系参考品混合而成），5份来自混合人工合成DNA的人类细胞系参考品（一共含18个不同突变或融合类型）。所有参考品均用
Sanger测序法和数字PCR方法验证。
阴性参考品共8份，包括1份大肠杆菌样本，7份试剂检测范围内基因变异阴性的临床样本。所有样本均用Sanger测序法和数字PCR方法验证为相关突变阴性。
检测限参考品共10份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型。其中5份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系DNA稀释获得，5份由人工合成DNA和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得。10份检测限参考品稀释后的突变类型和重排（融合）类型变异比例为1%。
重复性参考品总共15份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型。其中7份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系DNA稀释获得，7份由人工合成DNA和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得，1份为试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA。12份弱阳性参考品突变比例为1～5%，2份强阳性参考品突变比例为15%，另采用试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系制成1份阴性参考品。
该产品的对照品来源于细胞系样本的DNA，其中阳性对照品包含EGFR/KRAS基因突变阳性和ROS1基因融合，阴性对照品为试剂检测范围内10种基因变异阴性，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制。
（二）生产工艺及反应体系研究
申请人通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。
申请人通过使用初步确定的配方进行反应体系配制，对反应体系中的样本核酸提取试剂、末端修复试剂用量、连接试剂用量、接头用量、LC-D7/D5引物用量、杂交文库混合数量、杂交捕获文库用量、封闭剂用量、捕获探针用量、杂交液用量、磁珠用量、杂交时间、扩增反应条件等进行筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最佳的反应体系。
（三）分析性能评估
分析性能评估内容包括阴/阳性参考品符合率、最低检出限、分析特异性和干扰物质、重复性、肿瘤组织样本要求研究、核酸提取纯化配套试剂组合性能研究等。
在阴/阳性参考品符合率试验中，申请人采用18份阳性参考品和8份阴性参考品对3批成品试剂盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）进行了检测验证，检测结果均为预期的突变型，说明阳性参考品符合率和阴性参考品符合率均为100%。同时选取21个阳性临床样本在3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分别进行检测，结果均能正确检出。
在最低检出限试验中，申请人采用10份检测限参考品对3批成品试剂盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）进行了检测验证，结果均能正确检出。同时选取4份经过数字PCR 定量的阳性临床样本（EGFR/ALK/HER2基因变异阳性，含有点突变、插入缺失突变和基因重排），用基因变异阴性的临床样本配制8级突变频率梯度共32个样本，每个样本分别在3种建库起始量（10 ng、30 ng和50 ng）下进行了6次重复检测，确定了样本的检测限为可检测30ng DNA中频率低至1%的突变（含有点突变、插入缺失突变和基因重排）。
取15份经过数字PCR定量的阳性临床样本（EGFR/ALK/ROS1/HER2/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因变异阳性，含有点突变、插入缺失突变和基因重排），用试剂检测范围内基因变异阴性的临床样本配制成1%变异频率，在30ng建库起始量下，用3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）对各样本进行了20次重复检测验证，最终确定该产品不低于95%检出率时，可检测30ng DNA 中频率低至1%的突变（含有点突变、插入缺失突变和基因重排）。
在分析特异性试验中，申请人采用试剂盒检测范围内的基因变异阴性的临床样本DNA，进行不同建库起始量的检测，检
测结果均为阴性，说明产品对不同起始量的阴性临床样本DNA 具有良好的耐受性。对于试剂盒检测范围内的基因变异阳性参考品，本试剂盒检测结果均为相应型别阳性，没有错检或漏检，说明本试剂盒能准确检测目标区域的碱基突变状态，检测的变异类型间不存在交叉反应。本试剂盒能对非人类基因组（大肠杆菌和肺炎链球菌）DNA进行正常建库，但不能对目标区域序列进行捕获富集，说明本试剂盒与非人类基因组DNA无交叉反应。
在干扰物质试验中，申请人在阳性临床样本和阴性临床样本中分别加入如下干扰物质：坏死组织（等体积）、乙醇（21.7 mmol/L）、二甲苯（35 mmol/L）、蛋白酶K（0.08 mg/mL）然后进行检测，样本检测结果均与预期一致，说明这些干扰物质在不高于上述浓度的情况下不会对该产品的结果产生影响。
在重复性试验中，申请人采用重复性参考品15份在3批成品试剂盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）上分别完成20次重复检测，检测结果一致。同时选取了21份临床样本，在3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分别完成20次重复检测，检测结果一致。
针对核酸提取纯化步骤，申请人采用临床样本，平行比较了2种核酸提取试剂盒的提取效果，根据与该产品的组合性能研
究结果，确定了1种核酸提取试剂作为样本提取的推荐试剂盒。
在肿瘤组织细胞含量研究中，申请人对不同肿瘤细胞占比对检测结果的影响进行了研究。结果表明，肿瘤细胞占比5%以上的组织样本均可检出。结合临床样本的多样性和复杂性，建议组织样本肿瘤细胞占比≥20%。
申请人提供了3批产品（06216070401X，06216071101X，06216071801X）在其适用机型上的性能评估资料，结果均符合要求。
（四）阳性判断值
申请人首先采用少量临床样本进行了初步确定，然后采用不同基因不同变异类型的阳性临床样本进行阳性判断值验证，最终确定了阳性判断值标准。
申请人共采用了38个样本（16个商业化参考品及22个临床样本；包含了点突变、插入/缺失和融合三种类型）进行检测，分别统计其检出情况。通过ROC曲线方式确认采用突变频率0.4%可以有效检出突变。并对样本原始数据分别随机抽取测序深度为15000×、10000×、7500×、5000×，确定样品测序平均原始深度要求为10000×，并确定了位点有效深度的最低要求为500×，突变绝对拷贝数应不低于2，选择链平衡性0.1～0.9作为阳性判断值的要求（融合不适用）。
阳性判断值验证：采用10份阴性、10份灵敏度参考品、以及经数字PCR验证并稀释至1%的15例FFPE样本（包含不同基因不同区段的变异类型），分别测试阳性符合率、阴性符合率，结果表明，阳性符合率、阴性符合率都100%吻合，总体验证结果符合要求。
通过上述实验，最终确定该产品使用配套软件进行数据分析时的阳性判断值为：
1.突变比例不低于0.4%；
2.测序有效深度不低于500×；
3.突变绝对拷贝数不低于2；
4.链平衡性介于0.1～0.9之间（融合不适用）。
（五）稳定性研究
申请人对该产品实时稳定性、运输稳定性、冻融稳定性、开瓶稳定性进行了研究，确定了在各种条件下本产品的有效保存时间。同时对石蜡样本稳定性、核酸（DNA）溶液稳定性、文库稳定性等进行了研究，确定了检测过程中各种样本类型的有效保存时间。
实时稳定性研究：采用三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）储存于-20±5℃条件下，分别在0、3月、6月和8月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度
进行考察。结果显示，各项性能指标均符合要求，确定产品在-20±5℃条件下，可稳定保存6个月。
运输稳定性研究：采用三批试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）按运输要求完成运输试验，然后按要求储存至效期末，在运输前/后、储存至效期末时分别对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察。结果显示，各项性能指标均符合要求，确定了该产品的运输条件。
冻融稳定性研究：采用三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）反复冻融10次，分别在反复冻融第5次和10次后对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进行考察。结果显示，各项性能指标均符合要求。考虑到临床实际运用，为保证检测结果的准确性，建议冻融次数不超过5次。
开瓶稳定性研究：采用三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）解冻后，拆开包装，将末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、连接增强子、接头、扩增反应缓冲液、LC-D5引物、LC-D7引物、封闭剂、捕获探针、杂交缓冲液、磁珠洗涤缓冲液、5×洗涤缓冲液、聚合酶、对照品等各组分震荡混匀、瞬时离心，在超净工作台中依次开盖后再盖紧，放置5分钟后置于-20±5℃存储（模拟使用过程），分别在第3和6个月对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度
进行考察。结果显示，开瓶后的试剂盒在-20±5℃保存6个月，各项性能指标均满足要求。
申请人对石蜡包埋样本稳定性、核酸（DNA）样本冻融稳定性也进行了研究。研究确认石蜡组织样本保存期限不超过18个月；核酸（DNA）样本置于-20±5℃保存期限可达到8个月。
三、临床评价摘要
临床试验在6家临床机构共同开展，共计完成有效样本2105例，包含1586例非小细胞肺癌样本（包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和大细胞癌等）、499例结直肠癌（包含左半结肠、右半结肠和直肠等）和20例干扰样本，样本类型为石蜡包埋组织。主要分为以下几部分：
（一）比较研究
申请人在福建医科大学附属协和医院、第四军医大学附属唐都医院、福建省立医院、首都医科大学附属北京胸科医院共4家临床试验机构完成了临床试验。采用考核试剂与组织检测的金标准Sanger测序法对临床样本进行比较研究，验证本产品的临床性能。入组样本为非小细胞肺癌样本1248例、结直肠癌样本295例和干扰样本20例，共计1563例有效样本。样本类型均为石蜡包埋组织。考核试剂与对比试剂检测结果不一致的样本采用
PCR方法进行验证。
本临床试验在1248例肺癌样本中共检出863例突变阳性样本，阳性率为69.15%。包括EGFR基因中335例L858R突变阳性、270例Exon19 deletion突变阳性、12例T790M突变阳性、14例L861Q突变阳性、6例S768I突变阳性、8例G719A突变阳性、9例G719S突变阳性；KRAS基因中33例G12D突变阳性、33例G12C 突变阳性、29例G12V突变阳性、7例G12A突变阳性、4例G12S 突变阳性、2例Q61H突变阳性；NRAS基因中G12D和Q61K突变阳性各1例；BRAF基因中13例V600E突变阳性；PIK3CA基因中17例H1047R突变阳性；MET基因中检出申报类型和非申报类型共20例MET Exon14 skipping阳性突变；HER2基因中24例A775_G776insYVMA突变阳性；ALK基因中检出申报类型和非申报类型共85例ALK基因重排（融合）阳性；ROS1基因中检出申报类型和非申报类型共13例ROS1基因重排（融合）阳性；RET基因中检出申报类型和非申报类型17例RET基因重排（融合）阳性。
与对比方法的研究结果显示，考核试剂的定性检测结果阳性符合率为98.99%（95%CI 98.02%～99.56%），阴性符合率为82.49%（95%CI 78.69%～85.87%），总符合率为92.95%（95%CI 91.38%～94.31%）。进行Kappa一致性检验，Kappa值=0.8429，P
＜0.001，显示二者具有良好的检测一致性。
在1248例肺癌样本中，两种方法检测结果不一致或不完全一致共有109例。109例样本的第三方验证结果中，有92例与考核试剂检测结果一致，有14例与对照方法检测结果一致，2例（双突变样本）与双方检测结果均不一致，1例因特殊情况未进行验证。
本临床试验在295例结直肠癌样本中共检出111例突变阳性样本，阳性率为37.63%。包括KRAS基因中45例G12D突变阳性、10例G12C突变阳性、17例G12V突变阳性、3例G12A突变阳性、3例G12S突变阳性；NRAS基因中8例G12D突变阳性、3例Q61K 突变阳性、2例Q61R突变阳性；BRAF基因中13例V600E突变阳性；PIK3CA基因中9例H1047R突变阳性；1例EGFR基因G719S 突变阳性；1例ROS1基因重排（融合）阳性。
与对比方法的研究结果显示，考核试剂的定性检测结果阳性符合率为100%（95%CI 96.38%～100%），阴性符合率为94.36%（95%CI 90.13%～97.15%），总符合率为96.27%（95%CI 93.43%～98.12%）。进行Kappa一致性检验，Kappa值=0.9190，P ＜0.001，显示二者具有良好的检测一致性。
在295例结直肠癌样本中，两种方法检测结果不一致或不完全一致共有11例。11例样本的第三方验证结果中，有7例与考核
试剂检测结果一致，有3例与对照方法检测结果一致，1例（双突变样本）与双方检测结果均不一致。
（二）伴随诊断比较研究
申请人在山西省肿瘤医院进行考核试剂与伴随诊断用途试剂的比较研究。
1.EGFR基因与已上市伴随诊断试剂盒的比较研究
EGFR基因突变对比试剂采用凯杰公司therascreen? EGFR RGQ PCR Kit试剂盒。本次对比研究共纳入220例福尔马林固定，石蜡包埋的晚期非小细胞肺癌组织样本。考核试剂在83例样本中检出阳性（其中19Del 41例、L858R 39例、T790M 3例、L861Q 3例、S768I 1例）。
考核试剂在220例样本中有6例样本定性检测结果与对照试剂不一致。其中5例为考核试剂检出阳性（其测序丰度均低于对照试剂检出限），对照试剂检出阴性。1例为考核试剂检出阴性，对照试剂检出阳性，可能原因为肿瘤组织异质性或检测方法学的差异。
考核试剂与对照试剂定性检测EGFR基因的阳性符合率为98.73%（95%CI 93.15%～99.97%），阴性符合率为96.45%（95%CI 91.92%～98.84%），总符合率为97.27%（95%CI 94.16%～98.99%）。进行Kappa一致性检验，Kappa值=0.941，P＜0.001，
显示二者具有良好的检测一致性。
考核试剂与对照试剂定性检测19Del的阳性符合率为95.00%（95%CI：83.08%～99.39%），阴性符合率为98.33%（95%CI：95.21%～99.65%），总符合率为97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR L858R检测结果的阳性符合率为94.74%（95%CI：82.25%～99.36%），阴性符合率为98.35%（95%CI：95.26%～99.66%），总符合率为97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR 稀有突变（包括T790M、L861Q、S768I 等）检测结果的阳性符合率为100.00%（95%CI：54.07%～100.00%），阴性符合率为100.00%（95%CI：98.29%～100.00%），总符合率为100.00%（95%CI：98.34%～100.00%）。
2.ALK基因与已上市伴随诊断试剂盒的比较研究
ALK基因融合（重排）对比试剂采用雅培公司Vysis ALK Break Apart FISH 探针试剂盒和罗氏公司VENTANA ALK免疫组化（IHC）检测试剂盒。本次对比研究共纳入228例福尔马林固定，石蜡包埋的晚期非小细胞肺癌组织样本。228例样本的FISH与IHC检测结果有4例不一致，224例一致。考核试剂在224例样本中共检出29例阳性。
考核试剂在224例样本中有2例样本检测结果与对照试剂不一致。1例为考核试剂检出阳性（其测序丰度较低），对照试剂
（IHC/FISH）均检出阴性。1例为考核试剂检出阴性，对照试剂（IHC/FISH）均检出阳性，可能原因为肿瘤组织异质性或检测方法学的差异。
考核试剂与对照试剂（IHC/FISH）定性检测ALK基因的阳性符合率为96.55%（95%CI：82.24%～99.91%），阴性符合率为99.49%（95%CI：97.18%～99.99%），总符合率为99.11%（95%CI：96.81%～99.89%）。进行Kappa一致性检验，Kappa值=0.960，P ＜0.001，显示二者具有良好的检测一致性。
3.ROS1基因与已上市伴随诊断试剂盒的比较研究
ROS1基因融合（重排）对比试剂采用厦门艾德生物人类ROS1基因融合检测试剂盒（荧光PCR法）。本次对比研究共纳入232例福尔马林固定，石蜡包埋的晚期非小细胞肺癌组织样本。考核试剂在7例样本中检出阳性。
考核试剂在232例样本中有1例样本检测结果与对照试剂不一致。可能原因为肿瘤组织异质性或检测方法学的差异。
考核试剂与对照试剂定性检测ROS1基因的阳性符合率为87.50%（95%CI 47.35%～99.68%），阴性符合率为100.00%（95%CI 98.37%～100.00%），总符合率为99.57%（95%CI 97.62%～99.99%）。进行Kappa一致性检验，Kappa值=0.931，P ＜0.001，显示二者具有良好的检测一致性。
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可
一、名词解释 1、广义分子生物学：在分子水平上研究生命本质的科学，其研究对象是生物大分子的结构和功能。2 2、狭义分子生物学：即核酸（基因）的分子生物学，研究基因的结构和功能、复制、转录、翻译、表达调控、重组、修复等过程，以及其中涉及到与过程相关的蛋白质和酶的结构与功能 3、基因：遗传信息的基本单位。编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。 4、基因：基因是含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，包含产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核苷酸序列。 5、功能基因组学：是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 6、蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 7、生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输 8、蛋白质组：指的是由一个基因组表达的全部蛋白质 9、功能蛋白质组学：是指研究在特定时间、特定环境和实验条件下细胞内表达的全部蛋白质。 10、单细胞蛋白：也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。 11、基因组：指生物体或细胞一套完整单倍体的遗传物质总和。 12、C值：指生物单倍体基因组的全部DNA的含量，单位以pg或Mb表示。 13、C值矛盾：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 14、重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。 15、基因重叠：同一段核酸序列参与了不同基因编码的现象。 16、单拷贝序列：单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 17、低度重复序列：低度重复序列是指在基因组中含有2～10个拷贝的序列 18、中度重复序列：中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 19、高度重复序列：基因组中有数千个到几百万个拷贝的DNA序列。这些重复序列的长度为6~200碱基对。 20、基因家族：真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 21、基因簇：基因家族的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域。 22、超基因家族：由基因家族和单基因组成的大基因家族，各成员序列同源性低，但编码的产物功能相似。如免疫球蛋白家族。 23、假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。 24、复制：是指以原来DNA（母链）为模板合成新DNA（子链）的过程。或生物体以DNA/RNA
基因突变和基因重组 习题精选三 A级·巩固双基 1．培育青霉素高产菌株的方法是（） （A）杂交育种（B）单倍体育种 （C）诱变育种（D）多倍体育种 2．自然界中生物变异的主要来源是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）环境影响（D）染色体变异 3．产生镰刀型细胞贫血症的根本原因是（） （A）红细胞易变形破裂 （B）血红蛋白中的一个氨基酸不正常 （C）信使RNA中的一个密码发生了变化 （D）基因中的一个碱基发生了变化 4．人工诱变区别于自然突变的突出特点是（） （A）产生的有利变异多（B）使变异的频率提高 （C）可人工控制变异方向（D）产生的不利变异多 5．下面列举了几种可能诱发基因突变的原因，其中哪项是不正确的（）
（A）射线的辐射作用（B）杂交 （C）激光照射（D）秋水仙素处理 6．人类的基因突变常发生在（） （A）减数分裂的间期（B）减数第一次分裂 （C）减数第二次分裂（D）有丝分裂末期 B级·提高能力 7．人工诱变是创造生物新类型的重要方法，这是因为人工诱变（） （A）易得大量有利突变体 （B）可按计划定向改良 （C）变异频率高，有利变异较易稳定 （D）以上都对 8．一种植物只开红花，但在红花中偶尔出现一朵白花，将白花所给种子种下，后代仍为白花。出现这种现象的原因可能是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）染色体变异（D）基因互换 9．下列属于基因突变的是（） （A）外祖母正常，母亲正常，儿子色盲 （B）杂种高茎豌豆自交，后代中出现矮茎豌豆 （C）纯种红眼果蝇后代中出现白眼果蝇
（D）肥水充足时农作物出现穗大粒多 10．一对夫妇所生子女中，性状差别甚多，这种变异主要来自于（） （A）基因重组（B）基因突变 （C）染色体变异（D）环境的影响 11．如果基因中四种脱氧核苷酸的排列顺序发生了变化，则这种变化叫（） （A）遗传性变化（B）遗传信息变化 （C）遗传密码变化（D）遗传规律变化 12．长期接触X射线的人群产生的后代中遗传病发病率明显提高，主要原因是该人群生殖细胞发生（） （A）基因重组（B）基因分离 （C）基因互换（D）基因突变 13．下列生物的性状中，都是通过基因突变而形成的是（） （A）无籽番茄和无籽茄子 （B）人类白化病和无籽草莓 （C）安康羊和人类镰刀型贫血症 （D）无芒小麦和无籽西瓜 14．基因突变发生在什么过程中（） （A）DNA－DNA （B）DNA－RNA （C）RNA－蛋白质（D）RNA－DNA
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46, XX（XY）/47 ，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14 ，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用？（P4）
人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长
名词解释 1. 基因（gene）： 2. 结构基因（structural gene）： 3. 断裂基因（split gene）： 4. 外显子（exon）: 5. 内含子（intron）: 6. 多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）: 7. 单顺反子RNA（monocistronic RNA）: 8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）: 9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）: 10. 密码子（codon）: 11. 反密码子（anticodon）: 12. 顺式作用元件（cis-acting element）: 13. 启动子（promoter）: 14. 增强子（enhancer）: 15. 核酶（ribozyme） 16. 核内小分子RNA（small nuclear RNA, snRNA） 17. 信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP） 18. 上游启动子元件（upstream promoter element） 19. 同义突变（same sense mutation） 20. 错义突变（missense mutation） 21. 无义突变（nonsense mutation） 22. 移码突变（frame-shifting mutation） 23. 转换（transition） 24. 颠换（transversion） （三）简答题 1. 顺式作用元件如何发挥转录调控作用？ 2. 比较原核细胞和真核细胞mRNA的异同。 3. 说明tRNA分子的结构特点及其与功能的关系。 4. 如何认识和利用核酶？ 5. 若某一基因的外显子发生一处颠换，对该基因表达产物的结构和功能有什么影响？ 6. 举例说明基因突变如何导致疾病。 （四）论述题 1. 真核生物基因中的非编码序列有何意义？ 2. 比较一般的真核生物基因与其转录初级产物、转录成熟产物的异同之处。 3. 真核生物的基因发生突变可能产生哪些效应？ （二）名词解释 1.基因组（genome） 2. 质粒（plasmid） 3.内含子（intron） 4.外显子（exon） 5.断裂基因（split gene） 6.假基因（pseudogene） 7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）
《基因突变和基因重组》习题精选 1．培育青霉素高产菌株的方法是（） （A）杂交育种（B）单倍体育种 （C）诱变育种（D）多倍体育种 2．自然界中生物变异的主要来源是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）环境影响（D）染色体变异 3．产生镰刀型细胞贫血症的根本原因是（） （A）红细胞易变形破裂 （B）血红蛋白中的一个氨基酸不正常 （C）信使RNA中的一个密码发生了变化 （D）基因中的一个碱基发生了变化 4．人工诱变区别于自然突变的突出特点是（） （A）产生的有利变异多（B）使变异的频率提高 （C）可人工控制变异方向（D）产生的不利变异多 5．下面列举了几种可能诱发基因突变的原因，其中哪项是不正确的（） （A）射线的辐射作用（B）杂交 （C）激光照射（D）秋水仙素处理 6．人类的基因突变常发生在（） （A）减数分裂的间期（B）减数第一次分裂 （C）减数第二次分裂（D）有丝分裂末期 7．人工诱变是创造生物新类型的重要方法，这是因为人工诱变（） （A）易得大量有利突变体 （B）可按计划定向改良 （C）变异频率高，有利变异较易稳定 （D）以上都对 8．一种植物只开红花，但在红花中偶尔出现一朵白花，将白花所给种子种下，后代仍为白花。出现这种现象的原因可能是（） （A）基因突变（B）基因重组 （C）染色体变异（D）基因互换 9．下列属于基因突变的是（） （A）外祖母正常，母亲正常，儿子色盲 （B）杂种高茎豌豆自交，后代中出现矮茎豌豆 （C）纯种红眼果蝇后代中出现白眼果蝇 （D）肥水充足时农作物出现穗大粒多 10．一对夫妇所生子女中，性状差别甚多，这种变异主要来自于（） （A）基因重组（B）基因突变 （C）染色体变异（D）环境的影响 11．如果基因中四种脱氧核苷酸的排列顺序发生了变化，则这种变化叫（） （A）遗传性变化（B）遗传信息变化 （C）遗传密码变化（D）遗传规律变化
[目的] 掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法 [原理] DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。 本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。 由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分； ②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。 [操作] 1．单链模板与引物退火
(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。 (2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。 2．链延伸/终止反应 (1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。 (2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mi x和T-Mix液各2.5μl分别加入这4只微量离心管中，置37℃预温1分钟以上(说明：4种mix 液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。一般应用short即可)。 (3)标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3μ1；已标记混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀释液2μ1。总体积2 0μ1。 轻轻混匀，简短离心，置室温5分钟，立即接下步反应。 (4)从“标记反应”混合物中，分别取4.5μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。简短离心，37℃保温5分钟。 (5)向每只离心管中加入5μl反应终止液，混匀，简短离心。 (6)变性反应：在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1
双脱氧链终止法 概述：双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。 原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3'端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序：（注：RNA部分不看）(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。 1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。 2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记的ddNTP，例如P ddNTP 和DNA聚合酶(如以RNA为模板，则用反转录酶)，再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。 3.与单链模板(如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5'端向3'端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3'位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3' 末端都为同一种双脱氧碱基。 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 双脱氧法原理示意图：如下图
快速序列测定：双脱氧末端终止法 06级生科A班苏狄 064120202 摘要：核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977年）提出的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法，其中双脱氧链终止法是目前应用最多，最好的技术。 关键词：快速序列测定、双脱氧末端终止法 目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。 除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。 双脱氧末端终止法测序 一、原理 双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K- ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物经过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者
使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列，利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产
第一章名词解释 1.基因（gene）是贮存遗传信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括编码RNA和蛋白质的结构基因以及转录调控序列两部分。 2. 结构基因（structural gene）指基因中编码RNA和蛋白质的核苷酸序列。它们在原核生物中连续排列，在真核生物中则间断排列。 3.断裂基因（split gene真核生物的结构基因中，编码区与非编码区间隔排列。 4. 外显子（exon）指在真核生物的断裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。 5.内含子（intron）指在真核生物的断裂基因及其初级转录产物中出现，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。 6.多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）一个RNA分子上包含几个结构基因的转录产物。原核生物的绝大多数基因和真核生物的个别基因可转录生成多顺反子RNA。 7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）一个RNA分子上只包含一个结构基因的转录产物。真核生物的绝大多数基因和原核生物的个别基因可转录生成单顺反子RNA。 8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）是真核生物细胞核内的转录初始产物，含有外显子和内含子转录的序列，分子量大小不均一，经一系列转录后加工变为成熟mRNA。 9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）mRNA分子上从起始密码子到终止密码子之间的核苷酸（碱基）序列，编码一个特定的多肽链。 10.密码子（codon） mRNA分子的开放读框内从5' 到3' 方向每3个相邻的核苷酸（碱基）为一组，编码多肽链中的20种氨基酸残基，或者代表翻译起始以及翻译终止信息。
人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Huma n K-ras Gene (PCR-Melting Curve Anal ysis) 【包装规格】20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌
患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
Oncogene 致癌基因：当致癌基因发生突变或者表达量增高时，会把正常的细胞转化为肿瘤细胞 Proto-oncogene 原癌基因：是正常的基因，当原癌基因发生突变或者表达量增高时，会变成致癌基因。但正常的原癌基因的产物能帮助调节细胞的生长和分化，且在信号转导和细胞分裂上发挥作用。 Tumor-suppressor gene ：肿瘤抑制基因可以保护细胞不发育为肿瘤，当其功能缺失或者表达量降低时，容易转变为肿瘤 Dominant Activators 显性活化子：一个等位基因的突变则能把细胞生长带入癌变的状态，这样的基因称为非受控细胞生长的显性活化子。 Heat-shock protein ：热休克蛋白：当生物体遇到高温带来的压力时，它体内会应答产生一些热休克蛋白来稳定细胞内的环境。热休克蛋白在真核和原核生物中都有被发现，而且是最保守的一系列蛋白。（机制热使得HSTFs磷酸化，特异性地结合到HSEs 上，启动转录） HREs 激素反应元件：激素诱导的基因表达由DNA中特异性的序列来调控（HREs）RNA干扰：小的、非编码的RNA分子通过与靶mRNA序列部分地或者完全地配对，抑制靶mRNA的翻译或者引起其降解，从而干扰目标基因的表达。 Chromatin remodeling 染色质重塑：DNA的转录过程中，核小体被多蛋白复合体修饰，来使RNA聚合酶易于发挥作用。这种为了转录而进行的核小体的改变称为染色质重塑。 Position effect variegation 位置效应斑：当常染色质变为异染色质的时候，其内部的基因会表达不正常甚至不表达，这种功能上的损伤导致的在同一个体中出现正常和突变基因的混合表达称为位置效应斑。 印记imprinting 一个基因以某种方式比如甲基化被标记据此可以区分该基因来自父本还是母本 分子伴侣chaperone一类帮助其他生物大分子进行结构上非共价形式的折叠与去 折叠，组装与去组装，但它们并不存在于后者发挥生物活性的结构中。 XIC X染色体失活中心哺乳动物中X染色体失活是从XIC开始的，沿着相反的方向传递到染色体的两端。但并不是失活的X染色体上的所有的基因都失去了活性，比如位于XIC中的XIST（X失活特异性转录本）基因则会表达。 Constitutive gene 结构基因编码细胞成分、通常行使看家功能的基因，这种基因在大多数细胞中都持续性的表达。 Positive control 正调控当调控蛋白结合到DNA上后，开启了特定基因的表达，则称为正调控（负调控同理） Effector molecule 效应器分子一种能影响调控蛋白的分子，结合到调控蛋白上之后能够引起蛋白的别构效应，从而结合到DNA上或者脱落，从而开启或关闭特定基因的转录 Operon 操纵子能够共同调节一系列具有相似功能的结构蛋白的遗传单位。一个操纵子包括了一个启动子，一个操作子和一系列的结构基因 Induce 诱导当环境中出现了某一效应器分子后，开启了某些特定基因的转录，称为。。。 Attenation 衰减原核生物基因调控的一种方式，通过提前形成转录终止的信号从而减弱基因的表达。该种调控作用发生在转录与翻译之间，通常是某些氨基酸代谢的调控方式
分子生物学复习题(有详细答案)
绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了“脱氧核糖核苷酸的结构”的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分
四色荧光末端终止法测序简介 DNA测序技术主要依据Sanger的双脱氧链终止法。以DNA单链为模板，在特定条 件下，用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将 4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延 伸是通过引物的3'-羟基和脱氧核糖核苷酸底物的5'-磷酸基团形成磷酸二酯键来完成 的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，这种2'3'ddNTP的5'-磷酸基 团是正常的，而3'位置缺少羟基，因此在DNA聚合酶作用下，仍然可以通过5'-磷酸 基团与引物链的3'-羟基反应掺入到引物链中，但是由于ddNTP没有3'-羟基，不能继 续与下一个5'-磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应 体系中，DNA引物链不断合成与偶然终止，产生一系列的长短不等的核苷酸链。然后 将这些测序反应产物进行电泳。ABI公司的测序试剂中使用了在4种ddNTP上标记了 4种不同颜色的荧光染料，而使得通过测序仪器可以分辨出每一条链被终止时的碱基种 类来逐一判读被测序的DNA模板序列。 对于双链DNA模板，在测序反应过程，我们只加入一条引物，这条引物只与双链 DNA模板任意一条链配对进行测序反应，与引物不配对的另一条DNA单链在反应中 不会干扰序列反应的测定。 DNA测序常见问题答复 1．为什么需要5ml菌液？ 测序需要的DNA模板量较大，每次测序反应一般需要400ng(载体及插入片断大于10K则需要更多)，并且样品准备需要鉴定、遇到一次测序实验不理想还需要重做、有些样品还需要进行多次测序等等。 2．如何提供菌液？ 您可以提供4-5ml新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；最好是将菌体沉淀下来(5000转/分钟)，倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 3．如何制作穿刺菌？ 用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4oC保存。 4．PCR产物直接测序有什么要求？ 1)．扩增产物必须特异性扩增，如果扩增产物中有非特异性扩增产物，一般难以得到测序结果；2).必须进行胶纯化；3.长度200-500左右比较合适。小余200碱基对，大于500碱基对的样品进行直接测序不合算。 5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？ 如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。