动物细胞融合技术的应用
动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起
到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。
一、用于基因定位和绘制人类基因图谱
JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。
二、用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗
一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和强烈的免疫应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际。
三、用于生产单克隆抗体
使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。1985年，中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和治疗。
四、用于动物育种
体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer technique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础。
五、用于细胞疗法
SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的免疫排斥。
六、动物体细胞融合在基础理论研究方面的应用
(1)用于研究细胞的核质关系和个体发育。20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发现细胞松弛素B（CB）能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研究基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成人型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病。
（2）用于揭示疾病发生的机制。与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，Lattanzi G等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究。
（3）用于膜蛋白动力学研究。细胞融合技术与显微镜技术结合使用被用来研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系，Péter Nagy 等的研究发现大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物major histocompatibility complex,MHC，包括MHC Ⅰ和MHC Ⅱ）发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动物细胞工程教案 【教学目标】 1．知识目标： 1.1简述动物细胞的培养过程、条件及其应用； 1.2简述克隆动物的概念含义和基本原理 1.3简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景 1.4简述细胞融合的方法过程和单克隆抗体的制备过程应用 1.5关注克隆技术的伦理问题。 2．能力目标： 2.1通过阅读、自学、质疑、讨论、总结等环节，提高获取知识、分析问题和解决问题的能力 2.2由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力和思维能力 2.3通过设计单克隆抗体的制备过程，使学生了解生物科学认识模式发展学生的创造性能力。 3．情感态度与价值目标： 3.1 初步培养学生探索、创新和合作精神 3.2 明确知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。 【教学重点】简述动物细胞的培养过程；举例说出细胞融合和单克隆抗体；关注克隆技术的伦理问题。 【教学难点】动物细胞培养过程；细胞融合技术和单克隆抗体的制备。
【教学设计思路】采用自学、指导模式对动物细胞培养技术进行较深刻、透彻地学习，这部分内容主要是解决三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。关于动物细胞的培养过程，教师可参照教材中的动物细胞培养过程示意图进行讲解，讲解中要注意区分原代培养和传代培养这两个概念。对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。为学习其他动物细胞工程打好基础。在动物体细胞核移植技术及克隆动物的教学中，可首先让学生列举所知道的克隆动物，调动学生已有的知识。随后可向学生提问：克隆动物的方法与植物组织培养一样吗？然后向学生说明目前动物体细胞克隆是通过核移植技术来实现的，以引入本节的主题。关于核移植技术发展简史，可让学生在课堂上阅读，本节的重点和难点是在动物体细胞核移植技术过程，教材中选用了“多利羊”为例，来说明体细胞核移植的过程。教师应充分利用和挖掘教材内容，带领学生一步步弄清动物体细胞核移植技术的过程。对于体细胞核移植技术的应用前景和存在的问题这部分内容，可结合本节教材“积极思维”中的有关问题，让学生讨论。在细胞融合和单克隆抗体的教学中，教师启发学生回忆植物体细胞杂交过程；通过新旧知识对比，引导学生大胆推测动物细胞融合过程，培养学生知识迁移能力，并通过课件演示细胞融合的全过程，加强教学的直观性，培养学生的观察、思维能力。教师要讲明动物细胞融合技术的意义和应用，以便自然过渡到单
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
动物细胞工程制药研究现状和展望 摘要：当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面.本文综合论述了动物细胞工程制药的发展简史,研究近况和制造实例,并在此基础上探讨了动物细胞工程制药的未来发展趋势和前景. 关键词:动物细胞工程制药;细胞融合;细胞大规模培养;核移植 21世纪,生物技术制药是制药行业的亮点,近25年来,世界生物技术工业飞速发展,创造了35种重要的治疗性生物技术药物.中国生物技术产业是紧跟世界产业同步发展的.20XX年全球生物技术药物市场销售额已达到828亿美元.基因工程、细胞工程和酶工程组成三驾马车行驶在现代生物技术发展大道的前列.动物细胞工程在生物制药的研究和应用中起关键作用,目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%,例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等.所以对动物细胞工程制药的研究具有重要意义. 一、发展简史 开始 疫苗是动物细胞技术的开始,在疫苗产业早期,往往利用动物来生产疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗,用奶牛来生产天花疫苗,用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗.在1920年至1950年,已经开发了多种病毒或细菌疫苗,如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黄热病疫苗等.早在1950年代,已经能够利用动物细胞培养技术来生产病毒.先在反应器中大规模培养动物细胞,待细胞长到一定密度后,接种病毒,病毒利用培养的细胞进行复制,从而生产大量的病毒,这一突破是动物细胞技术或细胞工程的真正开始.基于动物细胞技术生产的病毒疫苗包括减毒的活病毒,或是灭活的病毒.在过去的30多年时间内,用动物细胞技术生产的疫苗挽救了几百万人和动物的生命.1950年至1985年期间,细胞工程及其他技术的进步,生产了多种人用疫苗来预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等,并用于生产多种兽用疫苗.但是,这段时期对细胞表达水平的研究仍然很低,因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、成本高,因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产. 发展
第三节动物细胞工程的应用 一、选择题 1.动物细胞培养时,最好选用的培养材料是() A.衰老退化的动物组织细胞 B.成熟动物个体的体细胞 C.动物的受精卵细胞 D.胚胎或幼龄动物的体细胞 解析:胎胚或幼龄动物的体细胞增殖能力强,易于培养。 答案:D 2.动物细胞培养过程的顺序是() ①原代培养②传代培养③用胰蛋白酶处理组织,形成分散的细胞悬液 A.①②③ B.①③② C.②①③ D.③①② 解析:动物细胞培养的材料选自动物胚胎或幼龄动物器官或组织,先用胰蛋白酶处理制成细胞悬液,再进行原代培养和传代培养。 答案:D 3.利用动物细胞融合技术可以获得杂交瘤细胞,下列针对单个杂交瘤细胞的叙述不正确的是() A.经筛选过程方可获得 B.具有双亲细胞的遗传物质 C.可分泌多种特异性抗体 D.体外培养条件下可大量增殖 解析:杂交瘤细胞的制备是动物细胞融合技术的应用,其过程是从已免疫的小鼠体内取出B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞,通过物理、化学或生物方法使之融合形成杂交瘤细胞,单个杂交瘤细胞只能分泌一种抗体。 答案:C 4.生产单克隆抗体时,在培养液中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞,因为该试剂() Earlybird
A.能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA 复制 B.能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活 C.选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA 复制 D.能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成 解析:由于骨髓瘤细胞与杂交瘤细胞都能无限增殖,而生产单克隆抗体需要选择出杂交瘤细胞,所以需要用试剂抑制骨髓瘤细胞DNA 的复制。因此,该试剂的作用为选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA 复制。 答案:C 5.伦理学家极力反对克隆人,以下哪项不是他们反对克隆人的原因?() A.严重地违反了人类伦理道德 B.冲击了现有的伦理道德观念 C.克隆人是心理不正常的人 D.干扰正常的社会和家庭关系 解析:克隆人严重地违反了人类伦理道德,冲击了现有的伦理道德观念,干扰了正常社会和家庭关系,我们应持反对态度。 答案:C 6.关于单克隆抗体,下列叙述不正确的是() A.可以制成诊断盒,用于疾病的诊断 B.可以在生物体内生产,不能体外生产 C.具有特异性强、纯度高、灵敏度高等优点 D.可以与药物结合,用于病变细胞的定向治疗 解析:杂交瘤细胞的制备是动物细胞融合技术的应用,其过程是从已免疫的小鼠体内取出B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞,通过物理、化学或生物方法使之融合形成杂交瘤细胞,经过筛选与培养,可得到能产生单一抗体的杂交瘤细胞,再经过体内或体外培养可获得单一抗体,因而具有较强的特异性。单克隆抗体还具有纯度高、灵敏度高等优点。由于单克隆抗体具有较强的特异性,所以可制成诊断盒用于疾病诊断,也可以与药物结合,用于病变细胞的定向治疗。 答案:B 7.下图为“多莉”,有关“多莉”的说法正确的是()
动物细胞工程制药技术 摘要 生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文章主要讲述动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。 关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培养核移植
1、动物细胞工程制药技术 1、1.细胞融合 细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。 此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。 1、2.转基因动物 利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。 据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95％。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产α 1 －抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白
动物细胞培养在药物领域的应用 摘要：动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。本论文主要介绍动物细胞培养在药物领域的应用。 关键词：现代生物技术、动物细胞工程、动物细胞培养、药物领域、单克隆抗体 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。细胞工程领域更离不开细胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。 一、首先介绍下动物细胞特点及其培养的基本要求和技术 1、动物细胞特点 动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，细胞质，细胞核，而且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 体外培养的动物细胞可分为原代细胞和传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。通常体外大量培养的动物细胞有哺乳动物细胞、昆虫细胞、禽类细胞和鱼类细胞等。 2、动物细胞培养的要求 动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH （36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。 其中动物细胞对营养要求更加苛刻，包括有氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或者半乳糖，除此之外还要有血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。这些都是组成培养基的重要成分。 动物细胞培养还需要防止污染问题，细菌、真菌、病毒均可以导致动物细胞在培养过程中受到感染而死亡。而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境均会引起污染。显著的污染标志是培养基的pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。 3、动物细胞培养的步骤 ①无菌操作取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净； ②以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块； ③将小组织块置解离液离散细胞（解离液含有蛋白酶类）； ④低速离心洗涤细胞后，讲目的细胞吸移至培养瓶内培养。注意，哺乳动物细胞的大量培养需要提供较大的支持界面，原因前面已经说过，那是因为哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 4、动物细胞培养的方法
动物细胞培养在药物上的应用 摘要我国药物市场正迅速发展，药物生产技术不断地进行技术革新。动物细胞培养技术不仅提高我国药物生产工艺水平和药物质量，更推动了动物细胞培养技术在我国药物行业中的研发应用和技术发展。本文从动物细胞培养技术的发展、趋势、应用及前景等方面进行了综述，分析并探讨了动物细胞培养技术在我国药物生产中的应用前景。 关键词：动物细胞培养药物应用前景 1.动物细胞培养技术的发展及趋势 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 50年代末，随着生物科学和技术科学的相互渗透，遗传学和生物化学的相互结合，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学，这些新科学的形成和发展都与细胞培养有密切关系。当前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域，出现了用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物质、癌基因转染和细胞转化等。动物细胞培养将在药物上有着广泛的应用。 2.动物细胞培养技术的应用 2.1.动物细胞培养技术在临床医学上的应用 动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞，经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型。以此可避免先天残疾儿的诞生。现在用这种方法已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，现在的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早的预防和治疗。在这方面，我国的科学工作者有较突出的研究成果，他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生产
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。 20 世纪 60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于 1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织 4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模
动物细胞工程的应用及展望 动物细胞工程（Animal cell engineering）是指以动物细胞或其组成成分为研究对象，对细胞或其组分进行操作、加工或改造，使其按照人的意图发生结构或功能等生物学特性的改变，获得人类所需的生物产品或创造新的动物品种。 在自然生理状态下，不论是植物或是动物，其细胞、组织或器官是在体内环境中完成其生命代谢活动的，细胞只在其既定的遗传信息的指导下，按照自身的规律生长分化，表现自身特有的生物性状和生理得以发挥其功能。 随着生命科学和技术的发展，在充分认识细胞的结构、组成和生物学特性的理论基础上，细胞工程技术可以，在分子、亚细胞、细胞、组织或器官的不同水平上，借助专门的技术手段，于体外或体内环境条件下，按照人的意愿对细胞进行操作或加工，改造其结构或组成，进而使其生物学功能发生定向改变，以实现人类所需生物产品的工程化生产。 动物细胞工程主要研究内容可概括为以下几个方面：动物细胞培养，动物细胞融合和单克隆抗体，干细胞工程，动物克隆，转基因动物及生物反应器等。1. 动物细胞培养 动物细胞、组织和器官的培养将分离自动物机体各部分的细胞、组织块或整个器官，用专用的培养基和培养箱进行体外培养（in vitro culture），抑或进行体内培养（in vivo culture）。 动物细胞培养技术在人类医学临床治疗上发挥了巨大的作用，具有广阔的应用前景。生产许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 2. 动物细胞融合和单克隆抗体 细胞的融合技术广泛应用于细胞生物学、免疫学、遗传学、病毒学、微生物学和医学等不同领域的基础研究和实践应用。在动物上多用于产生杂种细胞，制备单克隆抗体，制备克隆动物等。细胞融合技术还用于产生异种核质的杂种细胞，用以研究细胞的核质关系。 1975年Kohler和Milstein建立B淋巴细胞杂交瘤技术以制备单克隆抗体以来，针对各种抗原的单克隆抗体已被广泛应用于生命科学的各个领域。 B淋巴细胞杂交瘤技术不但将淋巴细胞产生单一抗体的能力和骨髓瘤增生
动物细胞培养技术研究进展 （张云生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100） [摘要]:动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，可分为原代和传代培养，有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。 [关键词]:细胞培养；微载体；中空纤维；微囊；生物反应器 1885年，W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽； 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养(Animal cell culture)的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合(Cell fusion) 、细胞杂交(Cell hybridization)以及转基因(Transgene)技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分[1]。 1 基本概念[1, 2 ] 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养( Primary Culture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养( Subculture)。根据原代培物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系( Cell line)或细胞株(Cell Strain)。这些细胞一般可顺利传40～50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株；在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。 2 体外培养动物细胞的生物学特性 动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染；对生长环境和培养环境要求苛刻[3]。 2. 1 细胞生命周期性变化[1] 体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。 1. 潜伏期(Latent phase) 细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。 2. 指数生长期(Logarthmic growth phase)指数生长期是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛。在接种细胞数量适宜的情况下。指数生长期持续3～5 d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少,营养环境恶化，呈现接触抑制(Contact inhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑