蛋白质组学课程试题
简答题（每题10分）
1、自由流电泳分离蛋白质的机理及其优缺点。
自由流电泳（CFFE）是在无固相支持介质的薄的矩形分离中，以缓冲液为分离介质进行生物大分子或不溶性颗粒及细胞等物质的分离纯化技术。在CFFE中，分离介质在两块平行的矩形板组成的分离腔内形成层流（两板之间的距离通常介于0.5-3.0mm）分离腔的两侧为正负电极室。被分离物质由一口径很小的输入口进入分离介质中，形成一细带，在垂直于液流的方向上加上均匀的电场后，样品中各种组分由于各自电泳迁移率的差异而各自向与所带电荷符号相反的电极以不同的速度迁移，相同电泳迁移率的物质则迁移为一窄带，在到达分离腔出口处由分级手机器收集。
优点：CFFE是一个连续的而不是分批进行的分离过程。同时由于它不使用有机溶剂、高盐溶液，及硅胶或凝胶等支持介质，分离调节相当温和，对有活性的生物材料的分离纯化提供了十分合适的分离环境。
缺点：因自由流电泳是完全无载体的液相电泳，因此除了电泳本身所固有的影响因素外（如：焦耳热，电动力学变形），还有层流（流体力学变形）以及一些综合因素的影响（电流体力学变形等），且这些过程常常互相关联，使整个过程变得极其复杂。重力对自由流电泳会产生影响。颗粒沉降、小滴沉降和热对流是影响自由流电泳的三种重力现象，在微重力条件下这些现象几乎消失，这使CFFE的放大在空间有可能得到实现。
2、质谱仪的组成及其主要技术指标。
质谱仪一般由进样装置、离子化原、质量分析器、离子检测器、数据分析系统组成。其中，离子化原用来待分析的分子转化成气态离子。在质量分析器中，不同荷质比m/z离子在一个随时间变化的电场作用下分离。离子检测器用来接受在质量分析器中分离的带有不同荷质比的离子检测m/z值以及不同m/z的离子密度。
主要技术指标包括：灵敏度，分辨率，准确度，稳定性，质量范围，动态范围
3、蛋白质组学定量分析方法的主要原理。
蛋白质组学定量分析主要包括两种方法：
1、建立在2－DE基础上的电泳方法：其原理是通过比较通过比较蛋白质在不同胶上的染色强度来进行相对定量。提供蛋白质表达水平的信息。
2、利用质谱检测技术：对来自不同样品的肽段标上一个内部标准，使得可以识别不同样品来源的肽段，以质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。
4、请列举预测蛋白质相互作用的方法。
1、酵母双杂交法：主要原理是将可能存在相互作用的蛋白之一与Gal4的DB结构域融合。另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。如果在两个待测蛋白之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
2、免疫共沉淀法：免疫共沉淀是一种比较经典的蛋白质相互作用方法，其实验比较简单。裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性亲和再分析结合复合体。目前常使用Pull－down实验结合免疫共沉淀可以对可能的蛋白质相互作用进行验证。
3、高通量质谱蛋白质鉴定：使用一分子标签如FLAG标记把蛋白，使融合蛋白在细胞内过表达。通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中把蛋白形成的蛋白质复合物。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。此法适合于分析天然状态下细胞内浓度较低的蛋白质，但是如果蛋白质浓度过高则背景较强，产生假阳性。
4、串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）：该技术核心是设计一个双重分子标签，包括A蛋白（IgG binding protein）、TEV蛋白酶切位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近把蛋白的天然状态。可以与把蛋白相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温浴在一起，通过A蛋白复合物结合在IgG上。冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱复合物。在Ca2+存在的情况下，洗脱液与包被钙调素的温育在一起，复合物就结合在珠子上。进一步洗去杂质后，加入EGTA鳌合，复合物脱落。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶切割后进行质谱分析。该方法检测到的蛋白质相互作用更加接近自然条件下蛋白质的性质，包括浓度，定位和翻译后修饰。适合于
检测大量蛋白质之间的相互作用而形成的复合物，而不局限在两个蛋白质之间相互作用。但是不能检测蛋白质复合物形成的顺序。需要与酵母双杂交等方法互补。
5、系统生物学研究的主要流程是什么？
1. 对前人的实验进行总结，获得大量关于系统的信息，在已有的大量数据（如：基因组，蛋白质组，转录组，代谢组等数据）的基础上，对选定的某一生物系统的所有组分进行了解和确定，描绘出该系统的结构，包括基因相互作用网络和代谢途径，以及细胞内和细胞间的作用机理。以此构造出一个初步的系统模型。这是一个由数据得到模型的过程。
2. 对模型进行精炼，并在这个初步模型的基础上对可能的现象，或某些实验的结果进行预测。
3. 根据模型作出的预测设计实验证明或证伪初步模型，如：系统地改变被研究对象的内部组成成分（如基因突变）或外部生长条件，然后观测在这些情况下系统组分或结构所发生的相应变化，包括基因表达、蛋白质表达和相互作用、代谢途径等的变化，并把得到的有关信息进行整合。这样又从实验中达到了大量的数据和信息。这个过程需要实验室中真实的实验。
4. 把通过实验得到的数据，信息与根据模型预测的情况进行比较，根据实验结果与模型预测结果的差异程度对初始模型进行修正，或抛弃。
5. 如果模型不被彻底抛弃，则根据新实验数据修正后的模型则取代了原有模型，利用这个模型仍可进行预测，并据此设计和实施新的改变系统状态的实验，重复上述各步骤，不断地通过实验数据对模型进行修订和精练。
6、试述如何应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学的研究，并分析其优缺点。
2D-PAGE原理是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分离出来。
应用2D-PAGE进行差异蛋白质组学研究主要步骤有：
1、在应用2D-PAGE研究差异蛋白质组学问题时首先要获得要进行差异比较的组织，如肿瘤组织与癌旁正常组织，然后裂解组织和细胞，抑制蛋白酶活性，出去非蛋白质的DNA，RNA，脂类等物质，溶解蛋白质，溶解并抽提总蛋白质。
2、将准备好的蛋白质进行2D-PAGE实验，先选择合适的PH范围进行等电聚焦，平衡胶条，再进行第二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3、对2D凝胶进行染色处理（可选择各种染色方法），利用软件分析比较成对组织的2D结果，找到上调或下调的蛋白质点。
4、将有差异的蛋白质点切割下来进行质谱分析，质谱谱图通过查询数据库找得蛋白质点对应的蛋白质。
5、对于得到的有差异的蛋白质要进一步进行验证，常用的手段包括：Western Blot, RT-PCR, 免疫组织化学等。
利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的优点主要在于：
1、效率高：目前，一块胶板(16cm×20cm)可检测到3000～4000个甚至10000个蛋白斑点。
2、可重复性好：80年代开始采用固定化pH梯度胶的IEF，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度，可建立很窄的pH范围(0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化pH梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；
3、灵敏度高：SDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离10～100kD分子量的蛋白质；银染色法可检测到4ng蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定20ppm的标记蛋白。
利用2D－PAGE进行差异蛋白质组学分析的缺点主要在于：
1、对盐，DNA等杂质高度敏感。
2、对于溶解度低的输水性蛋白质，酸性，碱性蛋白质效果不好。
3、对PH和MW的范围有所限制。
4、耗时，无法自动化。
7、翻译后修饰（包括糖基化、磷酸化、泛素化等）的蛋白质组学研究中共性核心技术是什么？简述如何将这些技术应用到你的课题研究中。
研究翻译后修饰的蛋白质组学方法的共性是都要首先从细胞或组织的总蛋白中分离出带有特定修饰集团的蛋白质，然后经过电泳，酶解，富集有修饰的肽段，最后通过质谱分析和数据库检索确定被修饰的蛋白质种类以及被修饰的位点。
例如：设计如下的蛋白质组学课题“高通量寻找食管鳞癌组织中磷酸化修饰异常的蛋白质”，则可以按照上述核心技术流程设计以下实验：
1、设计并制备磷酸化蛋白特异性抗体（单抗或多抗）。
2、分别从食管癌组织和癌旁正常组织中提取总蛋白。
3、分离磷酸化蛋白：使用磷酸化特异性抗体进行免疫共沉淀。或者将磷酸化抗体连在亲和层析柱上，将总蛋白过柱分离磷酸化蛋白质。
4、分离得到的食管癌组织的总蛋白和癌旁正常上皮的总蛋白分别进行2D－PAGE实验。
5、用软件分析比较2D-PAGE胶，找到有差异的蛋白质点，则可能是磷酸化修饰异常的蛋白质。
6、选取差异的蛋白质点，用酶切成肽段。
7、采用亲和层析法富集磷酸化肽段（因为磷酸化肽段在总肽段中所占比例少，需要富集）。
8、进行质谱分析，数据库检索确定磷酸化肽段序列。再进一步确定磷酸化的蛋白质。
9、为了提高结果的可信度还要在体外验证结果的真实性。如果有条件还要在较大样本中确定这种磷酸化修饰的异常在人群中的比例，以及与食管癌发生发展的关系。
实验设计题（共30分）
根据蛋白质组学研究方法，结合本实验室的研究方向，设计一个相关蛋白质组学实验。（包括研究意义、国内外研究现状及参考文献、研究方法及流程、预期结果）
食管鳞癌异常表达的蛋白质研究
一、背景，研究意义
食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，其死亡率分别位居我国和世界恶性肿瘤的第四位和第七位。原发的食管癌主要包括腺癌和鳞状细胞癌两种类型，西方的白人以腺癌为主，东方的黄种人以鳞癌居多。遗传易感性也是食管癌发生的重要因素。我国河南、山西、山东等省食管癌高发区的调查显示食管癌患者有家族史者为24%—61%。在一个家族中，食管癌可在同一代或连续两到三代内发生。食管癌这种明显的家族聚集现象显示出一些遗传易感基因可能在其中扮演重要角色。大量研究资料表明，基因异常改变的积累以及蛋白质表达谱的异常干扰了细胞的正常生物学行为，导致细胞恶性增殖。最常见的基因改变是原癌基因的激活和抑癌基因的失活，二者通过参与细胞周期的调控、信号传导、细胞分化及凋亡等事件，引起肿瘤的发生和发展。尽管食管癌发生的分子遗传学研究已经有了很大的进展，但我们对于它认识仍然相当不足。目前，还没有找到一个临床上可用的诊断特别是早期诊断的分子标志物或一个很好的基因治疗的靶点。近年来不断进展的蛋白质组学为我们提供了一个新的研究食管癌发生、发展分子遗传学事件的平台。
蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，是在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展起来的一门学科，旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能，具体包括蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等。蛋白质组研究的显著特点在于其动态性，这种动态的特征是指某种生物蛋白质组随着空间和时间的变化而变化，表现为生物体内不同的器官、组织、细胞的蛋白质组是不同的；同一种组织中位于不同层次的同种细胞表达的蛋白质组也不同；在不同的营养状况、温度、压力环境、药物等作用下细胞和组织蛋白表达谱也在变化。所以应用蛋白质组学手段有望从蛋白质表达水平阐明食管癌发病的分子机理以及寻找候可用于治疗或诊断的标记蛋白。
二、研究现状
根据文献报道，多年来利用比较基因组/蛋白组组学方法，人们已经找到部分基因/蛋白质在食管癌中表达异常，包括：Cyclin D1, Rb, p16, p53, mdm-2, EFGR, c-erbB-2, int-2, hst-1, Bcil-2, p450(CYP), ADH2, ALDH2, MGMT, E-cadherin, FzE3, BMPs, MK, Grb7, MTA1, COX-2, FEZ1, G-7, CAAF1, MAL, SPRR3, TGM3,Cystain B等。
三、实验设计总体思路
食管癌的发生被认为是一个复杂过程，涉及多个基因的改变。本实验准备采用比较蛋白质组学的方法，使用2-DE比较食管鳞癌及其癌旁正常食管上皮的蛋白质表达谱，揭示其中差异表达的蛋白，之后通过质谱对这些蛋白进行鉴定，并用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学等方法对鉴定出的蛋白在mRNA和蛋白水平的变化进行验证和初步的功能分析。通过这样的技术路线，希望能够找到与食管癌发生、发展及转移相关的蛋白，为阐明食管癌发病的分子机理、寻找候选标记蛋白以及发展早期诊断和生物治疗提供线索。
四、具体实验步骤
（一）准备工作（组织切片，提RNA，提蛋白质等）
1、冰冻切片：从临床获得手术切除的新鲜食管癌组织标本（取多个病例的组织标本，每例标本均包括肿瘤组织以及手术切端正常组织），进行冰冻切片，切片分为两种：厚切片用于显微切割，薄切片用于HE染色。
2、根据HE染色的情况，在显微镜下对比厚切片和薄染色切片中的正常上皮和肿瘤细胞的分布情况。根据HE 染色定位切片中切割的位置。切割后将细胞洗下，离心，加入裂解液提取蛋白。
3、组织总RNA提取：购买组织RNA提取试剂盒，分别取冻存的肿瘤及手术切端正常的组织标本提取总RNA。
4、组织处理及蛋白提取
组织处理：去除组织块上的血液。组织放入研钵中，加入液氮磨碎。加入蛋白抽提液裂解。离心后去细胞碎片及DNA等，吸取含有蛋白的上清，Bradford法测定蛋白浓度，－70oC储藏待用。
（二）异常蛋白质的质谱鉴定
1、2D－PAGE实验：按正常的2D－PAGE流程进行实验，将得到的2D电泳凝胶分别进行银染色或考马斯亮蓝染色。（进行2D实验时采用窄pH范围的干胶条进行等电聚焦能够有效地提高中低丰度蛋白的分离效果，降低碱性蛋白的电渗漂移对等电聚焦的干扰）使用ImagMaster 2-D Elite软件分析2-DE胶扫描图像，在软件分析的
结果上利用人工解析，并结合多对组织的分析结果，选择这些组织中变化频率较高的蛋白质点进行质谱鉴定。
2、质谱鉴定：选取考马斯亮蓝染色后的2－DE凝胶上的差异蛋白点，分别编号，用刀片沿考马斯亮蓝染色边缘切下蛋白斑点，胰酶切割成肽段，脱脱盐后，进行质谱分析，蛋白质质谱的分析包括肽质量指纹分析和多肽的序列测定。分别使用MALDI-TOF MS和LC-ESI-IT MS进行检测。用MALDI-TOF MS分析所得的肽质量指纹图谱在http//https://www.doczj.com/doc/c48075158.html,上使用Mascot软件进行比对，分值最高且大于规定的有显著性意义分值者为鉴定的目的蛋白。
LC-ESI-IT MS的检测标准为Xcorr值大于2.5（三价离子）、2.0（二价离子）、1.5（一价离子）和ΔCn大于0.1。在此基础上得到的候选蛋白质中，将分值最高且明显高于第二个候选蛋白质的作为鉴定的目的蛋白。（三）异常蛋白质的进一步鉴定：
如果上述实验成功，在质谱鉴定结果中会得到多个在肿瘤组织中表达异常的蛋白质。为了提高可信度，通过Western blot、免疫组织化学和RT-PCR等方法，对质谱鉴定的蛋白质在食管癌中的异常表达作进一步的验证和初步的功能分析。
1、RT-PCR分析，电泳检测：因为蛋白质的表达由于受到mRNA翻译后的修饰和调节，因此蛋白质水平的上调并不意味着mRNA的上调。RT-PCR从mRNA水平检测上述实验得到的异常蛋白质在食管癌及其癌旁组织中的表达差异情况是否与mRNA水平的变化一致。此检验可以为下一步研究这些异常蛋白质的变异机理及功能提供必要的信息。
2、Western Blot分析：选取其他病例，用Western Blot 方法从蛋白质水平分析验证上述实验得到的异常蛋白质在食管癌及其癌旁组织中的表达情况是否与2D-PAGE和质谱分析的结果一致。
3、免疫组织化学分析：免疫组化方法既可以结合统计分析手段，在包含大量病例的样本中从组织水平进一步验证质谱鉴定出的蛋白质变异的比例以及与肿瘤发生发展的相关性，进而寻找食管癌进展的指示性标记。还可以观察不同的异常蛋白质之间的共变化情况，为蛋白质的功能研究提供线索。
五、预期结果
1、在2D－PAGE胶上利用软件分析的结果上利用人工解析，并结合多对组织的分析结果应该能够选择出20－30个肿瘤组织中明显异常的蛋白质点。
2、切割这些蛋白质点进行质谱鉴定并进行数据库检索，应该可以至少找到10－20个与蛋白质点匹配的蛋白质。
3、如果实验成功，在进一步利用RT-PCR，Western Blot，免疫组织化学等方法验证应该可以证实5－10种蛋
白质在食管癌中存在高频率的异常，接下来可以进一步利用实验所提供的信息进行这些蛋白质的功能研究（如：某两种蛋白质在组织水平的变化存在明显的相关性，则它们很可能处于同一信号通路或存在相互作用。）还可以进一步研究表达异常的原因（如：蛋白质水平的异常如果与mRNA水平一致，则异常变化可能是DNA水平的变化或者转录调控水平的变化导致。而如果蛋白质的水平的异常与mRNA不一致则可能是翻译水平的变化导致的）。另外如果幸运可以从大样本的病例中，在发现的蛋白质中验证出1－2个指示食管癌进展的分子标记为早期诊断和生物治疗提供线索。
六、参考文献
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名词解释 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 双向电泳原理：双向一般是指第一向为等点聚焦（IEF），根据蛋白质等电点进行分离；第二向为SDS凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的相对分子量进行分离。 三步纯化策略:第一步粗提，浓缩，稳定蛋白，去除蛋白酶，使用梯度洗脱来增加捕获步骤的速度和容量；第二步中度纯化，去除主要杂质，一般需要连续梯度洗脱； 第三步精纯，最终去除痕量杂质，如目标蛋白的结构变体。 高效液相色谱：是一种以高压输出液体为流动相的色谱技术。在技术上采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器，克服了经典液相色谱固定相柱效低，分析周期 长的缺点，具有分析速度快、分离效率高、检出极限地的特点。 吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸 附中心的过程。 PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 基因组文库：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一 基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。 cDNA文库：按构建基因文库的类似方法对cDNA进行克隆，获得的克隆总称。 基因芯片：基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 基因敲除（gene knock out）：又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细
《基因组学与蛋白质组学》课程教学大纲 学时： 40 学分：2.5 理论学时： 40 实验学时：0 面向专业：生物科学、生物技 术课程代码：B7700005先开课程：生物化学、分子生物 学课程性质：必修/选修执笔人：朱新 产审定人： 第一部分：理论教学部分 一、课程的性质、目的和任务 《基因组学与蛋白质组学》是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，是融合了生物信息学、计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。是当今生命科学研究的热点与前沿领域。由于基因组学与蛋白质组学学科的边缘性，所以本课程在介绍基因组学与蛋白质组学基本基本技术和原理的同时，兼顾学科发展动向，讲授基因组与蛋白组学中的热点和最新进展，旨在使学生了解现代基因组学与蛋白质组学理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、课程的目的与教学要求 通过本课程的学习，使学生掌握基因组学与蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在基因组学与蛋白质组学上的应用及典型研究实例，熟悉从事基因组学与蛋白质组学的重要方法和途
径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，并通过学习提高自学能力、独立思考能力以及科研实践能力，为将来从事蛋白质的研究奠定坚实的理论和实践基础。 三、教学内容与课时分配 第一篇基因组学
第一章绪论（1学时） 第一节基因组学的研究对象与任务； 第二节基因组学发展的历程； 第三节基因组学的分子基础； 第四节基因组学的应用前景。 本章重点： 1. 基因组学的概念及主要任务； 2. 基因组学的研究对象。 本章难点： 1.基因组学的应用及发展趋势； 2.基因组学与生物的遗传改良、人类健康及生物进化。建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题： 查阅有关资料，了解基因组学的应用发展。 第二章人类基因组计划（1学时） 第一节人类基因组计划的诞生； 第二节人类基因组研究的竞赛； 第三节人类基因组测序存在的缺口； 第四节人类基因组中的非编码成分； 第五节人类基因组的概观； 第六节人类基因组多样性计划。 本章重点： 1. 人类基因组的研究； 2. 人类基因组多样性。 本章难点： 人类基因组序列的诠释。 建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题：
通过校园网进入数据库例如维普期刊数据库、CNKI、超星电子图书等。完成 A、任选一题，检索相关资料，截取检索过程图片，做成一个ppt文件（50分）。 B、写综述形式的学术论文(学术论文格式，字数不限，正文字体小四)，做成word文件（50分）。要求：按照自己的思路组织成文件，严禁抄袭。 写明班级学号，打印纸质版交给老师。 1、对检索课题“磷酸对草莓生长和开花的影响”检索中文信息。提示：磷酸的化学物质名称是“Phosphonic acid ”普通商业名称是“ethephon”， 2、基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响 3、红霉素衍生物的设计、合成与抗菌活性研究 4、HPLC法测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中L-谷氨酰胺的释放度 姓名：朱艳红 班级： 11生科师范 学号： 11223074 学科教师：张来军
基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响琼州学院生物科学与技术学院 11生科师范2班朱艳红 11223074 摘要 20世纪末伴随着人类基因组计划的实施，相继产生了基因组学和蛋白质组学，基因组学和蛋白质组学的迅速发展，对药学科学产生着深远的影响。文章在简介蛋白质组学基本概念、核心技术的基础上，综述了基因组学和蛋白质组学对新药研发带来的影响。 关键词：基因组学；蛋白质组学；药物研发 The impact of genomics and proteomics on the research and development of innovative drug abstract With the implementation of the 20th century,Genomics and proteomics had emerged one after the other. Driven by Soaring development of the omits，pharmaceutical industry presents a new vision，all human life faces a promising future. On the basis of proteomics Introduction to basic concepts, core technology, reviewed the genomics and proteomics research on the impact of new drugs. Keywords:Genomics; proteomics; drug development
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
蛋白质组学技术在农业生物科研领域、疾病机理机制研究、药物研究、海洋环境、植物胁迫机制研究等方面具有广泛应用。蛋白组学的研究通常遵循以下思路： 蛋白质组学研究思路 图 1 蛋白质组学研究思路 一、蛋白质组学在农业生物科研领域的应用 蛋白质组学技术在农业生物科研领域的应用为作物生长发育、病虫害防治、遗传育种、畜牧兽医学疾病诊断和治疗等方面发挥重要的作用，为现代农业发展开辟新途径。 1 .蛋白质组学在农作物研究中的应用 农业是我国人口赖以生存的基础，而提高粮食产量和品质则是农业发展的关键。蛋白质组学关键技术在作物遗传育种、品系鉴定、品质改良、逆境胁迫应答等关键环节的应用，为农业作物的进一步开发利用提供巨大的参考价值。蛋白质组学可系统研究农作物在特定环境或某个发育阶段的组织和器官中蛋白质的表达变化，有助于作物发育过程机制的理解。 Jia等人利用SWATH等技术对四种玉米组织中的蛋白质进行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日龄幼苗的根。在玉米的4种组织中总共鉴定到4551个蛋白质，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分别鉴定到3916、3707、3702和2871种蛋白质。利用生物信息学技术将蛋白质组和转录组进行关联分析，并且进一步分析组织特异性高表达的基因和蛋白，以了解玉米组织结构和器官发生的调节机制，为研究玉米发育生物学研究提供了新的线索。相关成果2017年发表在Journal of Proteome Research上。
图 2 实验流程图 文献来源：Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017. 2.蛋白质组学在食品科学中的应用 在食品安全研究中，蛋白组学的出现为食品科学的研究指明了方向，同时也为食品科学的研究奠定了良好的发展平台。蛋白质组学在粮油食品、肉类食品、水产食品、乳品食品等方面的应用，不仅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及储存条件的同时，还可以提高食品的口感以及营养程度。 在热处理过程中，肉类的主要成分蛋白质会发生结构性变形，如氧化、降解、变性和聚集。蛋白质的这些变化对最终肉制品的质量、颜色、嫩度和风味有重要影响，并最终影响适口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技术手段研究了在加热中心温度为72℃时用不同的烹饪方法，例如水浴烹饪-WB、短时欧姆烹饪-STOH和长时间欧姆烹饪-LTOH，对牛肉的颜色、烹饪损失、剪切值和蛋白质组变化的影响。蛋白质组学分析表明，欧姆烹饪的烹饪损失、剪切值显著低于水浴烹饪（P<0.05）。利用2-DE蛋白组学技术成功鉴定到STOH和WB烹饪样品之间的17个差异蛋白质，并鉴定出LTOH和WB样品之间的13个差异蛋白质。大多数差异蛋白是肌原纤维和肌浆蛋白，可能与肉质的变化相关。WB烹饪可改变蛋白质溶解度并降低2-DE图像中的蛋白质斑点强度。应用欧姆烹饪会产生更高质量的牛肉产品，并减少烹饪时间。相关成果2016年发表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。
问:基因组学、转录组学、蛋白质组学、结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学研究有哪些特点? 答:人类基因组计划完成后生物科学进入了人类后基因组时代,即大规模开展基因组生物学功能研究和应用研究的时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。以功能基因组学为代表的后基因组时代主要为利用基因组学提供的信息。 基因组研究应该包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段,以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段,是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能,它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。 功能基因组学(functional genomics又往往被称为后基因组学(postgenomics,它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。 基因的功能包括:生物学功能,如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰;细胞学功能,如参与细胞间和细胞内信号传递途径;发育上功能,如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交,差示筛选,cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等,但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生,包括基因表达的系统分析,cDNA微阵列,DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异,因此需要建立模式生物体。 功能基因组学
蛋白质组学与分析技术课复习思考 一、名词解释 1、蛋白质组学： 蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理： 根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩(减少体积) 和稳定样品(去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略 在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。5、离子交换色谱： 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱 吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增 PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR 的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA拆开；2）在较低的温度下使
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学复习资料 一、名词解释 1、蛋白质组学：蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 2、二维（双向）电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3、三步纯化策略： 第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第二步：中度纯化。去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换/疏水层析 第三步：精细纯化。达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物) 最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析 4、高效纯化策略：在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。 5、离子交换色谱：离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。 6、吸附色谱：吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。 7、PCR扩增：PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1）变性,在高温下把双链靶DNA 拆开； 2）在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3）在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 8、基因组文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。 广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列（遗传信息），这种基因文库常通过鸟枪法获得。 狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的结构、功能和筛选基因工程的目的基因。 9、cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA 文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。 10、基因芯片 基因芯片又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。 是一种将核酸分子杂交原理与微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。 11、基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。 12、同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50％时，结果比较可靠；30～50％之间，其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。 13、Gene：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 14.genome：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 15.Protein：生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 16.exon：外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。 17.蛋白质组学研究的两条途径：一条是类似基因组学的研究，即力图"查清"人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学研究；另一条途径，则是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱产生的任何有意义的因素，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。 18.组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组学) 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。 应该认识到，全基因组研究的发端和升温，是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的。而蛋白质组迄今还不具备相应的技术基础，且大规模的高通量DNA研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
定量蛋白质组（quantitative proteomics）是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重 要影响。例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。 发展至今，传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代；后者需要的样品量更少（25ug蛋白），灵敏度更高（ng级），通量也更高（一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白）。定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法，百泰派克均可为您提供服务。在这里我们给大家简要介绍一下这 三种定量蛋白质组学方法： iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由 美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。该技术采用多个 （2-10）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，能够同时比较多 达10种不同样本中蛋白质的相对含量，可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。 分析原理 iTRAQ/TMT标签包括三部分，如下图： 1. 报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平。 2. 平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的 同一肽段m/z相同。 3. 肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段。
一、名词： Gene 遗传学概念：基因是世代相传的，基因决定了遗传性状的表达，基因的颗粒性主要表现在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性，基因呈直线排列在染色体上。 分子生物学概念：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA（部分RNA病毒除外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。 genome 细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。 Protein 生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。 Proteome (1)由一个基因组所表达的全部相应的蛋白质。(2)在一定条件下，存在于一个体系（包括细胞、亚细胞器、体液等）中的所有蛋白质。 exon 外显子(expressed region)是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质 古细菌 定义1：常生活于热泉水、缺氧湖底、盐水湖等极端环境中的原核生物。具有一些独特的生化性质，如膜脂由醚键而不是酯键连接。在能量产生与新陈代谢方面与真细菌有许多相同之处，而复制、转录和翻译则更接近真核生物。古核生物与真核生物可能共有一个由真细菌的祖先歧化而来的共同祖先。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）定义2：现今最古老的生物群，为地球原始大气缺氧时代生存下来的活化石。为单细胞生物，无真正的核，染色体含有组蛋白，RNA聚合酶组成比细菌的复杂，翻译时以甲硫氨酸为蛋白质合成的起始氨基酸，细胞壁中无肽聚糖，不同于真细菌，核糖体蛋白与真核细胞的类似。许多种类生活在极端严酷的环境中。与真核生物、原核生物并列构成现今生物三大进化谱系。 多聚酶链式反应（PCR） 多聚酶链式反应（PCR）：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个含有20个碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5…端到3?端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。 基因芯片（DNA微阵列）