单克隆抗体的研究进展
摘要：抗体分子是生物及医学领域中使用最广泛的蛋白质分子。从19世纪末科学家们已开始抗体的实验研究，至今抗体的发展经历了从多克隆抗体到单克隆抗体，直至基因工程抗体，再到人源抗体的过程。单克隆抗体作为其中重要的一环，自问世以来，由于其特异性强、重复性好、操作简便易行，在疾病诊断、预防和治疗中，发挥着极其重要的作用，并显示出广阔的应用前景。本文对单克隆抗体的研究和应用发展情况做简要综述。
关键词：单克隆抗体，研究进展，单抗技术
1单克隆抗体的概述
随着细胞生物学和分子生物学的发展，单克隆抗体（monoclonal antibody , McAb）迅速广泛地应用于各个领域。抗体是由浆细胞分泌的,浆细胞又是由B淋巴细胞转化而来,每个B 淋巴细胞株制造它的专有抗体, 每株细胞系只能产生一种它专有的、针对一种它能识别的特异性抗原决定簇的抗体（图一）。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体(简称单抗)，又被称为肿瘤“生物导弹”。
2单克隆抗体的发展
19世纪末，白喉毒素的发现宣告第一代抗体诞生，随着现代免疫学、细胞生物学和分子生物学的不断发展，第二代抗体-单克隆抗体、第三代抗体－基因工程抗体分别于1975年和1984年问世。一个多世纪以来，抗体作为体内最奇妙的蛋白质分子，一直是生命科学，尤其是生物医学领域的研究热点，为人类多种疾病的预防、诊断和治疗做出了巨大贡献。
1975年英国剑桥的科学家Kohler和Milstein通过杂交瘤技术建立了单克隆抗体，这种抗体为鼠源单抗（图二）。单克隆抗体有特异性识别作用靶点（如肿瘤细胞、病原微生物）的能力，可用于疾病的诊断、预防和治疗，如在肿瘤的治疗上，单克隆抗体药物靶向性强，
对癌细胞的追踪能力高，只聚集在癌细胞周围，能阻断癌细胞的生长，并让癌变部位萎缩，从而达到低剂量、低毒副作用的有效治疗。它就像“生物导弹”一样，注入人体后，不断寻找受体，一旦发现了癌变细胞，就在周围凝聚，结合，阻断癌细胞生长。但最初的鼠源单抗由于人鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用时会成为外源性的蛋白抗原而引起人抗鼠抗体反应，这极大的限制了单克隆抗体在疾病治疗上的应用和发展。随着生物技术的发展，单克隆抗体经历了几个主要的发展阶段：鼠源单抗、鼠/人嵌合单抗、人源化单抗、人抗体和完全人源化单抗，鼠源性蛋白的成分从100％，下降为33％乃至0％。近年来发展起来的人源化单抗和完全人源化单抗含极少甚至不含鼠源成分，这种抗体不仅避免了人抗鼠抗体反应，而且特异性、亲和力不受影响，在疾病的治疗中将发挥巨大作用，拥有极其广阔的应用前景。
3单克隆抗体药物发展现状及发展趋势
随着单克隆抗体人源化程度的提高、负作用的减少和疗效的增强，单克隆抗体在疾病治疗方面的作用越来越受到人们的重视。目前单克隆抗体药物主要用来治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病，尤其是在癌症治疗方面的突出疗效，激发了各国科学家对单克隆抗体研究开发的兴趣，而其巨大的市场前景使得国际的大制药公司纷纷介入该领域。据美国制药工业协会的调查报告显示，单克隆抗体药物居所有医药生物技术产品之首。
3.1世界单克隆抗体药物的发展
单克隆抗体药物是生物制药产业中最大类别的产品，如今已被成功用于治疗肿瘤、癌症等多种疾病领域，单克隆抗体药物是继重组蛋白后，第二次引领生物医药产品浪潮的药品，具有广阔的发展前景。单克隆抗体药物发展经历了四个阶段：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源化单克隆抗体。而在全球的单克隆抗体市场，第四个阶段的全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。单克隆抗体是生物制药产业增长最快的领域之一，约占到全球生物制药市场的35%左右。截至2008年初，美国FDA共批准了24个抗体药物上市。全球有超过200家公司正在研发治疗用单克隆抗体药物．共有300多种产品正在研发中，其中100多个已进入临床研究。
3.2我国单克隆抗体药物的现状
由于我国此产业发展时间不长，因此同国外仍有较大差距。截止目前，美国已经批准23种治疗性单抗药物，而我国共批准了11个单
克隆抗体药物上市，其中5个是国外进口产品，6个是我国自主研发的，虽然都是在癌症等方面进行临床，但我国的单克隆抗体与国外仍有较大差距。我国抗体药物市场尚未形成，年销售额只有几千万元，在研发方面，多数创新不够，很多项目都处于实验阶段，距离产业化还有相当大的距离，而国外抗体的生产技术则早已成熟，除传统的“嵌合体法”和“人源化法”两大技术外，国外已开发出利用转基因动物与植物生产的人用单克隆抗体的新技术，我国在这方面只能望其项背。在抗体药物越来越受到重视的情况下，我国应加快脚步，打破技术瓶颈，以促进此产业健康稳定的发展。
4单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用涉及医学、农业、食品、环境等众多领域，其在基础研究、蛋白纯化、环境与食品监测、疾病诊断、预防及治疗和优生优育等方面均有不可替代的作用。
4.1单克隆抗体在预防方面的应用
生物免疫预防包括主动免疫和被动免疫，被动免疫指的是被感染后输入抗体，中和或清除病原体预防疾病的发生。主动免疫是指将病原体经过加工处理减毒或除去致病性，使其丧失致病性但保持其抗原性，接种后能引起机体的免疫反应，产生抗体，但不会引起机体的病变，例如，为了预防结核病而接种的卡介苗在体内生长繁殖，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力不论是主动免疫还是被动免疫均可以使用单抗。
4.2单克隆抗体在临床诊断及检测中的应用
业已证实，单抗在传染病、免疫性疾病、内分泌性疾病的诊断和早孕诊断方面，大大优于现有的抗血清，具有特异性强、灵敏度高和易标准化等优点，在临床诊断及检测中有广泛的应用。
4.3单抗在临床治疗方面的应用
目前用单克隆抗体对疾病进行治疗已取得了重大的突破, 可治疗的疾病包括肿瘤、免疫系统疾病及心血管疾病等。
单抗技术已深入到医学和生物学的各个领域，成为一种必不可少的工具，具有极为重要的理论研究价值和实用价值。目前，单抗技术已基本完善，大量的单抗已广泛应用到各个领域。单抗领域目前的研究重点是制备、应用新的单抗，扩大已有单抗的应用范围，特别是在临床治疗性单抗和导向药物方面尚有较大潜力
5展望
与化学药物相比，单克隆抗体药物开发有不少优越性。由于单克隆抗体药物市场增长迅速、研发成功率较高以及效果明确，因此已经成为生物医药的重要开发领域，而且吸引着越来越多的厂家加入该研究开发领域（图三）。
虽然单克隆抗体药物还存在巨大的发展空间，但其高昂的价格却在一定程度上限制了市场的大规模应用。按照分子量标准，抗体属超大分子物质，每个分子含有两套重链和轻链，并与糖分子重叠在一起，与小分子化合物相比，其结构相对复杂。因此，人源化单克隆抗体生产过程复杂，使得成本成为抗体药物生产的一个瓶颈问题，同时也成为决定抗体药物未来发展的一个关键问题，但我们相信通过技术的进步和研究的不断深入，不远的将来我们终将攻克这一难关。
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动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
动物细胞工程试题 1用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（C）A都须用液体培养基 B都需用培养箱 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性 解析：动物细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物，植物体细胞离体培养体现的是全能性。植物体细胞是固体培养基。动物体细胞培养需要二氧化碳培养箱。 动物细胞培养： 1、动物细胞的培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 2、动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。 3、动物细胞培养液的特点：液体培养基含动物血清。 4、动物细胞培养需要满足以下条件 (1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。 (2)适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。 (3)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (4)气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 5、动物细胞培养的过程： 取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 2下列关于细胞工程的叙述，错误的是（D） A. 电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D. 某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同 解析：A正确诱导原生质体融合的方法有物理法（离心振动电刺激）化学法（聚乙二醇PEG）生物方法（灭活的病毒）. B正确去除植物细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，将动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间。C正确小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合既可以无限增殖，又可产生特异性抗体。D错误，假设甲植物体细胞是2N,乙植物体细胞是2M，甲乙体细胞杂交染色体数目为2N+2M；而甲乙品种杂交染色体数目是N+M。 3制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（A） ①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植 A．①②B．①③C．②③D．③④ 解析：单克隆抗体的制备过程是人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，经过培养获得的杂交瘤细胞获得单克隆抗体。 4利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（D） A. 用纯化的核衣蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体 B. 体外培养单个浆细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
高三生物一轮复习导学提纲(38) 选修三：动物细胞工程 班级______ 学号_____ 姓名____________ 学习目标： 细胞融合与单克隆抗体（A ） 知识结构： 自主预习： 1.动物细胞融合和植物原生质体融合比较，特殊性表现在 ( ) A ．融合的原因 B ．融合的优点 C ．融合的诱导手段 D ．融合的过程 2.制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括 ( ) ①细胞培养 ②细胞融合 ③胚胎移植 ④细胞核移植 A ．①② B ．①③ C ．②③ D ．③④ 3.下列是应用动物细胞工程获取单克隆抗X 抗体的具体操作步骤，其中对单克隆抗体制备的相关叙述错误的是 ( ) ①从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞 ②将X 抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X 抗体的B 淋巴细胞 ③将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内培养 ④筛选出能产生抗X 抗体的杂交瘤细胞 ⑤利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞 ⑥从小鼠腹水中提取抗体 ⑦利用促细胞融合因子促使细胞融合 A ．实验顺序应该是①②⑦⑤④③⑥ B ．③过程产生多个杂交瘤细胞的过程称为克隆 C ．⑦过程获得的细胞均可无限增殖 D ．利用细胞融合生产单克隆抗体过程中通常要经过两次筛选 典型例题： 4.（06 广东)单克隆抗体技术在疾病诊断和治疗以及生命科学研究中具有广泛的应用。下列关于单克隆抗体的叙述，错误的是 A ．特异性强、灵敏度高 B ．与抗癌药物结合可制成“生物导弹” C ．体外培养B 淋巴细胞可大量分泌单克隆抗体 D ．由效应B 细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞分泌 5.利用细胞工程方法，以SARS 病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。相关叙述正确 A ．用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体 B ．体外培养单个效应B 细胞可以获得大量针对SARS 病毒的单克隆抗体 C ．将等量效应B 细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG 诱导融合后的细胞均为杂交瘤细胞 D ．利用该单克隆抗体与SARS 病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者 6.图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。 （1） 技术是单克隆抗体技术的基础。 选育出产生高特异性抗体的细胞 骨髓瘤细胞 HA T 某些淋巴细胞 （产生特异抗体） 混合并进行细胞融合，转到HA T 培养基上 培养 杂交瘤 杂交瘤
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
植物细胞工程与动物细胞工程的比较 莱阳市第九中学 生物组 范海霞 植物细胞工程的技术手段主要有植物组织培养和植物体细胞杂交，其中植物组织培养是植物细胞工程的基础；动物细胞工程的技术手段主要有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体的制备、胚胎移植和核移植，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。动、植物细胞工程的原理和技术手段有相似之点，但也存在不同之处，现对两者的主要技术手段加以分析比较： 一、植物细胞的组织培养与动物细胞培养 1．过程 ⑴植物组织培养 ⑵动物细胞培养 2．两者的比较 二、植物体细胞杂交与动物细胞融合（单克隆抗体制备） 1．过程 ⑴植物体细胞杂交： 细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞 …… 细胞株 细胞系 原代培养 传代培养 再分化 激素、光 离体的植物器官、组织或细胞 脱分化 营养物、激素 愈伤组织 根、芽 植物体 胚状体 人工种子 人造胚乳和种皮 发育
⑵动物细胞融合（单克隆抗体制备）：
三、胚胎移植与核移植 1．哺乳动物的胚胎移植：指在体外完成受精作用和早期的胚胎发育，然后将早期的胚胎转移到母体的子宫发育。试管动物是指的体外受精和早期胚胎发育生物。试管牛的培育过程如下图所示： 2．核移植：核移植是动物克隆技术的基础。鲤鲫移核鱼的培育过程如下图所示： 值得注意的是：克隆多莉羊是把来自高度分化的体细胞的核移植到去核的卵细胞中形成的重组细胞培育而来的； 【例释1】某同学在学习“细胞工程”时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容，你 A ．0 B ．1 C ．2 D ．3 解析：动物的组织块剪碎后只能用胰蛋白酶处理，而不能用胃蛋白酶处理；植物的原生质体的促融方法可用物理法或化学法，而不用生物法；植物组织培养的培养基中的糖用的是蔗糖，而不用葡萄糖。 答案：D 【例释2】如图是“白菜—甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是 A ．图示“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B ．愈伤组织的代谢是自养需氧型 C ．上述过程中包含着有丝分裂，细胞分化和减数分裂等过程 D ．“白菜—甘蓝”杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果 解析：白菜和甘蓝都是二倍体，它们的体细胞杂交后培育的“白菜—甘蓝”植株中有两个染色体组来自白菜，两个染色体组来自甘蓝，因此“白菜—甘蓝”属于异源四倍体，是可育的，能产籽；愈伤组织是一种高度液泡化的呈无定型状态的薄壁细胞，不能进行光合作用 动物→排卵→体外受精??→?培育胚胎??→?移植 母牛子宫→试管牛（激素处理） （激素处理） （兼有鲤鱼、鲫鱼特点，具有正常生殖能力） 重组细胞→鲤鲫移核鱼 ? ? ? 鲤鱼：囊胚细胞核 鲫鱼：去核未受精卵
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用
蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
动物细胞工程 【教学目标】 1．知识方面 （1）动物细胞培养。 （2）动物细胞融合。 （3）单克隆抗体的制备及应用。 2．态度观念方面 （1）初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。 （2）通过向学生介绍几大动物细胞工程技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展。认识到学无止境，形成终生学习的意识。 3．能力方面 （1）在学习动物细胞培养过程中，学生通过阅读、自学、质疑、讨论、训练、总结等环节，逐步提高独立获取知识的能力、逻辑思维能力、分析问题和解决问题的能力。 （2）由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。 （3）让学生尝试设计革克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。 【教学重难点】 单克隆抗体既是本小节的重点，也是难点内容。 【教学过程】 一、单倍体抗体的制备： 环节一：多数学生会提出如下思路：把产生相应抗体的B淋巴细胞提取出来，用我们所学的动物细胞培养技术经原代培养和传代培养（把单个B淋巴细胞克隆），将该细胞培养成细胞系，能无限传代，大量繁殖，便能从这些细胞中提取单抗了。 教师质疑：该方案可行性如何？（引导学生确认为什么单纯地进行B细胞培养行不通。）一些学生提出异议：一个B淋巴细胞不可能渡过原代培养和传代培养过程中的两次危机而达到细胞系水平。因为每经历一次危机，都有大部分细胞被淘汰，只有少部分生存下来，而单
个B淋巴细胞在这个过程中的命运便可想而知了。 抓住学生这一认识过程中的矛盾冲突，引领学生进人下一挑战性环节。 需解决的难题何在？（B细胞在体外不可能无限增殖） 如何使它无限增殖，方法有哪些？（B细胞与瘤细胞融合） 环节二： 学生思考： (l）单克隆抗体是用哪两种细胞来融合？为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？ （2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？ （3）整个制备过程为何要经过两次筛选？ （4）杂交瘤细胞在小鼠腹腔内培养与在体外培养有何区别？ （5）杂交瘤细胞在小鼠腹腔增殖，可否造成小鼠死亡吗？ （6）鼠单抗能用于人体疾病的治疗吗？ （板画诱导学生探究两次筛选的对象） 环节三： 假如现在要制备抗SARS病毒的抗体，用我身上的B细胞来融合行吗？为什么？（必须用对应的抗原刺激才会产生特异性的B细胞） 二、单倍体抗体的应用 制备到的抗体除了可以用于在临床治疗以外，还可以用来干什么？ 三、细胞核移植 阅读→归纳 【板书设计】 1．单倍体抗体的制备： 获得杂交瘤细胞 动物细胞培养 提取 2．单倍体抗体的应用：可用于疾病治疗、预防、单抗诊断疾病（“生物导弹”）等。
动物细胞工程制药研究现状和展望 摘要：当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面.本文综合论述了动物细胞工程制药的发展简史,研究近况和制造实例,并在此基础上探讨了动物细胞工程制药的未来发展趋势和前景. 关键词:动物细胞工程制药;细胞融合;细胞大规模培养;核移植 21世纪,生物技术制药是制药行业的亮点,近25年来,世界生物技术工业飞速发展,创造了35种重要的治疗性生物技术药物.中国生物技术产业是紧跟世界产业同步发展的.20XX年全球生物技术药物市场销售额已达到828亿美元.基因工程、细胞工程和酶工程组成三驾马车行驶在现代生物技术发展大道的前列.动物细胞工程在生物制药的研究和应用中起关键作用,目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%,例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等.所以对动物细胞工程制药的研究具有重要意义. 一、发展简史 开始 疫苗是动物细胞技术的开始,在疫苗产业早期,往往利用动物来生产疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗,用奶牛来生产天花疫苗,用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗.在1920年至1950年,已经开发了多种病毒或细菌疫苗,如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黄热病疫苗等.早在1950年代,已经能够利用动物细胞培养技术来生产病毒.先在反应器中大规模培养动物细胞,待细胞长到一定密度后,接种病毒,病毒利用培养的细胞进行复制,从而生产大量的病毒,这一突破是动物细胞技术或细胞工程的真正开始.基于动物细胞技术生产的病毒疫苗包括减毒的活病毒,或是灭活的病毒.在过去的30多年时间内,用动物细胞技术生产的疫苗挽救了几百万人和动物的生命.1950年至1985年期间,细胞工程及其他技术的进步,生产了多种人用疫苗来预防脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、乙肝和带状疱疹等,并用于生产多种兽用疫苗.但是,这段时期对细胞表达水平的研究仍然很低,因而用这种工艺生产蛋白制品产量低、成本高,因此早期的动物细胞技术只用于疫苗及少量的干扰素和尿激酶的生产. 发展
2．2动物细胞工程 2．2．1 动物细胞培养和核移植技术 【课标要求】 1．简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2．比较动物细胞培养与植物组织培养区别。 3．简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。 【本节重难点】 1．动物细胞培养的过程、条件。 2．用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 【学习过程】 一、动物细胞培养 1．动物细胞培养的概念： 从动物机体中取出相关的组织，将它，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞和。 2．动物细胞培养的过程
3．动物细胞培养的条件 ①无、无的环境 a．对和进行无菌处理； b．添加一定量的； c．定期。 ②营养 有等，另外还需要加入等一些天然成分。 ③和 哺乳动物多以℃为宜，多数细胞生存的最适pH为。 ④环境 细胞培养所需气体主要有和，是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的。 进行细胞培养时，通常采用或培养瓶，将其置于含加的混合气体的培养箱中进行培养。 4．动物细胞培养技术的应用 ①大规模生产有重要价值的； 如：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体。 ②为技术提供受体细胞； ③检测； ④用于生理、病理、药理等方面的。 如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1．动物核移植技术概念： 将动物一个细胞的，移入一个已经的细胞中，使其并发育成一个新的，这个新的胚胎最终发育成动物 （克隆动物）。 2．动物细胞核移植的原理： 动物细胞核的性。 3．动物细胞核移植的种类： ①细胞核移植（分化程度低，恢复其全能性相对容易） ②细胞核移植（分化程度高，恢复其全能性相对困难） 4．体细胞核移植的过程：
细胞工程第一讲 一、 概述 1、 细胞工程( cell engineering) 定义 应用现代细胞生物学、 发育生物学、 遗传学和分子生物学的原理方法与技术, 按照人们的需要, 在细胞水平上进行遗传操作, 包括细胞融合、 核质移植等方法, 快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、 细胞工程的研究内容 ( 1) 动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备, 日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、 疫苗、 生长因子等。 ( 2) 细胞融合 改良性状, 培育新品种 ( 3) 染色体工程 主要用于培育单倍体或多倍体新品种, 如四倍体小麦, 八倍体小黑麦 ( 4) 胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 ( 快速繁育和产物大量 制备) ( 改良性状, 培育新品 种) ( 培育新品种, 单倍体和多倍体) ( 获得人们需要的成体) ( 无性繁殖, 改变性状) 克隆 转基因技术
如: 胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 ( 5) 细胞遗传工程 克隆: 无性繁殖, 动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术: 将外源基因整合到生物体内, 能够表示并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 ( 1) 避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作, 只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 ( 2) 不但能够在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间, 甚至能够在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 ( 1) 萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试( 20世纪初-30年代中期) 德国植物生理学家Haberlandt在19 提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人, 19 , 以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程, 首创了体外组织培养法。 ( 2) 奠基阶段---离体培养技术的建立( 20世纪30年代中期-50年代中期) 1934年美国植物生理学家White经过培养番茄根, 建立活跃生长的无形繁殖系, 而且在28年间转接培养1600代仍能生长。并正式提出植物细胞全能性学说。 1940年, Earle建立无限传代的小鼠结缔组织L细胞系; 1954年, 美国微生物学家索尔克利用原代培养的猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗并进入工业化生产。 ( 3) 蓬勃发展阶段---各种新物种的出现( 20世纪50年代末-至今) 1958年, 利用胡萝卜髓细胞形成了体细胞胚, 并发育成完整植株。 1960年, 植物原生质体和体细胞杂交成功。在育种及次生代谢产物生产方面飞速发展, 1958年, 冈田善雄灭活的仙台病毒诱导肿瘤细胞融合, 开创了细胞融合的崭新领域。
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
动物细胞工程在生物领域中的发展 摘要：本文介绍有关生物工程的四大工程，即基因工程、细胞工程、蛋白质工程和发酵工程，的概念和发展。 关键词：基因工程细胞工程发酵工程蛋白质工程 2.1 细胞工程的概念 细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2.2.2 动物细胞工程 （1）常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等（动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础） （2）动物细胞培养 动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质的量是很少的，要借助于大规模的动物细胞培养获得大量的分泌蛋白。 （3）动物细胞培养技术的应用 生产许多有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 （4）动物细胞融合 动物细胞融合技术最重要的用途，是制备单克隆抗体。 （5）单克隆抗体 要想获得大量的单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体。 （6）单克隆抗体的应用 “生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，消灭了癌细胞不伤害健康细胞。 2.3 细胞工程的应用 细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。 2.3.3临床医学与药物 自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克星。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确，误诊率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的单克隆抗体，其灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍，能检测出抗血清的60％的假阴性。 近年来，应用单克隆抗体可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积，这为有效的治疗提供方便。单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗，主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病，尤其适用于抵抗力差的儿童。人们正在研究“生物导弹”——单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。 单克隆抗体可以精确地检测排卵期。新一代免疫避孕药也在研制之中，其基本原理是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。人类体外受精技术的日趋成熟，使人类对生育活动有了较大的选择余地，促进优生优育，提高人口素质，也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成