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流式细胞仪常用技术方法

流式细胞仪常用技术方法
流式细胞仪常用技术方法

细胞周期/DNA分析(PI法)

一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:

没有染色的细胞(制备过程如下,仅不加抗体)

三、实验步骤

1.取对数期生长细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,1000rpm,离心10min弃上清;

2.PBS洗2次,加0.5ml吹匀,务必吹散;

3.加入70%预冷乙醇中(标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精),固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性)封口膜封口,4℃固定1-2h或过夜(可长至一个月);

4.1000rpm×10min离心收集细胞,PBS洗两次;

5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打;

6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml,37℃水浴消化30min;

7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml,室温避光染色30min;

8.用300目滤网过滤,上机检测。

细胞周期/DNA分析

(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)

一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:

没有染色的细胞(制备过程如下1-6)

三、若做DNA倍体分析,需另设附加对照管

肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管,比例至少为2:1

四、实验步骤

1.将细胞消化后,用冷PBS洗细胞两次,300g×5min(若细胞数过少可提高转速到

500g),为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心;

2.弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团,加入1ml Buffer Solution并低速混

匀细胞。

3.室温离心,300g×5min;

4.重复2、3一次;

5.弃上清留大约50ul下面的液体,加入1ml Buffer Solution重悬细胞;

6.计数细胞,用Buffer Solution将细胞密度调为1×106个/ml;

7.染色:

A.取0.5ml含细胞5×105个;

B.每管加入250ul Solution A,用手轻拍混匀(勿用漩涡混匀);

C.室温反应10min,保留Solution A;

D.加入200ul Solution B,轻轻混匀;

E.室温反应10min,保留Solution A+B;

F.加入200ul冷Solution C,轻轻混匀,黑暗处2-8℃孵育10min;

用50um尼龙网过滤细胞,加入上样管上流式分析(3h内分析完)。

淋巴细胞亚群分析

一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:

没有染色的细胞(制备过程如下,仅不加抗体)

三、实验步骤

1.采集血液样品,取100ul抗凝全血加入每支试管中,注意不要碰到管壁。

2.轻轻混匀,依次加入20ul Isotype Control(如没有的话用没染色细胞代替),另外几管加入20μl荧光抗体。室温避光保存20分钟。

3.加入1×红细胞溶解液450μl,涡旋混匀避光保存10min,待管内液体透亮,300-500g离心5min,去上清

4.加PBS 2mlPBS涡旋混匀,300-500g离心5min,弃上清,然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网,4℃避光1h内上机检测;若不能及时上机,加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS,放4℃冰箱保存,48h内上机检测。

Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡

(BD公司Annexin-FITC/PI试剂盒)细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V 结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。

二、制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围(可选):

a) 没有染色的细胞;

b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞; (细胞先诱导凋亡:42℃水浴10min)

c) 仅用PI染色的细胞. (一半活细胞一半乙醇固定的细胞)

三、实验步骤

1.细胞收集:悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中,1000r/min离心8min,收集到1.5ml 离心管,用冷PBS洗细胞两次,,1000r/min离心8min,然后用1×bind buffer重悬细胞,配成样本细胞数为(1~5)×106个/mL。

2.用100ul细胞悬液(1×105个cell)到离心管中。

3.加入5ulAnnexin V-FITC和5ulPI,混匀细胞,室温下避光孵育15min。

4.加入400ul 1×bind buffer 每管,用流式细胞仪分析,一小时内完成。

结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+),也有认为是晚期凋亡细胞(认为左上象限为坏死细胞FITC-/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

Caspase-3-FITC 检测细胞凋亡

(BD公司FITC-CONJUGATED MONOCLONAL ACTIVE CASPASE-3 ANTIBODY APOPTOSIS KIT I)

一、鞘液准备(至少3L PBS,提前一天准备)

0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:

没有染色的细胞(制备过程如下,仅不加抗体)

三、实验步骤

1.将细胞消化后,用冷PBS洗细胞两次,1000rpm×8min(若细胞数过少可提高转速

到1500 rpm),用cytofix/cytoperm tm solution 重悬细胞,将细胞密度调整为1×106个/0.5ml;

2.冰上孵育细胞20min;

3.吹吸细胞,离心,弃上清,室温用Perm/wash TM buffer 冲洗两次;

4.计数总细胞数,按1×106个细胞加入100ul Perm/wash TM buffer和20ul抗体;

5.加入Perm/wash buffer和抗体后在室温孵育30min;

6.每个样本加入1.0ml Perm/wash buffer清洗,然后用0.5ml Perm/wash TM buffer (可减少

加入体积到0.2ml)重悬细胞;

7.用300目滤网过滤后,加入上样管上流式分析。

最详细地流式细胞仪实验方法

流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1.标本制备: 2.最小化非特异性结合: 二、凋亡 1.凋亡的检测方法:和其它 2.PI染色法 3.Annexin V 法 4.TUNNEL法 三、细胞因子 1.激活的细胞因子 2.CBA 四、血小板 1.活化 2.活化检测 3.网织血小板 五、红细胞 1.网织红细胞 2.PNH 3.胎儿红细胞 六、肿瘤学 1.DNA 细胞周期 2.蛋白 3.多药耐药 4.微小残留白血病

第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞/ml),在每一管中分别加入50μl的HAB,并充分混匀,于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后,用PBS(pH7.2—7.4)洗1-2次,加入缓冲液重悬,上机检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高,但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰,因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,再加入荧光标记的第二抗体,生成抗原—抗体—抗抗体复合物,以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低,二抗应用广泛,多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1.荧光标记的抗体的浓度应该合适,如果浓度过高,背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2.在使用第一抗体之前,将样品与过量的蛋白一起培育,如小牛血清蛋白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3.在使用第一抗体之后,将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面,但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合,或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4.使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2 存在的条件下,将新鲜组织或片段一般是不能利用或很难制作。因此,在NaN 3

一、流式细胞仪技术参数

一、流式细胞仪技术参数 1 工作条件: 1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ 1.2 环境温度:16-30℃ 1.3 湿度:20-80% 2 用途:免疫分析、淋巴细胞亚群分析;细胞周期分析、凋亡分析;感染分析、肿瘤细胞分析;多重细胞因子分析等。 3 技术规格和参数 3.1 激发系统: 3.1.1 激发光源:405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器,固定光路,空间立体激发。 3.1.2 激光塑形:自动的多棱镜塑形系统,光斑大小:9x65um椭圆形光斑 3.1.3 流动室规格:180x430μm 3.2 荧光收集和检测 3.2.1 光胶耦合物镜,数值孔径1.2,大面积收集发射荧光。 3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元,光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元,避免光谱交叉。 *3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统 3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统,荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片,信号能量损失最小。 3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号,保证弱信号灵敏度。 *3.2.6 共计12个信号检测器,包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。 3.2.7 荧光通道组合:405nm紫色激光器对应3个检测通道,滤光片包

括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm;488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm; 640nm 红色激光器对应3个检测通道,检测滤光片包括:670/30nm、712/21nm、780/60 nm。通道之间最低光谱交叉,滤光片带有智能芯片,直接插拔,自动识别。 *3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF,PE<50MESF(提供英文原版参数);CFDA检测结果FITC<5MESF,PE<5MESF(提供检测报告)。 *3.3 样本分析速率:>32,000个细胞/秒(提供英文原版参数)。 3.4 变异系数:全峰宽CV<3% *3.5 采用正压上样系统,非注射泵或蠕动泵。样本残留量<0.2%。 3.6 最小样本量:≤30ul 3.7 检测颗粒大小:0.5-50μm 3.8 数字信号处理:18bit动态范围,符合IEEE 32bit浮点分辨率。3.9 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分(面积)及脉冲宽度,可区分多倍体细胞、粘连细胞。 3.10 可溶性蛋白分析:具备多重可溶性蛋白分析功能,包括:细胞因子、炎症因子、趋化因子等;可达单管数十重分析,包括:多重定量及动力学分析。 *3.11 液流车:独立液流车,避免振动影响仪器主机光路和液流;自动控制所有压力、鞘液、清洗液等,大体积液体储备保证长时间、稳定工作;鞘液桶20L,废液桶10L,清洗液桶5L,关机液桶5L。开关机自动清洗液路,正常状态鞘液消耗<1.10 L/h,待机状态鞘液消耗<1 mL/h。 3.12 配置淋巴细胞亚群自动分析软件,无需手动设置,实现淋巴细胞亚群分型的全自动化。 3.13 主软件:Windows系统,原版专业化流式数据收集及处理软件, 可按用户需求设置条件进行数据分析和报告。 3.14 临床自动软件:标配临床自动软件,拥有具CFDA认证的4色及6

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究,而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养,因此在样本制备,上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇(用无菌蒸馏水配制) 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子,振摇鞘液筒,确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接,否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处,并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管(若不使用浓缩器)。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门(画一个空门使机器进行分选操作)。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉,点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满(每管注满需要9min ),点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次,共需要1h。 13、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水,振摇鞘液筒,倒掉液体,反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水,盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满(每管注满需要9min),点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次,共需要1h。 20、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管(最左)中收集15 mL PBS后取下,使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞,则应用无菌技术,用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管,将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞

流式细胞仪检测技术与质量控制

流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术(FCM)检测HLA等位基因是最近新建立的方法,与原有的分型技术相比,技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中,为保证检验结果的可靠性,提高准确度和室间结果的可比性,流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选,同传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术;检测技术;质量控制 流式细胞仪检验技术(FCM),即流式细胞术,是以流式细胞仪作为检测手段,以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体,在同一微孔内进行反应,利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性,磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时,经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠,目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者,对30例患者行流式细胞仪检测,30例受检者中,男性患者16例,女性患者14例,最大年龄60岁,最小年龄17岁,患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体,将已知序列特异性探针(SSO)固定在免疫磁珠上,每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同,在流式细胞仪红色激光束下可进行区分,根据事先设计的标记情况,通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类,从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增,将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针(SSO)在同一孔内进行特异性杂交,再加入荧光显色剂,然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号,红色激光束区分探针的种类,利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方,但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高,

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN ,过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序: 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印 机。 3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入 1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校 正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果,退出FACSComp程序。 备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件:CellQuest Pro 软件,选择“联机”。 1.

(2)对实验样本进行命名; (3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。 备注:如果界面被关闭,重新调出步骤: 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具(一般选择散点图),Inspect 界面会自动弹出,对几个常用选项进行设定:将散点图选中(用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形),将 更改横纵坐 备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC 。 (1一般获取10000个细胞。 (2 ( 3)将所有补偿调为0 (4)将非 52 (5)FSC和SSC (6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个 散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样(大约1×106 cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的Rnase(GenScript试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl的PI染液(GenScript试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells, 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞仪操作方法

—、样品制备 1、取样(大约lx cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1 ml 70%的冷乙醇固定细胞,-20°C冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100|j 啲Rnase (GenScript试剂A), 37°C水浴30min,然后再加入400』的PI染液(GenScript试剂B),在4°C避光条件下孵ff30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞 1」、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属扌当板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属扌当板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBYo如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀責于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowce呻的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流岀)。结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis, X参数和丫参数分别取FSC-H、SSC-H (选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H) Y Parameter Plot Source: |< Select File... X Parameter Mie:| Acquisition

流式细胞仪使用方法

流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称:流式细胞仪 生产厂家:美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法: 一.开机程序 1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。 2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。 4.如果需要打印,打开打印机电源。 5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。 7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。 二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。 3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。 三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。 4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周

流式细胞仪分析技术及应用题库1-2-10

流式细胞仪分析技术及应用题库1-2-10

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]关于液流系统的鞘液,下述哪项是不正确的(). A.鞘液是辅助样本作正常检测的基质液 B.鞘液是用来与样本作对比的 C.鞘液是包裹在样本流周围 D.使样本保持处于喷嘴中心位置,保证检测精确性 E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞 鞘液是辅助样本作正常检测的基质液,其主要作用是包裹在样本流周围,使样本保持处于喷嘴中心位置,保证检测精确,同时又防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞。

问题: [单选,A2型题,A1A2型题]分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关(). A.细胞含量 B.细胞性质 C.细胞大小 D.有否胞膜 E.单核或多核 分选速度与细胞悬液中分选细胞的细胞含量直接相关。一般分析速度为5000~10000;分选速度掌握在1000以下。

问题: [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分,进行定量分析和分选的检测技术,它可以高速分析上万个细胞,并能从一个细胞中测得多个参数,是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的主要组成不包括(). A.A.液流系统 B.光路系统 C.抗原抗体系统 D.信号测量 E.细胞分选 (天津11选5 https://www.doczj.com/doc/c615140686.html,)

问题: [单选,A4型题,A3A4型题]流式细胞术是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分,进行定量分析和分选的检测技术,它可以高速分析上万个细胞,并能从一个细胞中测得多个参数,是目前最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的技术特点不包括(). A.A.采用鞘流原理 B.以激光作激发光源 C.使用散射光检测 D.检测荧光信号 E.采用电阻抗及化学染色原理

流式细胞仪主要技术参数

流式细胞仪主要技术参数 1.光学系统: 1.1*激光配置:配置488nm和638nm两根全固态激光器,激光功率均大于等于 50mW以上; 1.2检测参数:可同时激发和检测6色荧光. 1.3光路设计:固定校准的光路设计,智能监控确保激光稳定工作。光学滤光 片可由用户根据实际应用自行更换,无需专业人员调校; 1.4采用专利的FAPD(Fiber Array Photo Detector)能够达到5倍于传统高 性能PMT的光电转换效率; 1.5检测器电压可以调节,以适应不同特性样品的检测,提高实验灵活性; 1.6光信号收集系统, 能将大视野范围内的光信号准确地传递到接收光路中, 最多可以支持到7个空间独立的激光同时激发的信号收集; 1.7*系统具备进一步升级的能力,最高可升级至3激光13色。 2.分析性能: 2.1*颗粒检测能力:可准确区分0.1um、0.2um和0.3um的细胞或微粒; 2.2*荧光灵敏度:FITC的荧光灵敏度少于30 MESF,PE的荧光灵敏度少于10 MESF; 2.3荧光分辨率:CV<3%(G0/G1期最高峰); 2.4无需微球的绝对计数功能,在检测的同时即可自动计算样本浓度,结果准 确。 3.电子系统: 3.1信号处理精度:24比特原始信息量; 3.2高达107的线性动态范围,可以将强信号和弱信号都完全显示在一张图上;3.3*支持多色荧光信号共同采集,信号获取速度(上样速度)达到30,000个/ 秒; 3.4荧光补偿:全矩阵荧光补偿,可脱机补偿,离线分析; 4.液路系统: 4.1半自动化上样系统,具有自动混匀和自动清洗功能,降低样本间交叉污染; 4.2液流系统日常维护简单、清洗简便,自带开关机程序;

流式细胞仪

1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术,用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 原理 一束单色光(通常是激光)照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点,其中一个和激光在同一直在线(称作前散射(FSC)),其它几个和激光垂直(旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器)。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射,同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录,根据各检测器亮度的波动(每个细胞会显出一个散射或荧光的峰)就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关,而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度(比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度)。 可以检测的参数有: 细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA(细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等)、RNA 染色体分析和分选(文库构建、染色体涂染)、蛋白质、细胞表面抗原(CD标记)、胞内抗原(各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等)、核抗原、酶活性、pH,胞内离子化的钙、镁,膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)(定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化)、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合(DNA/表面抗原等等) 流式细胞仪(flow cytometer) 流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计(FACS,Fluorescence Activated Cell Sorter)。现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒,并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。 流式细胞仪和显微镜比较像,但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分: * 细胞流动系统:液流(鞘液(sheath fluid))携带细胞,使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源:有通常的灯(汞或氙)、高功率水冷的激光源(氩、氪、染料激光)、低功率气冷激光(氩(488nm),红氦氖(633nm),绿氦氖,氦镉(紫外))、偶极激光(蓝、绿、红、紫)。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统:产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统,线性或对数放大。 * 计算机,用于分析信号。 早期的流式细胞仪主要是实验设备,但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同,主要的厂商和品牌如下: * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) 应用 流式细胞术在很多领域中都有应用,包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中,

自己总结:流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪(Flow Cytometry) 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1.1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪(flow cytonletry,FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量,且在统计学上有效。 1.2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年,Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来,随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作,以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的,所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说,这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后,用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2.1 流式细胞仪工作原理除电源外,流式细胞仪主要由四部分组成:流动室和液流系统:激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样(大约1×106cells ),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl 的Rnase(GenScript 试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl 的PI染液(GenScript 试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells , 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3 满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLo)w,拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput )、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur 开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDB。Y如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell 中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDB,Y 5 分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQues,t 最大化,选散点图标,打开,Plot type 选择Acq-analysis ,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H (选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type 选择Acq-analysis ,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实 验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

流式细胞仪主要技术参数

流式细胞仪主要技术参数: 1.光学系统: 1.1激光器配置:配置488nm ,638nm和405nm固体激光器,功率均≥50mw,激光功率可由 软件实时监控,空间独立排列 1.2▲检测通道设置:488nm激光可激发五色荧光,638nm激光可激发三色荧光, 405nm 激光可激发五色荧光,共13色荧光通道,以及前向角散射光检测通道(FSC)和侧向角散射光检测通道(SSC)。 1.3光路设计:固定校准的光路设计,每根激光间信号独立传播。用户可自行安装开机, 无需专业人员调校 1.4采用最新的的FAPD(Fiber Array Photo Detector)检测器,能够达到5倍于传统高 性能PMT的光电转换效率 2.分析性能: 2.1 ▲荧光灵敏度:FITC的荧光灵敏度≤30 MESF,PE的荧光灵敏度≤10 MESF 2.2 荧光分辨率:CV≤2%(G0/G1期最高峰) 3.电子系统: 3.1 信号处理精度:24比特(16,777,21道)数字信号精度 3.2 高达107的线性动态范围,可以将高信号和低信号都完全显示在一张图上 3.3 ▲支持多色荧光信号共同采集,15个参数检测时,信号获取速度(上样速度)达到30,000个/秒以上 4.液路系统: 4.1自动化上样系统,具有自动混匀和内外管壁自动清洗功能,降低样本间交叉污染 4.2可支持多种常用的进样管,如5 mL的聚苯乙烯和聚丙烯流式管,1.5 mL 和 2 mL EP管4.3内置自动化的液流系统维护程序,例如开关机程序、启动(初始化)、每日清洗、排气 泡、反冲等全部由自动软件控制。 5.软件功能: 5.1操作系统:Window 7或以上版本 5.2▲支持中英文操作界面,全部采用图形化参数调节 5.3全自动质控程序:内置的质控程序自动检测仪器配置,激光器功率、激光延迟、每个 通道的rCV值、增益值和平均荧光强度等

流式细胞仪试验方法2

第四部分流式细胞术分析血小板 流式细胞术分析血小板 血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术,它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法,丰富了血小板功能评估指标。 一、流式细胞仪血小板分析应用范围 1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成,分析血小板活化,血小板对刺激物的反应性。 2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测,分析血小板止血功能的 获得性和遗传性缺陷。 3. 结合血小板大小,检测血小板RNA含量,分析血小板成熟度,计数网织血小板。 4. 发现血小板抗体,做定性和定量分析。 二、血小板分析的临床意义 1. 血栓性疾病:活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性,非风湿 性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化,胰岛素依赖性糖尿病,子痫前期,外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板,而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。 2. 血小板缺陷性疾病:全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺 陷性疾病,如巨大血小板综合征,血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大,功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷,导致血小板聚集功能障碍 3. 贮存池疾病:原发性贮存池疾病(δ-SPD)常规用血小板聚集法检测,但特异性和灵敏度均不理想。 检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法,主观性大,操作繁琐,而且一次检测的血小板数目有限。 全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法,一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比,δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病,也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。 4. 血小板减少性疾病:破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体(PAIg)是反 映血小板的破坏的指标,虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法,但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg,只要测定104甚至103个血小板,在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平,因而用血量少,只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标,如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有

流式细胞仪操作流程

查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要包括以下几个方面: 1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液(配制方法见附录); l PI染液:将PI溶于PBS(pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min,弃去

FACSC精编ibur流式细胞仪操作维护规程

F A C S C精编i b u r流式 细胞仪操作维护规程 Document number:NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

FACSCalibur流式细胞仪操作维护规程 1.目的 规范流式细胞仪FACSCalibur操作维护规程,正确使用和维护仪器,保证检测工作顺利进行和设备安全。 2.适用范围 适用流式细胞仪FACSCalibur的使用操作。 3.职责 操作人员按照本规程操作仪器,对仪器进行正常维护,并作使用记录。 保管人负责监督仪器操作是否符合规程,并对仪器进行定期维护和保养。 仪器管理人以及科室负责人负责仪器综合管理。 4.操作程序 安全操作注意事项和特别提示: 4.1.1该仪器必须有专人保管,使用前需通读仪器说明书。 4.1.2严格遵守操作规程,如仪器出现故障,应马上停止使用,并立即向保管人、仪器管理人以及科室负责人报告,严格按照单位有关制度实施,不得擅自“修理”,查明原因,处理后仪器保管人应及时做好故障情况及维修记录。 设备每日开机程序: 设备质控程序:

4.3.1.1取试剂盒中的Unlabeled试剂,充分混匀,加一滴到装有1ml鞘液的试管中,混匀,标记为unlabeled。 4.3.1.2取FITC、PE、PerCP、Unlabeled试剂,充分混匀,各加一滴到第二支装有3ml鞘液的试管中,混匀,标记为mixed。 上机操作: 4.3.2.1按电脑桌面的FacsComp进入质控程序。 4.3.2.2在出现的“Signin”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息,计算机将保存这些信息;单击“Accept”。 4.3.2.3在试验选项中,选择Lyse/No-Wash(LNW):免洗程序。 4.3.2.4在CalibriteBeadsLotIDs中,根据每种颜色的beads所对应的LotIds,输入编号,此编号在Calibritebeads试剂盒内,打开新买的试剂盒,里面有一张橙色胶纸,取出贴在试剂盒的背面,标题是Calibritebeads3BatchNO,选择FACSFlowSheath下的编号(右侧的编号)。APCLotID(此栏不能空,即使是三色校正试剂)。 4.3.2.5在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径Facstation\BDfile\FACSComp\DDMMYY,还可以单击“Location”改变文件保存路径。 4.3.2.6按Run开始上样,在仪器面板上按RunHi。高速运行,速度不能低于400个细胞/秒,速度过低可在管中加一滴微球。

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